專利名稱：高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物分析方法，具體涉及一種利用反相離子對(duì)高效液相色譜分析骨肽、復(fù)方骨肽和全蝎提取物原料及制劑的方法。
背景技術(shù)：
骨肽的主要成分為從健康動(dòng)物四肢骨中提取的水溶性物質(zhì)，如多肽、蛋白肽、氨基酸、有機(jī)鈣、磷、無機(jī)鈣、無機(jī)鹽、微量元素等。全蝎提取物是從全蝎中提取的水溶性物質(zhì)，其主要成分類型同骨肽類似。復(fù)方骨肽是在骨肽的基礎(chǔ)上加入一定量的全蝎提取物得到的復(fù)方制劑?，F(xiàn)在市場(chǎng)上常見的有骨肽注射液(舊稱骨寧注射液)和復(fù)方骨肽注射液。骨肽注射液是由健康動(dòng)物四肢骨經(jīng)提取制成的滅菌水溶液。復(fù)方骨肽注射液由健康豬或胎牛四肢骨與全蝎經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，即復(fù)方骨肽注射液是在骨肽注射液的基礎(chǔ)上加入一定量的全蝎提取物制備而成。臨床上用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、骨折等疾病。經(jīng)臨床驗(yàn)證，復(fù)方骨肽的藥效作用遠(yuǎn)優(yōu)于骨肽。復(fù)方骨肽注射液現(xiàn)在所使用的檢定方法為用福林酚測(cè)定法，從回歸方程中求出多肽含量；按藥典中氮測(cè)定法，測(cè)定其總氮量(2000年版中國(guó)藥典)。由于骨提取物與全蝎提取物成分比較接近，以往的檢定方法無法區(qū)別骨肽和復(fù)方骨肽。
因骨提取物與全蝎提取物的主要成分均為多肽或蛋白肽，且兩種提取物的主要成分非常接近，一般的檢驗(yàn)方法無法將兩種提取物區(qū)分開來，故需要尋找一種靈敏度高、識(shí)別力強(qiáng)的分析方法對(duì)復(fù)方骨肽注射液中的骨肽成分和全蝎成分進(jìn)行有效區(qū)別，即定性分析，并能檢定出二者含量。高效液相色譜法具有靈敏度高、識(shí)別力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，對(duì)于物質(zhì)的定性定量分析都有較好的效果。有文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜分析檢定多肽、氨基酸類物質(zhì)(郭曉奎等神經(jīng)肽注射液氨基酸組成成分及含量測(cè)定方法的研究《生物技術(shù)》5[6]34-35，1995)。但是，由于多肽、蛋白肽、氨基酸類物質(zhì)無紫外吸收，使用常用的高效液相色譜法分析方法常常難以基線分離且保留時(shí)間短，因而對(duì)復(fù)方骨肽的分析仍然沒有理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服常用高效液相色譜法分析復(fù)方骨肽時(shí)遇到的保留時(shí)間短、難以分離，不易紫外檢測(cè)的困難，采用反相離子對(duì)高效液相色譜法對(duì)骨肽、復(fù)方骨肽及復(fù)方骨肽中的全蝎成分進(jìn)行定性及定量分析，對(duì)骨肽及復(fù)方骨肽原料及制劑質(zhì)量進(jìn)行有效監(jiān)控。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，反相離子對(duì)高效液相色譜分析復(fù)方骨肽藥品的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min(可根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220-310nm中的任一值，也可以根據(jù)具體實(shí)施情況選擇其他合理波長(zhǎng)；流動(dòng)相采用加入具有強(qiáng)紫外吸收性質(zhì)的離子對(duì)試劑的pH穩(wěn)定體系；該pH穩(wěn)定體系為醋酸-醋酸鹽緩沖體系或磷酸-磷酸鹽緩沖體系，也可以是其他適宜的緩沖溶液體系；所述的離子對(duì)試劑是具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物；在上述條件下，測(cè)定待測(cè)樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
以上方案中所述的具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物，可以選自芐基三甲基氯化銨、芐基三乙基氯化銨、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉、N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽中的一種或幾種。
所述的反相柱為C8柱、C18柱或苯基柱。
本發(fā)明采用反相離子對(duì)高效液相色譜以紫外吸收檢測(cè)樣品、延長(zhǎng)了樣品的保留時(shí)間，骨肽特征峰保留時(shí)間為4.6±0.2min；全蝎特征峰可以達(dá)到5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min，可以保證達(dá)到分析目的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，采用此方法得到了骨肽、復(fù)方骨肽及全蝎提取物的指紋圖譜?？梢院芎玫臋z測(cè)出復(fù)方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，使用方便，注射劑樣品可直接進(jìn)樣檢測(cè)，其他劑型樣品及原料樣品經(jīng)稀釋、過濾等簡(jiǎn)單處理后即可進(jìn)樣檢測(cè)，并能快速得到檢測(cè)結(jié)果，適合用于對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。


圖1為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對(duì)試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；色譜柱苯基柱。
圖2為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖1。
圖3為全蝎提取液C8柱高效液相色譜圖。
圖4為骨肽注射液C8柱高效液相色譜圖。
圖5為全蝎提取液C18高效液相色譜圖。
圖6為骨肽注射液C18高效液相色譜圖。
圖7為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對(duì)試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm；色譜柱苯基柱。
圖8為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對(duì)試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)252nm；色譜柱苯基柱。
圖9為全蝎提取液的高效液相色譜圖，離子對(duì)試劑為芐基三甲基氯化銨；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)275nm；色譜柱苯基柱。
圖10為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動(dòng)相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨10mmol/l；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)262nm。
圖11為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖10。
圖12為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動(dòng)相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨5mmol/l；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)262nm。
圖13為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖12。
圖14為骨肽注射液的高效液相色譜圖，色譜體系中所使用的流動(dòng)相為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨3mmol/l；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)262nm。
圖15為全蝎提取液的高效液相色譜圖，色譜條件同圖14。
圖16為全蝎提取物定量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖17為復(fù)方骨肽注射液的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1離子對(duì)試劑——芐基三甲基氯化銨的色譜考察色譜條件流動(dòng)相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液、骨肽注射液(由南京健利達(dá)科技開發(fā)有限公司提供，批號(hào)050603)。
反相柱為C8柱。
取適量全蝎提取液和骨肽注射液，用流動(dòng)相稀釋后，分別取20μl注入色譜儀，所得色譜圖參見圖1、圖2。
結(jié)論色譜條件下骨肽和全蝎得到了明顯區(qū)分，經(jīng)多次重復(fù)，確定骨肽特征峰保留時(shí)間TR＝4.6±0.2min；全蝎特征峰TR＝5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min。
實(shí)施例2幾種色譜柱的比較色譜條件色譜柱分別使用Lichrospher C8、Lichrospher C18、LichrospherPhenyl色譜柱，規(guī)格均為4.6mm×300mm，5μm；流動(dòng)相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液(批號(hào)050603)和骨肽注射液將兩種樣品分別用流動(dòng)相稀釋一定倍數(shù)后，各取20μl分別注入三種不同的色譜體系，所得色譜圖見附圖1，圖2，圖3，圖4，圖5，圖6。對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，見表1。
表1

結(jié)論各種反相柱均能夠分辨全蝎特征峰，但是優(yōu)選Phenyl柱。
實(shí)施例3考察不同比例有機(jī)溶劑的流動(dòng)相色譜條件流動(dòng)相C％(C＝10、5或0)甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；色譜柱LichrospherPhenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)262nm；柱溫室溫。
樣品全蝎提取液(批號(hào)050603)和骨肽注射液將樣品分別用流動(dòng)相稀釋后，取20μl注入到色譜儀中，比較所得色譜圖中兩種樣品的區(qū)別。分析結(jié)果見表2。
表2

實(shí)施例4紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的考察色譜條件色譜柱Lichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)；流動(dòng)相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.015mol/L)含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm、240nm、252nm、275nm；柱溫室溫；流速1ml/min。
樣品全蝎提取液(批號(hào)050603)取適量樣品用流動(dòng)相稀釋若干倍，注入20μl到色譜儀中，分別在上述波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，所得色譜圖參見圖1，圖7，圖8，圖9。由圖中可以觀察到，四個(gè)波長(zhǎng)下均檢測(cè)到保留時(shí)間約38min的全蝎特征峰，波長(zhǎng)為240nm時(shí)特征峰較為明顯。
實(shí)施例5離子對(duì)試劑濃度對(duì)檢測(cè)的影響色譜條件流動(dòng)相分別為2％甲醇的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH＝4.5)含芐基三甲基氯化銨3mmol/l、5mmol/l和10mmol/l；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)262nm；其余同實(shí)施例4樣品全蝎提取液(批號(hào)050603)和骨肽注射液取樣品適量，分別進(jìn)樣20μl于上述三種色譜體系中，所得色譜圖參見附圖10，圖11，圖12，圖13，圖14，圖15，對(duì)色譜圖進(jìn)行比較，以考察合適的離子對(duì)試劑濃度(見表3)。
表3

結(jié)論芐基三甲基氯化銨濃度為5mmol/l時(shí)，檢測(cè)靈敏度較好，較為合適。
實(shí)施例6流速的選擇流動(dòng)相為pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液含芐基三甲基氯化銨5mmol/L，色譜柱分別為L(zhǎng)ichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)和Lichrospher C18柱(4.6mm×300mm，5μm)時(shí)，調(diào)整流速使其分別為0.5、0.8、1.0、1.2ml/min，觀察壓力變化情況。見表4。
表4

實(shí)施例7方法學(xué)考察色譜條件色譜柱Lichrospher Phenyl色譜柱(4.6mm×300mm，5μm)；流動(dòng)相pH＝4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液含芐基三甲基氯化銨5mmol/L；流速1ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；柱溫室溫。
樣品生藥濃度為0.04g/ml的全蝎提取液(批號(hào)050603)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精密量取全蝎提取物溶液0.625，0.85，1.0，1.25，2.5ml分別置于10ml容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，即得到濃度為2.5、3.4、4.0、5.0、10mg/mL的全蝎提取物樣品。依次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20μL，每?jī)纱芜M(jìn)樣間隔60min，測(cè)量特征峰保留時(shí)間和峰面積，各濃度樣品分別測(cè)三次，取三次峰面積積分平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖16)，得回歸方程y＝2E+06x-326.75，r＝0.9984，線性范圍2.5-10mg/ml(生藥濃度)。
2、最低檢出限、定量限及精密度分別將樣品用流動(dòng)相稀釋不同倍數(shù)。在色譜條件穩(wěn)定的情況下分別進(jìn)樣20μL。分析所得色譜圖，發(fā)現(xiàn)樣品濃度為0.4mg/ml時(shí)，特征峰峰高為噪音的3倍左右，故認(rèn)為全蝎提取液最低檢測(cè)限是樣品濃度為0.4mg/ml(生藥濃度)；樣品濃度為1.5mg/ml時(shí)，特征峰峰高為噪音的10倍左右，故認(rèn)為全蝎提取液定量限是樣品濃度為1.5mg/ml(生藥濃度)；取12mg/ml、8mg/ml、3mg/ml(高、中、低)三種濃度的樣品，于不同的時(shí)間進(jìn)樣，計(jì)算日間精密度和日內(nèi)精密度日內(nèi)RSD分別為1.76％、2.08％、1.97％；日間RSD分別為1.85％、1.66％、2.21％。
實(shí)施例8全蝎提取液的含量測(cè)定色譜條件同實(shí)施例7；1、已知濃度的全蝎提取液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證濃度樣品全蝎提取液，濃度為0.08g/ml(生藥濃度)操作過程將樣品用流動(dòng)相稀釋10倍，進(jìn)樣三次，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行峰面積積分，三次平均峰面積x＝30874帶入實(shí)施例7中的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，最后折算出該樣品中全蝎提取物濃度為0.078g/ml。
2、未知濃度的全蝎提取液的含量測(cè)定樣品濃度未知的全蝎提取液(批號(hào)050601)操作過程將樣品用流動(dòng)相稀釋5倍，進(jìn)樣三次，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行峰面積積分，特征峰平均保留時(shí)間為37.62min，將三次平均峰面積帶入實(shí)施例7中的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，最后折算出該樣品中全蝎提取物濃度為0.028g/ml(生藥濃度)。
實(shí)施例9對(duì)復(fù)方骨肽注射液的質(zhì)量驗(yàn)證色譜條件同實(shí)施例7；樣品5批不同時(shí)間(2002-2005年)生產(chǎn)的復(fù)方骨肽注射液(由南京健利達(dá)科技開發(fā)有限公司提供)將樣品用流動(dòng)相稀釋后，各進(jìn)樣20μl，從得到的色譜圖中均可觀察到全蝎特征峰。其中一樣品所得色譜圖參見圖17。圖17中全蝎特征峰保留時(shí)間約39min。將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，折算后，得到該樣品中全蝎濃度為0.006g/ml(生藥濃度)。
實(shí)施例10，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三乙基氯化銨；反相柱為C18柱。
實(shí)施例11，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用對(duì)羥基苯甲酸；反相柱為苯基柱。
實(shí)施例12，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用鄰苯二甲酸氫鉀。
實(shí)施例13，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用苯甲酸鈉。
實(shí)施例14，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽。
實(shí)施例15，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三甲基氯化銨與對(duì)羥基苯甲酸、實(shí)施例16，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三甲基氯化銨與鄰苯二甲酸氫鉀。
實(shí)施例17，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三甲基氯化銨與苯甲酸鈉。
實(shí)施例18，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三甲基氯化銨與N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽。
實(shí)施例19，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三乙基氯化銨與對(duì)羥基苯甲酸。
實(shí)施例20，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用芐基三甲基氯化銨、鄰苯二甲酸氫鉀與苯甲酸鈉。
實(shí)施例21，與上述實(shí)施例基本相同，但具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物采用對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉與N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220-310nm中的任一值；流動(dòng)相采用加入具有強(qiáng)紫外吸收性質(zhì)的離子對(duì)試劑的pH穩(wěn)定體系；該pH穩(wěn)定體系為醋酸-醋酸鹽緩沖體系或磷酸-磷酸鹽緩沖體系；所述的離子對(duì)試劑是具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物；在上述條件下，測(cè)定待測(cè)樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
2.一種權(quán)利要求1中所述的高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，其特征在于，所述的具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物選自芐基三甲基氯化銨、芐基三乙基氯化銨、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸鈉、N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽中的一種或幾種。
3.一種權(quán)利要求1或2中所述的高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，其特征在于，所述的反相柱為C8柱、C18柱或苯基柱。
全文摘要
高效液相色譜分析復(fù)方骨肽的方法，色譜條件如下，色譜柱反相柱；柱溫室溫；流速1ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220－310nm中的任一值；流動(dòng)相采用加入具有強(qiáng)紫外吸收性質(zhì)的離子對(duì)試劑的pH穩(wěn)定體系醋酸－醋酸鹽或磷酸－磷酸鹽緩沖體系；離子對(duì)試劑是具有帶正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)和帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的化合物；在上述條件下測(cè)定待測(cè)樣品的液相色譜特征曲線；通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。本發(fā)明延長(zhǎng)了樣品的保留時(shí)間，可保證達(dá)到分析目的，得到了骨肽、復(fù)方骨肽及全蝎提取物的指紋圖譜?？蓹z測(cè)出復(fù)方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通過特征峰確定兩種組成物的含量，有效區(qū)分骨肽與復(fù)方骨肽。
文檔編號(hào)B01J20/281GK1908653SQ20061003780
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者任勇, 王曉潔, 馬學(xué)琴, 朱貫臣, 吉愛寧 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué), 南京健利達(dá)科技開發(fā)有限公司