專利名稱：氯法拉濱原料或其制劑的雜質(zhì)和含量的高效液相色譜法測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是采用高效液相色譜法對(duì)氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)和含量的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明中所述氯法拉濱的藥品名稱為通用名氯法拉濱其他名克羅拉濱英文名Clofarabine漢語(yǔ)拼音Lüfalabin中文化學(xué)名2-氯-9-(2-去氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃)-9H-嘌呤-6-胺英文化學(xué)名2-chloro-9-(2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-9H-purin-6-amine化學(xué)結(jié)構(gòu)式 分子式C10H11ClFN5O3分子量303.68氯法拉濱(clofarabine)屬于核苷酸類似物，由美國(guó)Genzyme公司研發(fā)，2004年12月28日批準(zhǔn)用于兒童頑固性或復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病的治療，其商品名為CLOLAR，本品已被FDA授予罕見(jiàn)藥物地位，用于治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL)。本品在2005年1月份已在美國(guó)首次上市。氯法拉濱作為目前唯一可以特異性用于兒童白血病的化療藥，治療白血病總體反應(yīng)率高，并且很好耐受，沒(méi)有不可預(yù)知的不良反應(yīng)。既可以靜脈給藥，也可以口服，本品為十多年來(lái)首個(gè)獲準(zhǔn)專門用于兒童的白血病治療新藥。
本品2005年在美國(guó)上市，為已在國(guó)外上市銷售但在國(guó)內(nèi)尚未上市銷售的產(chǎn)品，且至2006年8月未檢索到有在SFDA申請(qǐng)的廠家及機(jī)構(gòu)。
雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定是藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分，對(duì)一些特殊雜質(zhì)的控制，既能保證用藥的安全有效，又能考核藥物的生產(chǎn)工藝和貯存條件。
高效液相色譜法HPLC是近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)新技術(shù)，具有分離效果好，靈敏度高，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，且能與多種類型的檢測(cè)器聯(lián)合應(yīng)用，能滿足大多數(shù)化合物種類的檢測(cè)需要。
經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查詢，目前還沒(méi)有用高效液相色譜法檢測(cè)氯法拉濱原料或其制劑的雜質(zhì)和含量測(cè)定的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了加強(qiáng)氯法拉濱原料或其制劑的質(zhì)量控制，提供一種靈敏度高、分析速度快、準(zhǔn)確度高的氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)和含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法。
具體的技術(shù)解決方案如下。
1、氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸鹽溶液—甲醇和磷酸鹽溶液—乙腈體系；檢測(cè)波長(zhǎng)為210-214nm；理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
具體操作步驟如下A、取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.1～100mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含0.1～100ug的對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為磷酸鹽溶液—甲醇或乙腈的混合溶液體系；B、以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸鹽溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和甲醇或乙腈的混合溶液體系為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸鹽溶液和甲醇或乙腈的混合比為5-95∶95-5，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm-214nm，理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；C、取對(duì)照溶液5-50ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；
D、再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5-50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2-5倍；按自身對(duì)照法或峰面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)。
2、氯法拉濱原料或其制劑含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸鹽溶液-甲醇和磷酸鹽溶液-乙腈體系；檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm-265nm；理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
具體操作步驟如下A、取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.05～50mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸鹽溶液和甲醇或乙腈按5-95∶95-5混合的溶液；B、按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸鹽溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和甲醇為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸鹽溶液和甲醇的混合比為5-95∶95-5，檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm-265nm，理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；C、取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5-50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。


圖1氯法拉濱雜質(zhì)檢測(cè)對(duì)照溶液HPLC圖譜，圖2氯法拉濱雜質(zhì)檢測(cè)樣品溶液HPLC圖譜，圖3氯法拉濱含量測(cè)定樣品溶液HPLC圖譜。
本發(fā)明方法的建立過(guò)程是這樣的1、儀器與試劑儀器島津SPD-10Avp檢測(cè)器，島津LC-10ATvp泵及浙江大學(xué)N2000色譜工作站。
FA1104型電子天平
PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)色譜柱Discovery C18柱，規(guī)格250×4.6mm，粒度5um試劑甲醇為MR、乙腈為MR、磷酸二氫銨為AR試劑；蒸餾水自制。
2、雜質(zhì)檢測(cè)方法的建立(1)波長(zhǎng)的選擇取氯法拉濱樣品及各中間體適量，加流動(dòng)相使溶解，并稀釋成約10μg/ml，在200～400nm范圍內(nèi)對(duì)本品進(jìn)行掃描，由掃描結(jié)果可見(jiàn)，本品在212nm及263nm波長(zhǎng)處有最大吸收，結(jié)合中間體的掃描圖譜，我們選擇使用212nm波長(zhǎng)作為本品雜質(zhì)檢測(cè)的波長(zhǎng)。
(2)流動(dòng)相的選擇以甲醇-水為基本配比，調(diào)節(jié)甲醇與水的比例使得主峰保留時(shí)間適中，再通過(guò)加入適當(dāng)?shù)木彌_鹽調(diào)節(jié)峰形，使得到理想狀態(tài)。
流動(dòng)相的選擇

由上表結(jié)果可見(jiàn)，以各pH值的磷酸二氫銨溶液和甲醇(70∶30)作為流動(dòng)相，考察譜峰的分離情況。在流動(dòng)相組分為0.01mol/L磷酸二氫銨(pH3.0)-甲醇(70∶30)時(shí)，主峰保留時(shí)間適宜，峰形好。故選擇0.01mol/L磷酸二氫銨(pH3.0)-甲醇(70∶30)作為本品雜質(zhì)檢測(cè)的流動(dòng)相。
(3)分離度試驗(yàn)取氯法拉濱合成過(guò)程中的中間體以及異構(gòu)體α、β(即氯法拉濱樣品)，加流動(dòng)相溶解并稀釋，制成一定濃度的溶液，作為樣品溶液。分別取上述溶液適量混合，搖勻后取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其分離度。結(jié)果中間體及異構(gòu)體α、β(氯法拉濱)的分離度符合要求。
(4)系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗(yàn)①破壞性試驗(yàn)分別稱取氯法拉濱樣品約10mg或其制劑適量(約含氯法拉濱10mg)，分別置100ml量瓶中，按下述各條件配制供試品。
未破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，常溫避光放置4小時(shí)備用；酸破壞加0.1mol/L的鹽酸溶液2ml，混勻后常溫避光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液2ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用；堿破壞加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液2ml，混勻后常溫避光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加0.1mol/L的鹽酸溶液2ml中和，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用；光照破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，置強(qiáng)光下(4500Lx)照射4小時(shí)，備用；高溫破壞加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，置沸水浴中加熱4小時(shí)，4小時(shí)后放冷，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，備用；氧化破壞加30％雙氧水2ml，混勻后常溫遮光放置4小時(shí)，4小時(shí)后加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。
分別取上述溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，與未破壞樣品比較，結(jié)果在破壞條件下氯法拉濱峰和各雜質(zhì)峰能夠很好的分離，說(shuō)明在選定色譜條件下可以檢測(cè)出可能存在的雜質(zhì)。
②檢測(cè)限、定量限的測(cè)定取對(duì)照品適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，按10∶1信噪比作為定量限，結(jié)果為10ng；按3∶1信噪比為檢測(cè)限，結(jié)果為3ng。
3、含量測(cè)定方法的建立(1)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取對(duì)照品約25mg置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、3、5、7、10ml置50ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(W)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。
結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.197～1.974μg范圍內(nèi)，氯法拉濱色譜峰面積與其進(jìn)樣量成良好線性關(guān)系。
氯法拉濱含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線


(2)進(jìn)樣精密度取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下中間濃度(5ml)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，考察進(jìn)樣精密度。
氯法拉濱進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

由結(jié)果可見(jiàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，表明進(jìn)樣精密度良好。
(3)理論板數(shù)的測(cè)定取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下中間濃度(5ml)溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其理論板數(shù)，經(jīng)測(cè)定，理論板數(shù)為n＝7775.606。
(4)重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取氯法拉濱樣品約25mg或其制劑適量(約含氯法拉濱25mg)各六份，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定上述樣品的含量，分別計(jì)算RSD值，考察重復(fù)性。
結(jié)果表明，原料和制劑重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于2.0％，重復(fù)性符合規(guī)定。
(5)中間精密度試驗(yàn)按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，在不同日期內(nèi)，不同的試驗(yàn)人員，使用相同一批的氯法拉濱樣品或其制劑，在不同的儀器上測(cè)定其含量，分別計(jì)算RSD值，考察其中間精密度情況。
結(jié)果表明，原料和制劑中間精密度試驗(yàn)RSD均小于2.0％，中間精密度良好。
(6)制劑回收率試驗(yàn)稱取氯法拉濱原料，按處方量的80％、100％、120％投料，制備含主藥為80％、100％、120％的制劑，分別取各處方項(xiàng)下制劑，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)定主藥氯法拉濱的含量。
結(jié)果表明，回收率為99.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，制劑準(zhǔn)確性試驗(yàn)良好。
通過(guò)上述方法的建立過(guò)程，本品的有關(guān)物質(zhì)檢查采用HPLC法，通過(guò)中間體測(cè)定及破壞性試驗(yàn)，結(jié)果表明本品的中間體及破壞后的降解產(chǎn)物峰可被檢出，并與主峰有較好的分離度。根據(jù)本品檢查結(jié)果，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況，確定本品有關(guān)物質(zhì)總量應(yīng)小于1.0％，單個(gè)雜質(zhì)量應(yīng)小于0.5％。另外通過(guò)高效液相色譜法對(duì)本品含量測(cè)定結(jié)果表明，回收率為99.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％，證明本法可作為本品含量測(cè)定方法。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
按以下檢測(cè)方法對(duì)氯法拉濱原料或其制劑各三批進(jìn)行了雜質(zhì)的檢測(cè)實(shí)施例1取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.1mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含0.1ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄V D)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液50ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍；供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積總和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1、圖2。
表1氯法拉濱原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例2取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含10ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶40的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)212nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍；供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表2，圖1、圖2。
表2氯法拉濱原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例3取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含100mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含100ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按90∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)-甲醇按70∶30為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液5ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的5倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表3，圖1、圖2。
表3氯法拉濱原料或其制劑雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例4取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.1mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含0.1ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液(以磷酸調(diào)pH至3.0)和乙腈按85∶15的混合溶液。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液50ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍；供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積總和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1、圖2。
實(shí)施例5取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含10ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按60∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按60∶10的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)212nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍；供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表2，圖1、圖2。
實(shí)施例6取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相制成每1ml中含100mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含100ug的對(duì)照溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按90∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按90∶40的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取對(duì)照溶液5ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的5倍；供試品如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積之和。各雜質(zhì)峰面積之和不大于對(duì)照溶液主峰面積，單個(gè)最大雜質(zhì)及氯法拉濱旋光異構(gòu)體(α體)峰面積均小于對(duì)照溶液主峰面積的二分之一。結(jié)果見(jiàn)表3，圖1、圖2。
按以下檢測(cè)方法對(duì)氯法拉濱原料或其制劑各三批進(jìn)行含量測(cè)定實(shí)施例7取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)261nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表4，圖3。
表4氯法拉濱原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例8取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按60∶10的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5氯法拉濱原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例9取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含50mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按90∶430的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表6，圖3。
表6氯法拉濱原料或其制劑含量檢測(cè)結(jié)果


實(shí)施例10取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含0.05mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)261nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表4，圖3。
實(shí)施例11取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含10mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按60∶10的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按60∶10的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)263nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各20ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表5，圖3。
實(shí)施例12取氯法拉濱原料或其制劑以及原料經(jīng)精制而得的對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含50mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照品溶液；流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按90∶40的混合溶液，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0。
按照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005年版II部附錄VD)試驗(yàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒度5um；以0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按90∶40的混合溶液為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸二氫銨溶液以磷酸調(diào)pH至3.0，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm，理論板數(shù)以氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。
取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各5ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算本品的含量。結(jié)果見(jiàn)表6，圖3。
上述方法方便快捷，能夠準(zhǔn)確測(cè)定氯法拉濱原料或其制劑的雜質(zhì)和含量。但本發(fā)明專利的保護(hù)內(nèi)容并不僅僅局限于上述具體實(shí)施實(shí)例中所闡述的方法，任何在本發(fā)明所述方法的基礎(chǔ)上所做的改進(jìn)及提高均屬于本發(fā)明專利的保護(hù)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于其檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為210-214nm；理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；具體操作步驟如下A、取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.1～100mg氯法拉濱的供試品溶液和每1ml中含0.1～100ug的對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈的混合溶液；B、以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸鹽溶液和甲醇或乙腈的混合溶液體系為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈的混合比為60-90∶40-10，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm-214nm，理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；C、取對(duì)照溶液5-50ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度，使主成分的峰高約為記錄儀滿量程的10～25％；D、再取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5-50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2-5倍；按自身對(duì)照法或峰面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)。
2.氯法拉濱原料或其制劑含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，包括配制供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于其檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm-265nm；理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；氯法拉濱峰與各雜質(zhì)峰的分離度大于1.5；具體操作步驟如下A、取氯法拉濱原料或其制劑，加流動(dòng)相分別制成每1ml中含0.05～50mg氯法拉濱的供試品溶液和對(duì)照溶液；所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈按5-95∶95-5混合的溶液；B、按照高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L磷酸鹽溶液和甲醇為流動(dòng)相，0.01mol/L磷酸鹽溶液-甲醇或磷酸鹽溶液-乙腈的混合比為60-90∶40-10，檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm-265nm，理論板數(shù)按氯法拉濱峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；C、取上述供試品溶液和對(duì)照溶液各5-50ul分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯法拉濱原料或其制劑中雜質(zhì)的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氯法拉濱原料或其制劑含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和甲醇按70∶30混合的溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氯法拉濱原料或其制劑含量的高效液相色譜法檢測(cè)方法，其特征在于所述流動(dòng)相為0.01mol/L磷酸二氫銨溶液和乙腈按85∶15混合的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種氯法拉濱原料或其制劑的雜質(zhì)和含量的高效液相色譜法測(cè)定方法。該方法的色譜條件中固定相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用磷酸二氫銨溶液－甲醇或磷酸二氫銨溶液－乙腈體系；采用紫外檢測(cè)器，雜質(zhì)測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為210－214nm；含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm－265nm；該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能很好地檢測(cè)氯法拉濱原料或其制劑的雜質(zhì)和含量。為生產(chǎn)進(jìn)程中的質(zhì)量控制分析提供了簡(jiǎn)單可靠的方法。
文檔編號(hào)B01J20/281GK1920550SQ20061004148
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者郭輝, 石慶平, 崔愛(ài)軍 申請(qǐng)人:郭輝