專利名稱：：因子Ⅷ和馮威勒布蘭特因子的親和吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化合物和它們用作親和配體的用途。
背景技術(shù)：
：因子VIII(之前稱為抗血友病因子)是在循環(huán)血漿中發(fā)現(xiàn)的~200ng/mL水平的糖蛋白。天然存在的成熟單鏈蛋白由于糖基化而具有265270kDa的不同分子量，但是由于在體內(nèi)的等位變異、糖基化、誘發(fā)變異和片段化而在血漿中觀察到170-280kDa較寬范圍分子量的蛋白。許多重組因子VIII產(chǎn)物是可以得到的，并且在蛋白結(jié)構(gòu)和分子量上變化很大。血漿因子VIII具有額外的復(fù)雜因子，其以與馮威勒布蘭特因子(vWF)緊密結(jié)合的形式存在，復(fù)雜的多聚蛋白也涉及凝塊。vWF本身，單獨(dú)地或與因子VIII結(jié)合，具有治療應(yīng)用。在vWF/FVIII轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的過程中，因子VIII促進(jìn)了復(fù)雜凝塊級(jí)聯(lián)達(dá)到頂點(diǎn)，并形成纖維蛋白凝塊。因子VIII產(chǎn)生過程中的遺傳異常導(dǎo)致A型血友病，主要表現(xiàn)為由于凝塊形成的減少或缺乏而導(dǎo)致的重復(fù)性出血事件。A型血友病及其癥狀(比如不可控的出血)可以用從血漿得到的或重組的因子VIII處理。使用適當(dāng)?shù)慕o藥法，預(yù)防性地應(yīng)用因子VIII可以顯著地降低出血事件的次數(shù)和嚴(yán)重程度，包括在外科手術(shù)過程中觀察到的那些。從血漿中純化因子VIII/vWF或從重組源中純化因子VIII是復(fù)雜的過程，通常包括許多色譜和/或沉淀和/或病毒滅活步驟。從血漿中純化通常還包括初始的冷凍沉淀和重組步驟。這些復(fù)雜的純化步驟和內(nèi)在的蛋白不穩(wěn)定性結(jié)合，導(dǎo)致不良的純化產(chǎn)物收率。已經(jīng)描述了免疫親和色譜，但是除了其本身的昂貴性以外，所用的色譜材料也缺乏穩(wěn)定性和可清潔性，導(dǎo)致重復(fù)利用非常受限。基于肽配體的介質(zhì)作為免疫親和介質(zhì)具有類似的問題，沒有被廣泛接受。獲得能夠從許多源以迄今不可能的產(chǎn)率、純度和成本有效性分離因子VIII或因子Vlll/馮威勒布蘭特因子的色鐠材料將是所希望的。WO97/10887公開了用作親和吸附劑的式I的基于三,的化合物:其中&是H、烷基、羥烷基、環(huán)己基、NH2、苯基、萘基、1-苯基吡唑、丐l唑、苯并噢唑、苯并D惡唑或苯并咪唑，任意的這些芳基可以被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺?；?、氨基曱?；?、M磺?；⑼榛酋；望u素中的一個(gè)或多個(gè)取代；一個(gè)X是N，另一個(gè)是N、C-C1或C畫CN;Y是O、S或NR2;Z是O、S或NR"R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、苯甲基或p-苯乙基；Q是苯、萘、苯并逸唑、苯并P惡唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰氨基、C02H、磺酸、氨基甲?；?、氨基磺酰基、烷基磺?；螓u素；!i是0-6^p是0-20;和A是載體基體，任選地通過間隔基連接到三嗪環(huán)。式I的化合物公開為對(duì)于蛋白比如免疫球蛋白、胰島素、因子VII或人生長(zhǎng)激素具有親和性。相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物公開在WO00/67卯0和WO03/097112中。它們對(duì)于內(nèi)毒素具有親和性。
發(fā)明內(nèi)容意外地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些化合物可用于vWF/FVIII基于親和性的分離，這些化合物中有許多是新的。這些化合物具有式II:A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中X、Y、Z、n和A如上式I定義的；R7是在中性pH下帶有正電荷的基團(tuán)；W是任選的連接基；V是如上對(duì)于Q所述的，但是作為替代方案可以為節(jié)結(jié)構(gòu)；和Rs和R9為如對(duì)于R4、Rs和R6定義的，但還包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)，或R8和R9連接以形成這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明的化合物包括相應(yīng)的配體，其中A被官能團(tuán)代替，直接地或間接地連接到三嚷環(huán)，其可以固定在載體基體上。下文中，術(shù)語"配體"和"吸附劑"可互換地使用。具體實(shí)施例方式WO97/10887、WO00/67900和WO03/0971127〉開了如何可以在固體載體上建立配體的組合庫。它們的公開內(nèi)容，包括實(shí)施方案的實(shí)施例和與本發(fā)明相同的步驟，通過參考引入本發(fā)明中。在用作為原料的人血漿池篩選這些組合庫組期間，許多配體確定為能夠選擇性地結(jié)合和洗脫人vWF/FVin?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備用于本發(fā)明的式II的化合物。這種方法記載于上述3個(gè)PCT公開中；它們可以容易地適用于新化合物的制備。WO97/10887給出了A的實(shí)例，包括間隔基或連接基L,通過其三喚環(huán)可連接到固體載體M。如WO97/10887所述，這種載體包括瓊脂糖，瓊脂糖凝膠，二氧化硅，纖維素，右旋糖酐，淀粉，藻酸鹽，角叉菜聚糖，合成聚合物，玻璃和金屬氧化物。在反應(yīng)以形成本發(fā)明的吸附劑以前可以活化這種材料。L例如可以為-T+V1-V2)m-，其中T是O、S或-NR、；m是0或1jV1是任選地取代的2~20個(gè)C原子的烴基；和V2是O、S、-COO畫、誦CONH國(guó)、國(guó)NHCO-、-P03H-、-NH-亞芳基SO;rCH2-CH2-或-NR8國(guó)；和R7和R8各自獨(dú)立地為H或d-6烷基。在本發(fā)明的化合物中，R7優(yōu)選是式NRk)Ru的仲胺或例如更優(yōu)選的叔胺，其中R^和Ru各自獨(dú)立地為d-6烷基(比如乙基)，或NRgR9形成環(huán)，或R^和Rn之——起形成環(huán)，或與連接基W中的原子一起形成環(huán)。連接基W可以為烷基、芳基或芳烷基連接基，例如具有2~7,優(yōu)選34個(gè)鏈原子，其本身可被取代，例如被OH基團(tuán)取代。另一個(gè)"臂"即z-B-D的性質(zhì)可以是較不關(guān)鍵的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過結(jié)構(gòu)III表示結(jié)合vWF/FVin的吸附劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>III在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合vWF/FVIII的吸附劑由結(jié)構(gòu)IV表示(在生理pH時(shí)質(zhì)子化)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>iv在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中，通過如下所示的結(jié)構(gòu)V表示結(jié)合vWF/FVIII的吸附劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本發(fā)明中記載的結(jié)合vWF/FVIII的配體和吸附劑可用于從復(fù)雜混合物純化vWF/FVIII，所述復(fù)雜混合物包括但不限于人血漿和重組發(fā)酵上清液。這些應(yīng)用在以下實(shí)施例4中說明，使用人血漿池進(jìn)行色鐠實(shí)驗(yàn)。術(shù)語"vWF/FVIII"在本發(fā)明中是指vWF/FVIU本身以及具有vWF/FVIII功能特點(diǎn)的類似物，例如，就對(duì)于本發(fā)明中記載的給定化合物的親和性而言。因此，所述分析物可以是作為vWF/FVIII功能片段的蛋白，或具有所有相同結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)、多個(gè)的結(jié)構(gòu)類似物，或融合蛋白。以下實(shí)施例說明本發(fā)明。二氯三嗪基-(R)-1-(3-甲氧基苯基)-乙胺的合成將溶于丙酮(35mL)中的氰尿酰氯(5.0g)冷卻到0'C，之后在冷卻下用30分鐘逐滴加入溶于丙酮(50ml)中的(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺(4.1g)，以確保溫度不超過5。C。然后慢慢地加入10M氫氧化鈉(2.71mL)。45分鐘之后，在攪拌下將反應(yīng)混合物加入到冰水(20g)中。將油狀產(chǎn)物萃取到二氯曱烷(150mL)中，用無7K硫酸鎂干燥，蒸發(fā)得到黃色油狀產(chǎn)物(7.96g)。實(shí)施例1吸附劑V的合成向氨基-SepharoseCL-4B(475g重，沉降在水中-16nmol/g取代)中加入二甲基甲酰胺(DMF)(475mL)。加入二異丙基乙胺(4.37mL),攪拌混合物15分鐘，之后將溶于DMF(250mL)中的二氯三嚷基-(R)-l-(3-曱氧基苯基)-乙胺(7.57g)加入到反應(yīng)混合物中。攪拌該混合物3小時(shí)，之后用70。/。含水DMF(4x500mL)、50%含水DMF(2x500mL)和水(llx500mL)洗所述凝膠。在60'C將150g(沉降的)該材料在水(75mL)中漿化，并分批加到N,N-二乙基-1，3-丙二胺(3.8mL)在7JC(75mL)中的溶液中。加入之后，再次溫?zé)崴龌旌衔锏?0。C，并在該溫度下攪拌19小時(shí)。然后濾出凝膠并用水(12x150mL)洗，之后存儲(chǔ)在20%含水乙醇防腐劑中。實(shí)施例2吸附劑III的合成在60'C在水(75mL)中漿化來自實(shí)施例2的中間凝膠產(chǎn)物(150g沉降的)，并分批加入到2-(2-氨乙基)-1-曱基吡咯烷(3.5mL)在水(75mL)中的溶液中。加入之后，再次溫?zé)崴龌旌衔锏?0'C，并在該溫度下攪拌19小時(shí)。然后濾出凝膠并用水(12x150mL)洗，之后存儲(chǔ)在20%含水乙醇防腐劑中。實(shí)施例3吸附劑IV的合成將氨基-SepharoseCL-4B(100g重，沉降在水中-16^111101/§取代)懸浮在1MpH7.0的磷酸鉀(100mL)中，然后排水。然后向該凝膠中加入1MpH7.0的磷酸鉀(25mL)和RO水(250mL)。劇烈攪拌所述漿，同時(shí)加入丙酮(50mL)。在冰/鹽浴中冷卻30分鐘之后，一次性加入在冷丙酮(25mL)中的氰尿酰氯(2.5g)。在(TC攪拌該混合物1小時(shí)，然后用50%含7^丙酮(5x100mL)、RO7JC(5xl00mL)、50。/o含水丙酮(5x100mL)和RO水(10xl00mL)洗。然后在室溫下，用含有2-氨基丁醇(lg)的50"/o含水DMF(100mL)漿化該沉降的凝膠4小時(shí)。過濾漿，然后用50%含水DMF(5x100mL)和RO7jC(10x100mL)洗。然后用含有4-氨基-a-二乙基氨基-o-甲酚二鹽酸鹽(4.2g)的50%含水DMF(100mL)漿化所述沉降的凝膠，并用氫氧化鈉(IOM)調(diào)節(jié)至pH9,并;60。C攪拌過夜。過濾漿，然后用50%含7&DMF(5x100mL)和RO7jC(i0x100mL)洗。將該凝膠在40'C在最終濃度0.5M的NaOH/25。/。乙醇中培養(yǎng)3天，然后用0.5MNaOH/25。/o乙醇(5xl00mL)洗，然后用RO水(10x100mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入1.0MNaOH(100mL)，并在40'C培養(yǎng)所述混合物3天。然后用0.5MNaOH(5xl00mL)洗所述凝膠，然后用RO水(10xl00mL)洗。所述凝膠用pH7.0的0.1MPBS(3xl00mL)洗后，再次用RO水(10xl00mL)洗，之后在冷室中在4。C在20%v/v含水乙醇中存儲(chǔ)。實(shí)施例4用吸附劑V對(duì)人血漿進(jìn)行色鐠分析的實(shí)施例使用低壓色鐠系統(tǒng)(Kipp&Zonen平床圖表記錄器，Gilsonminipuls3蠕動(dòng)泵和GilsonUV檢測(cè)器)，使用20mL柱容積的1.6cmi徑XK16/20柱進(jìn)行色鐠實(shí)驗(yàn)。用5柱容積的20mMTris.HCI、20mM檸檬酸鈉、140mM氯化鈉pH7.5，以80cm/小時(shí)平衡所述柱。用20mMTris.HCl和100mM氯化鈉(最終濃度)處理人源血漿。lOpm過濾200mL經(jīng)處理的血漿，然后以80cm/小時(shí)加入。加入后，用20mMTris.HCl、20mM檸檬酸鈉和140mM氯化鈉pH7.5洗至基線吸收度。然后用20mMTris.HCl、20mM檸檬酸鈉、3mMCaC12、30。/。乙二醇和500mM氯化鈉和0.01%Tween80pH7.5洗脫所述柱。洗脫后，用8M脲pH7.0對(duì)柱進(jìn)行消毒。隨后用0.5M氫氧化鈉清洗所述柱。通過濁度測(cè)定法、vWFELISA和因子VIII顯色活性試驗(yàn)分析加入的、未結(jié)合的和洗脫的級(jí)分，以確定回收率。還進(jìn)行SDSPAGE以研究純度?；厥章柿杏诒韑中。來自吸附劑V色鐠分析的vWF/FVIII的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過顯色活性試驗(yàn)(COATESTVIII:C/4，由Chromogenix提供)確定因子VIII結(jié)果。結(jié)果以國(guó)際單位(IU)表示，其中正常人血漿每mL含有1國(guó)際單位的因子VIII活性。由ELISA確定vWF結(jié)果。權(quán)利要求1.親和吸附劑用于分開、除去、分離、純化、表征、鑒別或量化因子VIII、馮威勒布蘭特因子或作為二者任一種的類似物的蛋白的用途，其中所述親和吸附劑是式II的化合物其中一個(gè)X是N，另一個(gè)是N、C-Cl或C-CN；A是載體基體，任選地通過間隔基連接到所述三嗪環(huán)；Y是O、S或NR2；Z是O、S或N-R3；R2和R3各自是H、C1-6烷基、C1-6羥烷基、苯甲基或β-苯乙基；B和W各自是含有1～10個(gè)碳原子的任選地取代的烴鍵；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季銨、咪唑、胍基或脒基；或B-D是-CHCOOH-(CH2)3-4-NH2；和R7是在中性pH下帶有正電荷的基團(tuán)。2.權(quán)利要求1的用途，其中R7是仲胺或叔胺。3.權(quán)利要求2的用途，其中所述胺形成環(huán)的一部分。4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中B或W包括芳基。5.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式III。6.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式IV。7.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式V。8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述吸附劑與血漿樣品接觸。9.一種新型化合物，其具有前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中所定義的式II。10.—種化合物，其是根據(jù)權(quán)利要求9的化合物的前體，其中A被官能團(tuán)代替，直接地或間接地連接到所述三溱環(huán)，這允許所述前體固定在固體載體上。全文摘要為分開、除去、分離、純化、表征、鑒別或量化因子VIII、馮威勒布蘭特因子或作為二者任一種的類似物的蛋白，使用親和吸附劑，其是式(II)的化合物，其中一個(gè)X是N，另一個(gè)是N、C-Cl或C-CN；A是載體基體，任選地通過間隔基連接到三嗪環(huán)；Y是O、S或NR₂；Z是O、S或N-R₃；R₂和R₃各自是H、C_1-6烷基、C_1-6羥烷基、苯甲基或β-苯乙基；B和W各自是含有1～10個(gè)碳原子的任選地取代的烴鍵；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季銨、咪唑、胍基或脒基；或B-D為-CHCOOH-(CH₂)_3-4-NH₂；以及R₇是在中性pH下帶有正電荷的基團(tuán)。文檔編號(hào)B01J20/32GK101171076SQ200680015918公開日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年5月9日優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日發(fā)明者巴爾德夫·辛格·貝納斯,詹森·理查德·貝特利申請(qǐng)人:普羅米蒂克生物科學(xué)有限公司