專利名稱：用于分析、分離和離析單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低聚物的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及依據(jù)聚合度，利用二醇相液相色語(yǔ)(LC)分離并 優(yōu)選回收包括但不限于黃烷-3-醇的單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低聚物 的改進(jìn)方法。已知各種黃烷-3-醇具有不同性質(zhì)，并對(duì)人和動(dòng)物具有不同 用途。基于聚合度更有效地分離和回收單獨(dú)的黃烷-3-醇將使其作用靶 向性更高和更力o有效。
相關(guān)技術(shù)討i侖原花色素，即黃烷-3-醇的低聚物和聚合物，為繼木質(zhì)素之 后含量第二豐富的天然植物酚。黃烷-3-醇單體主要通過(guò)一個(gè)單體4 位與另一個(gè)單體8位間的碳碳鍵(C4—C8)而連接在一起，少量通過(guò) C4—C6鍵而連接在一起。原花色素包括B-型和A-型原花色素。在B-型原花色素中， 單體通過(guò)黃烷間C4—C6和/或黃烷間C4—C8 4建而連接在一起。只具 有C4—C8鍵的低聚物為線性，而至少一個(gè)C4—C6鍵的存在將導(dǎo)致 支化的低聚物。而A-型原花色素為包括在C2-0-C7以及在C4—C6 或C4—C8位鍵的雙重連接低聚物。原花色素的分子量通常以聚合度(DP)表示。 一般將單獨(dú)的 低聚物稱作二聚物和三聚物等。原花青素為最大類的原花色素。Gu等表明發(fā)現(xiàn)41種食 物中包含原花色素，27種食物中包含原花青素(J. Agric. and Food Chem.)(2OO3》l:7513)。原花青素可包括(-)-表兒茶素、(+)-表兒茶素、 (+)-兒茶素和/或(-)-兒茶素單體單元，以及沒(méi)食子酸化的單體，例如(-)-兒茶素沒(méi)食子酸酯、(+)-兒茶素沒(méi)食子酸酯、(-)表兒茶素沒(méi)食子酸酯 和/或(+)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯。已知原花色素在植物食物的顏色穩(wěn)定性、澀味和苦味中起 到重要作用。(見(jiàn)例如Haslam,"實(shí)用多暢、從分子^X別和生理作用角 度(Practical Polyphenols: From Molecular Recognition and Physiological Action)"(CambridgeU. Press, 1998))。然而，原花色素的名聲卻因這些 酚類化合物潛在的健康益處而得到了提高。(見(jiàn)例如Bagchi等，毒理 學(xué)(Toxicology) (2000) 148:187; Foo等，天然產(chǎn)物雜志(丄Natural Products) (2000) 63:1225; Steinberg等，Am. J. Clin. Nutri. (2003) 77:1466)。還已知用于人體和動(dòng)物時(shí)各種原花青素4氐聚物具有特異性 質(zhì)和潛在作用。例如，Tempesta公開(kāi)了聚合度(DP)為2-11的原花青
素低聚物具有明顯的抗病毒活性，并用于治療被副黏液病毒 (paramyxovaridae)(例如呼吸道合另包病毒)、正黏液病毒 (orthomyxovaridae)(例如流行性感冒病毒A、 B和C)以及皰滲病毒(例 如單純皰滲病毒)感染的包括人在內(nèi)的溫血?jiǎng)游?美國(guó)專利5,211 ;944)。 Romanczyk Jr.等公開(kāi)了包含DP為3-11的原花青素^f氐聚物和合適載體 的抗腫瘤組合物(美國(guó)專利5,554,645)。 Romanczyk Jr.等還公開(kāi)了 DP 為5-12的原花青素低聚物用作抗氧化劑(美國(guó)專利5，891,905)。Schmitz 等公開(kāi)了將DP為2-18的可可原花青素低聚物與乙酰水楊酸用于抗血 小板療法(美國(guó)專利6,524,630)。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性和性質(zhì)多樣性，原花色素的分析記載很 豐富(Santos-Buelga等，"多酚分析方法(Processes in Polyphenol Analysis)",皇家化學(xué)會(huì)(Royal Society of Chemistry) ， Cambridge, 2003 ， 267頁(yè))。Lea描述了將正相高效液相色譜(NP-HPLC)用于原花青素分 析(Lea等，食品和農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志(J. Sci. Food and Agriculture) (1979) 30:833)，并還觀察到利用Sephadex LH-20柱在等度條件得到了其中 較大低聚物較較小低聚物保留時(shí)間更長(zhǎng)的洗脫順序(Ani. J. Enology and Viticulture (1979) 30:289)。 Wilson等公開(kāi)了利用四氫呋喃-己烷-乙酸/曱酸-異丙醇梯度流動(dòng)相通過(guò)氰基柱基于DP實(shí)現(xiàn)了蘋果汁原花 青素的部分分離(食品農(nóng)業(yè)科學(xué)(Sci. Food. Agric.) (1981) 32:257)。已在二氧化硅固定相上實(shí)現(xiàn)了原花青素低聚物分離和分 析的明顯提高。見(jiàn)Rigaud等，Chromatogr. (1993) 654:179; Cheynier 等,酶學(xué)方法(Processes in Enzymology) (1999) 299; Natsume等，Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:2581 。已實(shí)現(xiàn)五聚體(DP-5)原花青素低 聚物的分析。Hammerstone等公開(kāi)了在分析未發(fā)酵的脫脂可可豆的過(guò) 程中改進(jìn)該方法導(dǎo)致了單體至十聚體分離度的提高。見(jiàn)農(nóng)業(yè)和食品化 學(xué)雜志(J. Agric. and Food Chem.) (1999) 47:490。 Gu等還公開(kāi)了進(jìn)一 步改進(jìn)導(dǎo)致了十聚體(DP-10)的洗脫，以及整體峰形和分辨率的改善。 見(jiàn)農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志(J. Agric. and Food Chem.) (2002)50:4852)。這些HPLC方法使用由二氯甲烷-甲醇-乙@^/曱酸-水組成 的梯度流動(dòng)相，以實(shí)現(xiàn)直至五聚體的原花青素低聚物的分離，另一分 離蘋果原花青素的方法利用己烷-曱醇-乙酸乙酯或己烷-丙酮，經(jīng)二氧 化硅柱分離(Yanagida等，J. Chromatogr. A (2000) 890:251)。然而，包括Gu等的方法在內(nèi)的現(xiàn)有HPLC方法具有不少 缺點(diǎn)。第一，使用氯化溶劑例如二氯甲烷會(huì)引起安全問(wèn)題。當(dāng)來(lái)自大 規(guī)模系統(tǒng)的離析的流分可能用于進(jìn)一 步生物研究時(shí)，這尤其是個(gè)問(wèn) 題。已知接觸二氯甲烷會(huì)影響皮膚、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和心 血管系統(tǒng)，短期接觸可導(dǎo)致疲勞、乏力、嗜睡、頭暈、四月支麻痹、皮
月夫發(fā)麻、惡心以及刺激皮膚和眼睛。長(zhǎng)期接觸二氯曱烷則與試驗(yàn)動(dòng)物 的肺癌、肝癌和胰腺癌相關(guān)。二氯甲烷也是可導(dǎo)致出生缺陷的誘變劑， 如果婦女在懷孕過(guò)程中與其接觸。已知另 一種常用的HPLC溶劑四氫呋喃(THF)剌激人體受 試體的眼睛，以及粘膜和胃腸道。過(guò)度接觸THF可導(dǎo)致咳嗽、呼吸 急促、頭昏、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)抑制、中毒和虛脫。用于分離原花青素低聚物的現(xiàn)有HPLC方法的其他問(wèn)題 包括利用二氧化硅作為固定相時(shí)與原花青素的正相(NP)分離相關(guān)的 一貫性問(wèn)題，即柱與柱之間的易變性。低聚物常常出現(xiàn)峰強(qiáng)度降低情 況或者完全檢測(cè)不到，因?yàn)槠淇赡鼙晃皆诙趸绫砻?。為原花?素NP分離中峰形所需，在流動(dòng)相中使用水，進(jìn)一步降低了柱間重現(xiàn) 性。此外，從實(shí)際角度出發(fā)，大部分用于分離各種黃烷-3-醇(包括原 花青素低聚物)的現(xiàn)有HPLC方法涉及使用三或四元流動(dòng)相，因此超 出了不具備復(fù)雜的四元HPLC泵的分析實(shí)驗(yàn)室的能力范圍。需要基于DP識(shí)別單獨(dú)的極性質(zhì)子低聚物的改進(jìn)方法，以 及基于DP分離和回收單獨(dú)的極性質(zhì)子低聚物的方法，所述方法避免 使用危險(xiǎn)的和對(duì)環(huán)境有害的溶劑，改善了單獨(dú)的極性質(zhì)子低聚物的分 離和回收，適用于僅裝備有普通兩元HPLC泵的分析實(shí)驗(yàn)室，適用于 以制備規(guī)才莫回收特定低聚物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于分離和洗脫單獨(dú)的4及性質(zhì)子單體和/或 低聚物的改進(jìn)方法。所述方法包括以下步驟(i)將包含單體和/或低 聚物的液體樣品引入用極性鍵合固定相填充的液相色譜(LC)柱；(ii) 通過(guò)使包含基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的A相和基本由極性質(zhì)子溶 劑組成的B相的兩元流動(dòng)相流過(guò)所述柱子，基于聚合度分離所述單獨(dú) 的單體和/或低聚物；和(iii)洗脫包含所述單體和/或低聚物的一個(gè)或
多個(gè)單獨(dú)的流分。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)干燥或其他常規(guī)方
法回收一種或多種洗脫的單獨(dú)的單體和/或低聚物以用于食品、藥用 食品、營(yíng)養(yǎng)品或藥品?？苫厥障疵摰膯为?dú)的單體和/或低聚物以在其 他分離中用作標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選引入LC柱的液體樣品中提取物的量大于10毫克。 更優(yōu)選，提取物的量大于IOO毫克。更優(yōu)選，提取物的量大于l克。所述極性4定合固定相可為二醇相、甘油相、氨基相、氰基 相、三甲基甲硅烷基相、二甲基曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相或硝基相。優(yōu)選固定相為二醇相或甘油 相。在兩元流動(dòng)相中(優(yōu)選其為含水的)，所述極性非質(zhì)子溶劑 可為乙腈、丙酮、環(huán)己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二 曱醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯和硝基曱烷中的任意溶劑，所述極性質(zhì)子 溶劑可為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇中的任意溶劑。A相中極性非質(zhì)子溶劑的比例可高達(dá)100%體積，B相中 極性質(zhì)子溶劑的比例可高達(dá)100%體積。A相和B相的剩余部分可為 任意無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和/或水。優(yōu)選，A相中極性非質(zhì)子溶劑和B相中極性質(zhì)子溶劑的比例大于50%體積。更優(yōu)選，極性非質(zhì)子溶劑(A相) 和極性質(zhì)子溶劑(B相)的比例大于90%體積。在優(yōu)選實(shí)施方案中，A 相中極性非質(zhì)子溶劑為約98%體積乙腈，B相中極性質(zhì)子溶劑為約 95%體積甲醇。優(yōu)選極性鍵合固定相的顆粒大小為約3 ium-約10 |iim。優(yōu) 選LC柱的直徑為至少十(10)毫米。本發(fā)明還提供了用于基于聚合度分離和洗脫單獨(dú)的極性 質(zhì)子單體和/或低聚物的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括用極性鍵合固定色譜相 填充的LC柱；和用于洗脫包含所述單體和/或低聚物的一個(gè)或多個(gè)單 獨(dú)流分的兩元流動(dòng)相，其中所述流動(dòng)相包含基本由極性非質(zhì)子溶劑組 成的A相和基本由極性質(zhì)子溶劑組成的B相。所述極性鍵合固定相可為二醇相、甘油相、氨基相、tt 相、三甲基甲硅烷基相、二曱基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、由化相和硝基相中的任意相。優(yōu)選極性4定合固 定色譜相為二醇相或甘油相。還優(yōu)選極性鍵合固定色譜相的顆粒大小 為約3 pm-約10 imi。優(yōu)選柱子的直徑為至少十(10)毫米。在兩元流動(dòng)相中，A相中極性非質(zhì)子溶劑可為乙腈、丙酮、 環(huán)己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二甲醚、乙酸甲酯、 乙酸乙酯和硝基甲烷中的任意溶劑。B相中極性質(zhì)子溶劑可為曱醇、 乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇中的任意溶劑。用于該系統(tǒng)的合適極性質(zhì)子單體和/或低聚物包括原花色 素、可水解的單寧、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、 聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。其中極性質(zhì)子 單體和/或低聚物為原花色素，其可為原芽菜定、原木犀草定、原五 羥黃酮、原花葵素、原花翠素、原桂金合歡定、原四羥黃酮、原刺槐 定、proteracacinidins和/或原黑金合歡素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，單體 為表兒茶素和/或兒茶素，低聚物為其原花青素低聚物。
A相中極性非質(zhì)子溶劑的比例可高達(dá)100%體積，B相中 極性質(zhì)子溶劑的比例可高達(dá)100%體積。A相和B相的剩余部分可為 任意無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和/或水。優(yōu)選，A相中極性非質(zhì)子溶劑和B相中 極性質(zhì)子溶劑的比例大于50%體積。更優(yōu)選，極性非質(zhì)子溶劑(A相) 和極性質(zhì)子溶劑(B相)的比例大于90%體積。在優(yōu)選實(shí)施方案中，A 相中極性非質(zhì)子溶劑為約98%體積乙腈，B相中極性質(zhì)子溶劑為約 95%體積甲醇。
和離析黃嘌呤方法。所述方法包括以下步驟(i)將包含黃嘌呤和極 性質(zhì)子單體和/或低聚物的液體樣品引入用極性鍵合固定色譜相填充 的液相色譜(LC)柱；(ii)通過(guò)使基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的等度流 動(dòng)相流過(guò)所述柱子，將黃噪呤從單體和/或低聚物中分離出來(lái)；和(iii) 洗脫包含黃噪呤的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分。優(yōu)選黃嘌^冷為咖啡因和/或 可可堿。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述液體樣品為極性脫脂可可提取物。 在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)干燥或其他常規(guī)方法回收洗脫的單獨(dú) 的黃噪呤以用于食品、藥用食品、營(yíng)養(yǎng)品或藥品。也可回收洗脫的單
獨(dú)的黃嘌呤以在其他分離中用作標(biāo)準(zhǔn)品。所述極性鍵合固定相可為二醇相、甘油相、氨基相、M 相、三曱基曱硅烷基相、二曱基曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相或硝基相。優(yōu)選固定相為二醇相或甘油相。在等度流動(dòng)相中(優(yōu)選其為含水的)，優(yōu)選極性非質(zhì)子溶劑 為乙腈。優(yōu)選等度流動(dòng)相中極性非質(zhì)子溶劑的比例為至少90%體 積。流動(dòng)相的剩余部分可為任意無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和/或水。在優(yōu)選實(shí)施 方案中，等度流動(dòng)相中的極性非質(zhì)子溶劑為約99%體積乙腈。
和離析黃噤呤的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括用極性鍵合固定色譜相填充的液
相色譜柱；和用于洗脫包含黃噤呤的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分的等度流動(dòng)
相，其中所述流動(dòng)相基本由極性非質(zhì)子溶劑組成。所述極性鍵合固定相可為二醇相、甘油相、氨基相、氰基 相、三曱基曱硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基 相、己基相、苯基相、卣化相和硝基相中的任意相。優(yōu)選固定相為二 醇相或甘油相。也優(yōu)選固定相的顆粒大小為約3 nm-約10 iiim。優(yōu)選 柱子的直徑為至少十(10)毫米。在等度流動(dòng)相中，優(yōu)選極性非質(zhì)子溶劑為乙腈。優(yōu)選等度 流動(dòng)相中極性非質(zhì)子溶劑的比例大于90%體積。剩余部分可為任何無(wú) 機(jī)或有機(jī)酸和/或水。在優(yōu)選實(shí)施方案中，等度流動(dòng)相中的極性非質(zhì) 子溶劑為約99%體積乙腈。本發(fā)明還提供了用于分離和洗脫黃噪呤和單獨(dú)的極性質(zhì) 子單體和/或低聚物的方法。所述方法包括以下步驟(i)將包含黃嘌
呤和極性質(zhì)子單體和/或低聚物的液體樣品引入用極性鍵合固定色譜 相填充的液相色譜柱；(ii)通過(guò)使基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的等度 流動(dòng)相流過(guò)所述柱子并洗脫包含黃嘌呤的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分，將黃 噪呤從單體和/或低聚物中分離出來(lái)；(iii)接著通過(guò)使包含基本由極
性非質(zhì)子溶劑組成的A相和基本由極性質(zhì)子溶劑組成的B相的兩元 流動(dòng)相流過(guò)所述柱子，基于聚合度分離單獨(dú)的單體和/或低聚物；和(iv) 洗脫包含所述單體和/或低聚物的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分。在某些優(yōu)選 實(shí)施方案中，可通過(guò)千燥或其他常規(guī)方法回收洗脫的黃嘌呤和/或一 種或多種洗脫的單獨(dú)的單體和/或低聚物以用于食品、藥用食品、營(yíng) 養(yǎng)品或藥物。也可回收洗脫的黃噤呤和/或洗脫的單獨(dú)的單體和/或低 聚物，在其他分離中用作標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選黃嘌呤為咖啡因和/或可可堿。所述單體和/或低聚物 可為原花色素、可水解的單寧、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚 山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。所 述極性鍵合固定相可為二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三甲基甲
硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、 苯基相、卣化相或硝基相。以下具體描述公開(kāi)了這些和其他目的以及實(shí)施方案，或者 從以下具體描述中顯而易見(jiàn)這些和其他目的以及實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述

圖1單體黃烷-3-醇以及通過(guò)碳-碳C4—C8和C4—C6鍵 而連接在一起的原花青素低聚物的結(jié)構(gòu)。圖2來(lái)自未發(fā)酵的可可豆的原花青素的二醇相HPLC熒 光圖。圖3分離來(lái)自越南肉桂(cinnamomum loureirii)丙酮緩沖 液提取物的極性質(zhì)子單體和低聚物的二醇柱HPLC圖。圖4原花青素的HPLC色譜圖，利用Lichrosphere 二氧 化硅(Uchrosphere Silica)(下)和Develosil 二醇(Develosil Diol)(上)作為
固定相。圖5原花青素低聚物基于聚合度的HPLC分析中二醇固 定相相對(duì)二氧化硅固定相峰面積增加百分比圖。
圖6 CP提取物的制備相HPLC圖。圖7收集自CP提取物HPLC分離的單獨(dú)流分的FLD圖， 對(duì)應(yīng)DP=l-7的低聚流分。圖8用于分離來(lái)自CP提取物的咖啡因和可可堿的制備 系統(tǒng)的LC色譜圖。圖9來(lái)自半制備二醇分離的離析流分的HPLC分析色譜圖。
發(fā)明詳迷本發(fā)明公開(kāi)了基于聚合度分離和離析極性質(zhì)子單體和/或 低聚物的改進(jìn)方法，所述方法利用具有兩元流動(dòng)相的基于二醇的LC 系統(tǒng)洗脫包含單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低聚物的 一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流 分，還公開(kāi)了用于相同目的的系統(tǒng)。圖1示出了單體黃烷-3-醇和通過(guò)C4—C8和C4—C6鍵而 連接在一起的原花青素低聚物的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明改進(jìn)方法和系統(tǒng)使用基于二醇的固定相LC柱和兩 元流動(dòng)相，所述流動(dòng)相包含A相(乙腈和醋酸(CH3CN:H0Ac)之比為 98:2(v/v)的混合物)和B相(甲醇、水和醋酸(CH30H:H20:HOAc)之比 為95:3:2(v/v/v)的混合物)。其解決了更好地分離單獨(dú)的低聚物，尤其 是較高級(jí)低聚物的問(wèn)題。圖4比較了利用二醇固定相(上)和二氧化硅 固定相(下)所得的色譜圖。如其所示，二醇固定相實(shí)現(xiàn)了單獨(dú)的低聚 物的更好分離，尤其是實(shí)現(xiàn)了 DP為7或更大的低聚物更好分離。應(yīng) 當(dāng)理解的是所述改進(jìn)方法較現(xiàn)有方法更有用，因?yàn)槠淇墒褂酶喾N類 溶劑(包括水)，并可用于僅裝備有兩元LC泵的實(shí)驗(yàn)室。另一個(gè)益處 在于其能在單次LC運(yùn)行中分析除原花青素外的其他化合物(即其他 黃酮化合物、咖啡因和可可石咸)，尤其是當(dāng)與質(zhì)譜(LC-MS)結(jié)合時(shí)。本 發(fā)明還公開(kāi)了用于分離咖啡因和可可堿的方法，所述方法使用所述改 進(jìn)方法的修改形式。下文更具體描述所述方法和系統(tǒng)。雖然具體7/Hf的方法和 系統(tǒng)涉及可可原花青素，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是所述公開(kāi) 的方法和系統(tǒng)適于分離任何極性質(zhì)子單體和/或低聚物，包括但不限 于其他原花色素(例如原芽菜定、原木犀草定、原五羥黃酮、原花葵 素、原花翠素、原桂金合歡定、原四羥黃酮、原刺槐定 (prorobinetindins)、 protemcacinidins和原黑金合歡素)、可水解的單寧、 寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚 乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。其他包含極性質(zhì)子單體和/或低聚 物的物質(zhì)包括花生紅衣、肉桂、藍(lán)莓、蘋果、高粱、山楂、蔓越橘和 葡萄。此外，所述公開(kāi)的方法和系統(tǒng)適于分離糖聚合物，例如麥芽糖 (maltosaccharide)、環(huán)糊精、N-乙酰所有溶劑(二氯曱烷、乙腈、甲醇和醋酸)均為色譜級(jí)，購(gòu) 自Fisher Scientific (Fairlawn, New Jersey)。乙醇為USP食品級(jí)，購(gòu)自 Sigma-Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) 。 ？K利用來(lái)自Millipore (Bedford, Massachusetts)的Milli-Q-水純化系統(tǒng)去離子化。樣品制備CP提取物?？煽啥喾?CP)提取物通過(guò)旨在減 少可可原花青素降解的多步法制備。收獲可可豆，洗去漿狀物，千燥。 在環(huán)境條件下以壓榨器按壓干燥的可可豆，以去除可可脂。然后用乙 醇:水(70:30v/v)研磨和提取油餅。離心去除固體。減壓蒸發(fā)提取液去 除乙醇，最后噴霧干燥。樣品制備來(lái)自可可籽的CP提取物。將新鮮的未發(fā)酵的 可可籽(30 g)冷凍干燥(16.9 g)。用己烷使冷凍干燥的可可籽(10.2 g)脫 脂，研磨脫脂可可豆小樣(6.3 g)，用40mL丙酮:水:醋酸(70:29.5:0.5， v/v/v)超聲(10分鐘，50。C)提取三次。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除合并提取液 中的丙酮。冷凍干燥剩余液體得到紫紅色殘留物(1.13 g)。正相高效液相色譜質(zhì)譜(NP-HPLC-MS)分析CP提取物和 純化的低聚物。可可提取物中的原花青素低聚物和下文所述制備系統(tǒng) 所得原花青素低聚流分的分離和表征利用NP-HPLC-MS進(jìn)行。在裝 有自動(dòng)取樣器、四元HPLC泵、柱加熱器、二極管陣列檢測(cè)器和熒光 ^r測(cè)器的Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分離。所述HPLC與裝有 API-ES電離室的HP Series 1100質(zhì)量選擇檢測(cè)器(型號(hào)G1946A)界面 相連。所4吏用的柱子為購(gòu)自 Phenomenex(Torrance, California)的 DevelosilDiol(250x4.6mml.D.， 5p顆粒大小)。兩元流動(dòng)相由(A)乙 腈:醋酸(98:2， v/v)和(B)甲醇:水:醋酸(95:3:2， v/v/v)組成。利用線性梯 度(流動(dòng)相)在30。C以0.8 mL/分鐘流速如下進(jìn)行分離0-35分鐘， 0-40%B; 35-40分鐘，40%B等度；40-45分鐘，40-0%B，接著5分 鐘再平衡時(shí)間。通過(guò)熒光檢測(cè)(FLD)(激發(fā)波長(zhǎng)二276nm，發(fā)射波長(zhǎng) 二316nm)監(jiān)控洗脫液。利用MS法和自Hammerstone等，丄Agric. and Food Chem. (1999) 47:490修改的參數(shù)表征提取物和純化的流分，通過(guò)
引用將其公開(kāi)的內(nèi)容結(jié)合到本文。電離試劑通過(guò)正好在質(zhì)譜前的LC 洗脫液液流中的T形物加入，并通過(guò)LC泵輸送。用于在正離子才莫式 分41"的條件包括以0.05 mL/分鐘流速引入0.05 M NaCl以有助于電 離，3.5kV毛細(xì)管電壓，100 V裂解器(fragmentor)電壓，25psig噴霧 壓力和350°C干燥氣體溫度。用于在負(fù)離子才莫式分析的條件包括1.5 M NH4OH作為緩沖劑，其流速為0.09 mL/分鐘29分鐘，然后0.05 mL/ 分鐘。毛細(xì)管電壓為3kV,裂解器電壓為75V,噴霧壓力為25psig, 干燥氣體溫度為350°C。MS分析忽略氫氧化銨的使用。將樣品溶解在丙S同:水:醋 酸(70:29.5:0.5， v/v/v)或流動(dòng)相中，注入前濾過(guò)0.45 jxm PTFE注射過(guò)CP提取物的對(duì)比NP-HPLC在Lichrosphere 二氧化硅和 Develosil 二醇固定相上進(jìn)行。CP流分的分離在Lichrosphere Silica和 Develosil Diol上并在Adamson等,J. Agric. and Food Chem. (1999) 47:4184所述色譜條件下進(jìn)行。色譜系統(tǒng)為裝有控溫取樣器、四元泵、 柱加熱器和熒光檢測(cè)器的Agilent 1100 Series HPLC系統(tǒng)。所使用的 4主子為L(zhǎng)ichrosphere Silica(250 x 4.6 mm, 5 ji, 100人孑14圣)和Develosil Diol。色譜流動(dòng)相由二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇(CH30H)和醋酸:水 (l:l)(HOAc:H20)組成。起始流動(dòng)相條件為82%CH2C12、 14%CH3OH 和4%(HOAc:H20)。接著，使CH3OH在30分鐘后增至28.4%, 50 分鐘后為42.8%, 51分鐘后為86.0%。在整個(gè)色譜運(yùn)行中，HOAc:H20 比率保持恒定為4%。利用276 nm激發(fā)波長(zhǎng)和316 nm發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行 熒光檢測(cè)。所有樣品通過(guò)以下方法制備溶解在丙酮水醋酸 (70:29.5:0.5)中，然后濾過(guò)0.45 PTFE注射過(guò)濾器，隨后HPLC注 入。CP提取物的制備型NP-HPLC。 Agilent 1100系列制備泵 與HP 1050 UV檢測(cè)器和Kipp and Zonen記錄儀相連。利用購(gòu)自 Phenomenex(Torrance, CA)的Develosil Diol(300 x 50 mm I.D.， 100 jim
顆粒大小)柱實(shí)現(xiàn)原花青素的制備分離。流動(dòng)相由溶劑
A(CH3CN:HOAc, 99:1 v/v)和B(CH3OH:H20:HOAc, 95:4:1 v/v/v)組成， 使用0-30%B線性梯度35分鐘，接著等度30分鐘，最后提高至80%B。 再平衡時(shí)間為10分鐘。將流速設(shè)為55 mL/分鐘，柱溫為室溫(23 ± 2°C)。將檢測(cè)器設(shè)為280 nm。上柱利用裝有2 mL注樣環(huán)的手動(dòng)進(jìn)樣 器Rheodyne閥(Rheodyne Valve)7725型進(jìn)行。將CP提取物溶解在流 動(dòng)相中，離心，注入前濾過(guò)0.45 pm PTFE注射過(guò)濾器。原花青素的半制備分離也利用購(gòu)自Phenomenex(Torrance, CA)的Develosil Diol(250 x 21.5 mm I.D., 100 pm顆粒大小)柱實(shí)現(xiàn)。流 動(dòng)相由上述相同組合物組成。0-30%B線性梯度45分鐘，接著等度 20分鐘，最后提高至85%B以從柱中洗去任何剩余的殘留物。該柱 子的流速為15mL/分鐘。圖2示出了未發(fā)酵的脫脂可可籽提取物的色譜圖。標(biāo)識(shí) 2-14表示峰中原花青素的聚合度?；衔镆罁?jù)其聚合度被洗脫，并利 用LC-MS表征為黃烷-3-醇單體和至十四聚體(DP-14)的低聚物。如 Gu等所公開(kāi)，未發(fā)酵可可黃烷-3-醇單體和低聚物的成分僅由(-)-表兒 茶素和(+)_兒茶素構(gòu)成。見(jiàn)j. Agric. and Food Chem.(2003) 51:7513。 與本文所述色諳分離相一致，Gu等離析出了十聚體峰后的由平均DP 為14的原花青素組成的原花青素聚合物。(Id.)。圖3示出了利用改 進(jìn)的二醇固定相和兩元流動(dòng)相法，基于DP,從越南肉桂丙酮緩沖液 提取物中進(jìn)行單體和低聚物的類似分離。與現(xiàn)有方法對(duì)比。為評(píng)價(jià)Develosil Diol相相對(duì)于 Lichrosphere Silica的色譜性能，在Adamson等所述色譜條件下(J. Agric. and Food Chem. 47 (1999) 4184)對(duì)各柱子進(jìn)行評(píng)測(cè)。當(dāng)在二氧化 硅上進(jìn)行測(cè)試時(shí)，用于二醇相的新色譜條件(即二醇為固定相，乙腈 代替兩元流動(dòng)相中的二氯甲烷)未實(shí)現(xiàn)原花青素的分離。典型的 Lichrosphere Silica相和Develosil Diol相色譜圖見(jiàn)圖4。該色鐠圖表明 了在相同色譜條件下保留性質(zhì)的明顯區(qū)別。該鍵合的二醇相僅針對(duì)原
花青素單體即(-)-表兒茶素和(+)-兒茶素表現(xiàn)出了類似的保留性質(zhì)。該 鍵合的二醇相針對(duì)二聚體至十聚體表現(xiàn)出了更強(qiáng)的保留性質(zhì)，保留時(shí)
間隨聚合度提高而增加。在相同條件下十聚體流分的保留時(shí)間較
Lichrosphere Silica相所觀察到的保留時(shí)間長(zhǎng)約50%。與二醇相更強(qiáng)的 保留性質(zhì)相一致，還觀察到分離種類(spedation)的增加。這從整個(gè)色 譜圖清楚可見(jiàn)，甚至影響了在10分鐘的單體區(qū)域。二醇相基本得到 了(-)-表兒茶素和(+)-兒茶素的基線分離，而二氧化硅相表現(xiàn)出了明顯 的共洗脫。就所述保留能力更強(qiáng)的鍵合相而言，該分離種類的增加并 非出人意料的結(jié)果。然而，比較二醇和二氧化硅固定相間的峰面積卻 得到了出人意料的結(jié)果二醇相相對(duì)于二氧化硅相DP=2至DP=10 的總峰面積增加。該總峰面積增加的程度隨分子量增大而變大。如圖 5所示，這些觀察結(jié)果很可能是吸附現(xiàn)象降低的結(jié)果。考慮到更長(zhǎng)的 保留時(shí)間通常產(chǎn)生面積更小的更寬峰形，該觀察結(jié)果尤其令人振奮。制備規(guī)^莫。擴(kuò)大色譜法的規(guī)模引起了人們的興趣，不僅是 為得到用于進(jìn)一步分析進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)品，還為通過(guò)產(chǎn)生"純凈的"低聚流 分，用于隨后的生物學(xué)研究，以闡明這些酚類分子所利用的不同生理 機(jī)理。雖然大部分基于DP分離原花青素的現(xiàn)有分析方法有效，并已 常規(guī)應(yīng)用(見(jiàn)例如Rigaud等，Chromatogr.(1993)654:179; Hammerstone 等，J. Agric. and Food Chem. (1999)47:490;和Gu等，J. Agric. and Food Chem. (2002)50:4852),但流動(dòng)相的組成(0 2(:12, CH3OH， HOAc)嚴(yán) 重阻礙了擴(kuò)大該方法的規(guī)j莫。本文所述二醇固定相法的 一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于其能擴(kuò)大所 述方法的規(guī)3莫，而不必過(guò)多地關(guān)注安全問(wèn)題和處理費(fèi)用。由于溶劑選 一澤和用于分析規(guī)3莫的相對(duì)簡(jiǎn)單的兩元流動(dòng)相梯度，只需改變梯度和流
速，所述方法即可轉(zhuǎn)移至半制備(250x21.5 mm)規(guī)模，然后轉(zhuǎn)移至制 備(300 x 50 mm)^Mt HPLC系統(tǒng)。使用由乙腈、曱醇和醋酸組成的流動(dòng)相，利用制備 Diol-Develosil柱(300 x 50 mm)實(shí)現(xiàn)原花青素低聚物的分離。在280 nm監(jiān)控洗脫液的吸光度。在70分鐘流程中觀察到九個(gè)峰。圖6示出了 記錄儀所得圖形。其中T和C指黃噤呤，分別是可可堿和咖啡因。 編號(hào)的峰指示DP。溶劑沸點(diǎn)低且易去除，從而有助于低聚物的離析。 此外，酸含量更少。該方法與Adamson等的方法(J. Agric. and Food Chem. (1999)47:4184)(其中在使用二氯甲烷-甲醇-醋酸-水梯度的二氧化硅柱 上進(jìn)行可可原花青素低聚物的分離)成了鮮明對(duì)比。在使用500x20 mm Supelcosil LC-Si柱的單次運(yùn)行(180分鐘)中，Adamson等用了將 近4.5升二氯曱烷作為流動(dòng)相的一部分。此外，Adamson等需要多個(gè) 提取過(guò)程以離析用作參考物質(zhì)的低聚流分。與Sephadex對(duì)比。雖然可上載至制備二醇柱的原料的理 論上限值小于可上載至600 x 100 cm Sephadex LH-50柱的原料的理 論上限值(分別為 4 g對(duì)25 g CP)，但就溶劑使用、時(shí)間(二醇70分鐘 運(yùn)行相比于Sephadex幾天)和分辨率而言存在著明顯改進(jìn)。此外，制 備二醇系統(tǒng)可在收集過(guò)程中檢測(cè)和監(jiān)控，進(jìn)而得到如圖7所示"更純
凈的，，流分。現(xiàn)在，是CP提取物在流動(dòng)相中的溶解性限制了一次注入 (2 mL注樣環(huán)體積)中原料量的多少。樣品制備涉及將CP提取物溶解 在流動(dòng)相(A:B, 25:75 v/v)中。在這些條件下，形成白色沉淀(鑒定為 黃噤呤的混合物)和樹(shù)脂材料。提高溶劑和固體的比率并沒(méi)有改變這 些結(jié)果。離心后，分離上清液并注入柱子。加入乙醇溶解樹(shù)脂材料。 基于分析規(guī)4莫的方法，分析該溶解的材料，得到DP高達(dá)14的流分。 然而，用引起沉淀的流動(dòng)相將該可溶于乙醇的材料注入柱子，對(duì)于大 規(guī)模制備工作是不理想的?，F(xiàn)階段正在對(duì)用于樣品制備的各種方法 (通過(guò)提取預(yù)純化)進(jìn)行研究以提高每個(gè)注樣體積的注樣量，進(jìn)而提高 效率。分析離析峰(HPLC/FLD)有助于評(píng)價(jià)流分的純度，所有流 分的純度均大于95%。圖7示出了自CP提取物的制備型HPLC分離 收集的單獨(dú)的流分的FLD圖，該圖對(duì)應(yīng)于DP4至DP二7的低聚流分。
利用負(fù)離子模式MS電噴霧電離對(duì)單獨(dú)的低聚流分進(jìn)行分子量歸屬。
這些數(shù)據(jù)與Hammerstone等，J. Agrk. and Food Chem. (1999)47:490 的現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致。圖6中的數(shù)字(即l-7)對(duì)應(yīng)于低聚流分的DP。 利用正離子才莫式LC-MS ESI將標(biāo)有T和C的最初兩個(gè)峰識(shí)別為黃噤 呤，即可可堿(T)和咖啡因(C)。與二醇相更強(qiáng)的保留性質(zhì)相一致，還觀察到分離種類的增 加。這從整個(gè)色譜圖清楚可見(jiàn)，并影響了在10分鐘的單體區(qū)域。二 醇相基本得到了 (-)-表兒茶素和(+)-兒茶素的基線分離，而二氧化硅相 表現(xiàn)出了明顯的共洗脫。比較二醇和二氧化硅固定相間的峰面積卻得到了出人意 料的結(jié)果二醇相相對(duì)于二氧化硅相DP=2至DP=10的總峰面積增大。 如圖5所示，增加的程度隨分子量增大(即DP)而變大?？紤]到更長(zhǎng)的 保留時(shí)間通常產(chǎn)生面積更小的更寬峰形，該觀察結(jié)果尤其令人振奮。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是雖然上述實(shí)施例使用 二醇固定相，但其他極性鍵合固定色譜相也可用于獲得相同結(jié)果。其 他合適固定相包括但不限于甘油相、氨基相(優(yōu)選丙胺相)、氰基相(優(yōu) 選氰基丙基相)、三甲基曱硅烷基相、二甲基曱硅烷基相、丙基相、 丁基相、戊基相、己基相、苯基相、鹵化相或硝基相。此外，雖然公 開(kāi)了 5 pm顆粒大小，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是具體就 二醇固定相而言，任何市售的顆粒大小均可用于所述分離。目前市售 的二醇顆粒大小包括3、 5和10pm。類似地，雖然上述實(shí)施例使用乙腈和曱醇兩元流動(dòng)相，但 兩元流動(dòng)相可為任何才及性非質(zhì)子溶劑(A_相)和任何極性質(zhì)子落齊。(B相) 的組合。除乙腈外，用作(A)相的合適極性非質(zhì)子溶劑包括丙酮、環(huán) 己酮、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二乙醚、二曱醚、乙酸甲酯、乙 酸乙酯和硝基曱烷。除曱醇外，用作(B)相的合適極性質(zhì)子溶劑包括 乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇。應(yīng)當(dāng)理解的是A相中極性 非質(zhì)子溶劑和B相中極性質(zhì)子溶劑的比例可為0-100%體積，優(yōu)選大
于50%體積，更優(yōu)選大于90%體積。A相和B相的剩余部分可為任 意無(wú)^/L或有機(jī)酸(例如醋酸)和/或水。除基于DP分離極性質(zhì)子低聚物外，已發(fā)現(xiàn)改變用于分離 原花青素低聚物(基于DP)的流動(dòng)相梯度能得到脫咖啡因和脫可可堿 的可可多酚提取物。就回收而言開(kāi)始為1 g(40。/oCP-即400mg原料)， 可回收134 mg低聚物(DP〉2)。回收單體的質(zhì)量為39 mg。從可可多酚分離黃嘌呤(咖啡因和可可堿，在使用 Develosil Diol 300 x 50 mm， 100 pm柱(固定相)的Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)上于室溫(即-25'C)下進(jìn)行。兩元流動(dòng)相的組成如下(A)相包含 乙腈:醋酸99:l(v/v)， (B)相包含甲醇:水:醋酸95:4:l(v/v/v)。將半制備 操作的流速設(shè)為30mL/分鐘。利用如下線性梯度進(jìn)行分離0分鐘， 0%B; 15分鐘，0%B; 20分鐘，100%B; 30分鐘，100%B。利用280 nm UV檢測(cè)和熒光進(jìn)行分析。圖8示出了制備HPLC系統(tǒng)產(chǎn)生的LC圖。峰1為可可堿， 峰2為咖啡因，峰3為單體(黃烷醇)，峰4為DP〉1的低聚物。保持
最初的流動(dòng)相條件15分鐘(即0%B相，100。/。A相)，首先洗脫可可石威、 咖啡因和單體。調(diào)節(jié)流動(dòng)相至高極性以迅速回收CP低聚物(DP〉1)。圖9顯示了流分的分析結(jié)果。圖(a)為CP提取物的熒光檢 測(cè)結(jié)果。圖(b)為相同原料的UV檢測(cè)結(jié)果。已知黃嘌p令基本不發(fā)出熒 光，CP在UV檢測(cè)中不產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。因此利用兩種4全測(cè);漢式得到更 全面的圖。圖(c)示出了從CP提取物去除的黃嘌呤的UV圖。雖然沒(méi) 有顯示可可堿和咖啡因單獨(dú)流分的分析，但其可被分離和物理離析。 此外，可分離和離析單體與黃嘌呤。見(jiàn)圖(d)。圖(e)示出了去除單體和黃嘌呤后CP提取物的UV圖。顯 而易見(jiàn)的是樣品僅包含DP》的低聚物。雖然就某些特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理 解的是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可在本發(fā)明范圍內(nèi)作出許多改進(jìn)和變化。 因此，通過(guò)所附權(quán)利要求對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)展以覆蓋可能落入本發(fā)明實(shí)際主 旨和范圍內(nèi)的所有這些改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.一種用于分離和洗脫選自以下的單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低聚物的高效液相色譜法原花色素、可水解的單寧、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇，所述方法包括以下步驟a.將包含所述單體和/或低聚物的液體樣品引入用選自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三甲基甲硅烷基相、二甲基甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、鹵化相和硝基相的極性鍵合固定相填充的液相色譜柱；b.使包含基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的A相和基本由極性質(zhì)子溶劑組成的B相的兩元流動(dòng)相流過(guò)所述柱子，以基于聚合度分離所述單獨(dú)的單體和/或低聚物；和c.洗脫包含所述單體和/或低聚物的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述原花色素選自原芹菜定、原木 犀草定、原五羥黃酮、原花葵素、原花青素、原花翠素、原桂金合歡 定、原四羥黃酮、原刺槐定、protemcacinidins和原黑金合歡素。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自乙腈、丙 酮、環(huán)己酮、甲基乙基酮、曱基叔丁基醚、二乙醚、二甲醚、乙酸甲 酯、乙酸乙酯和硝基甲烷，且其中所述極性質(zhì)子溶劑選自甲醇、乙醇、 正丙醇、異丙醇、正丁醇和異丁醇。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述包含所述單體和/或低聚物的液 體樣品為脫脂可可提取物，其中所述單體為表兒茶素和/或兒茶素， 且所述低聚物為其原花青素低聚物。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述固定相為二醇相或甘油相。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述A相和B相為含水相。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中A相中極性非質(zhì)子溶劑的比例高達(dá) 100%體積，且其中B相中極性質(zhì)子溶劑的比例高達(dá)100。/。體積。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中A相中極性非質(zhì)子溶劑的比例大于 50%體積，且其中B相中極性質(zhì)子溶劑的比例大于50%體積。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中A相中極性非質(zhì)子溶劑的比例大于 90%體積，且其中B相中極性質(zhì)子溶劑的比例大于90%體積。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中A相中極性非質(zhì)子溶劑包含約98% 體積乙腈，且其中B相中極性質(zhì)子溶劑包含約95%體積甲醇。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中所述固定相的顆粒大小為約3 pm畫(huà) 約10 ixm。
12. —種用于從極性質(zhì)子單體和/或低聚物中分離和離析黃噪呤 的高效液相色鐠法，所述方法包括以下步驟a. 將包含黃嘌呤和極性質(zhì)子單體和/或低聚物的液體樣品？I入用 選自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三曱基甲硅烷基相、二甲基 甲硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、鹵化相和 硝基相的極性鍵合固定色譜相填充的液相色譜柱；b. 使基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的等度流動(dòng)相流過(guò)所述柱子， 以從所述單體和/或低聚物中分離出黃噪呤；和c. 洗脫包含黃嘌呤的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述黃嘌呤為咖啡因和可可堿。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述液體樣品為脫脂可可提取物。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述固定相為二醇相或甘油相。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中所述等度流動(dòng)相為含水相。
17. 權(quán)利要求12的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑為乙腈。
18. 權(quán)利要求12的方法，其中等度流動(dòng)相中極性非質(zhì)子溶劑的 比例為至少90%體積。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中等度流動(dòng)相中的極性非質(zhì)子溶劑 基本由約99%體積乙腈組成。
20. —種用于分離和洗脫黃噤呤和單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低 聚物的高效液相色謙法，所述方法包括以下步驟a. 將包含黃嘌呤和極性質(zhì)子單體和/或低聚物的液體樣品《1入用 選自二醇相、甘油相、氨基相、氰基相、三曱基甲硅烷基相、二甲基 曱硅烷基相、丙基相、丁基相、戊基相、己基相、苯基相、囟化相和 硝基相的極性鍵合固定色譜相填充的液相色譜柱；b. 使基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的等度流動(dòng)相流過(guò)所述柱子， 以從所述單體和/或低聚物中分離出黃噤呤；c. 洗脫包含黃嘌呤的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分；d. 使包含基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的A相和基本由極性質(zhì)子 溶劑組成的B相的兩元流動(dòng)相流過(guò)所述柱子，以基于聚合度分離所迷 單獨(dú)的單體和/或低聚物；和e. 洗脫包含所述單體和/或低聚物的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)流分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于基于聚合度分離和離析單獨(dú)的極性質(zhì)子單體和/或低聚物的方法。將包含單體和/或低聚物的液體樣品引入用極性鍵合固定色譜相填充的液相色譜(LC)柱。通過(guò)兩元流動(dòng)相洗脫使所述單獨(dú)的單體和/或低聚物分離。所述單體和/或低聚物可為原花色素、可水解的單寧、寡糖、寡核苷酸、肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇或聚乙烯醇。所述兩元流動(dòng)相包含基本由極性非質(zhì)子溶劑組成的A相和基本由極性質(zhì)子溶劑組成的B相。本發(fā)明還公開(kāi)了用于分離和離析黃嘌呤(例如咖啡因和可可堿)的方法。將包含黃嘌呤和單體和/或低聚物的液體樣品引入用極性鍵合固定色譜相填充的LC柱。通過(guò)等度流動(dòng)相洗脫分離黃嘌呤，并洗脫單獨(dú)的流分。本發(fā)明還公開(kāi)了用于分離和離析黃嘌呤合極性質(zhì)子單體和/或低聚物的方法。在該方法中使用上述相。
文檔編號(hào)B01D15/08GK101355995SQ200680044033
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日
發(fā)明者C·J·約翰遜, M·A·凱姆, R·J·羅賓斯 申請(qǐng)人:瑪爾斯有限公司