專利名稱：：捕獲病毒用吸附膜的制作方法捕獲病毒用吸附膜MarkR.Etzel相關(guān)申請的交叉引用在此，要求于2006年7月14日提交的臨時申請序列號60/830,917的優(yōu)先權(quán)，其以引用方式并入本文。
背景技術(shù)：
：病毒清除對于制造安全的、來自生物技術(shù)的藥品(例如單克隆抗體(mAb)、重組蛋白、融合蛋白、血清和介質(zhì)等)是必需的。世界范圍內(nèi)的管理機構(gòu)要求從許多進入商業(yè)市場的產(chǎn)品中移除病毒污染物。納米級的病毒使將其從生物制藥的中間物分離變得復雜，因為病毒粒子(由于其大小)僅結(jié)合到色譜法珠子的表面。病毒粒子過大以致不能進入常規(guī)的色語法微珠的孔隙。因此，常規(guī)的色諳法珠子對于病毒的結(jié)合能力遠遠小于其對可進入并結(jié)合到孔隙中的雜質(zhì)的結(jié)合能力。色鐠法珠子本身為相對昂貴的商品。為了在峰值水平工作，珠子必須具有與嚴格控制的孔徑結(jié)合的非常接近的單分散粒徑。結(jié)果，色語法珠子被設(shè)計用于再生使得其可在許多純化循環(huán)方面被再利用(以使制造成本下降)。事實上，雖然這種方法的確使得材料成本處于在控制中，但其并非沒有缺點。最顯著地，當珠子被再循環(huán)時，病毒-配體結(jié)合必須為可逆的。簡而言之，一旦珠子被裝載達到其對病毒粒子的全容量，則必須將病毒粒子從珠子清除。樹脂清除和壽命確認成本(雖然比購買用于各個分離的新色鐠法樹脂便宜)相當大。對于病毒捕獲介質(zhì)仍有一個很久就已認識到但尚未滿足的需求該病毒捕獲介質(zhì)對捕獲病毒粒子具有高效率和高能力，并且在成本方面也足夠低使得其可被用作從生物制品移除病毒污染用的一次性、用完可拋棄的介質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容與珠子對比，吸附膜的整個表面可用于結(jié)合病毒。同時，膜對小的雜質(zhì)具有低的容量。吸附膜在制造方面也比孔隙度受控制的單分散5珠子便宜。病毒清除用吸附膜足夠便宜使得該膜可為一次性的。這樣，由于其不可逆的結(jié)合特性而被拋棄的用于色譜法珠子的配體候選物對于使用吸附膜的病毒清除是理想的候選物。因此，本發(fā)明包括使用在一定范圍的傳導率和pH值下不結(jié)合mAb但結(jié)合病毒粒子的配體。本發(fā)明的一個明顯優(yōu)勢為通過一次性膜吸附劑建立用于清除病毒的相等的一般性條件，新的mAb(和其他生物制品)的開發(fā)者將會引用項目成果代替進行昂貴且耗時的確認研究，從而節(jié)約資源并加速了治療產(chǎn)品對于美國保健消費者的可得性。、因此，本發(fā)明涉及一次性的病毒捕獲膜，其fe含一次性的微孔濾膜和固定在所述膜上的配體。所述配體經(jīng)尺寸化和構(gòu)造以不可逆地并有選擇性地結(jié)合病毒，并且同時具有足夠高的pKa值以通過靜電排斥作用排斥堿性蛋白(一般包括抗體并且特別是單克隆抗體)。優(yōu)選配體為多峰的陰離子交換酉己體(amulti-modalanion-exchangeligand)并且該配體在pH值為7時具有正電荷。該配體也優(yōu)選具有至少10.0的pKa值。濾膜本身可從任何適合的非活性材料制造。優(yōu)選所述膜可從聚合基體材料制造,例如選自聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚酰胺酰亞胺、聚砜、聚醚砜和聚苯砜的聚合物基體。優(yōu)選所述配體經(jīng)尺寸化和構(gòu)造以對設(shè)置在含至多50mM鹽、更優(yōu)選至多150mM鹽的溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少1.0的對數(shù)下降值(LRV)。更優(yōu)選所述配體經(jīng)尺寸化和構(gòu)造以對設(shè)置在含至多50mM鹽、更優(yōu)選至多150mM鹽的溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少5.0的對數(shù)下降值(LRV)。該配體可選自酪氨醇(tyrosinol)、色醇、章魚胺(octopamine)、2-氨基苯并咪唑、1,3-二氨基-2-羥基丙烷、三(2-氨乙基)胺和胍丁胺。三(2-氨乙基)胺和胍基丁胺是最優(yōu)選的。本發(fā)明還涉及使用本文所述膜以捕獲病毒從而將該病毒從溶液移除的相應(yīng)方法。因此，本發(fā)明還涉及從:故懷^是含有病毒的溶液中移除病毒的方法，該方法包括用病毒捕獲膜接觸被懷疑含有病毒的溶液，所述病毒捕獲膜包含一次性微孔濾膜和固定在所述膜上的配體，其中該配體經(jīng)尺寸化和構(gòu)造以不可逆地并有選擇性地結(jié)合病毒，并且該配6體具有足夠高的pKa值以通過靜電排斥作用而排斥存在于所述溶液中的堿性蛋白。對于膜本身如前面所提到的，在所述方法中優(yōu)選當溶液包含0至約50mM的鹽時，將該溶液與病毒捕獲膜接觸充足的時間以對于設(shè)置在該溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少1.0的對數(shù)下降值(LRV),并且還更優(yōu)選當溶液包含0至約150mM的鹽時，對于設(shè)置在該溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少1.0的對數(shù)下降值(LRV)。還更優(yōu)選當溶液包含0至約50mM的鹽時，將該溶液與病毒捕獲膜接觸充足的時間以對于設(shè)置在該溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少5.0的對數(shù)下降值(LRV),并且還更優(yōu)選當溶液包含0至約150mM的鹽時，對于設(shè)置在該溶液中的中性病毒產(chǎn)生至少5.0的對數(shù)下降值(LRV)。雖然濾膜可從任何現(xiàn)在已知或在將來發(fā)展的非活'卜生微3L濾膜材料制造，但其優(yōu)選包含聚偏二氟乙烯(PVDF)。示例性濾膜材料包括(但不限于)PVDF(例如，"KYNARFLEX"⑧牌PVDF，可得自Arkema公司，KingofPrussia,PA)、聚四氟乙烯(PTFE)、其他氟化聚合物、聚酰胺(例如，尼龍)、聚酰胺酰亞胺、聚砜、聚醚砜、聚苯砜等。圖1的曲線圖描繪了對于無量綱的傳質(zhì)單元(transferunit)數(shù)"n"的各種取值使用等式1預測的穿透曲線。"n"的值越大則產(chǎn)生越尖銳的穿透曲線。圖2的曲線圖描繪了使用等式5預測的作為分數(shù)未混合體積("x")的函數(shù)的穿透曲線，其中v為系統(tǒng)平均停留時間。圖3的曲線圖描繪了對于疊加到單獨使用等式5與結(jié)合使用等式5和6的擬合曲線上的非結(jié)合性示蹤劑的實驗穿透曲線。圖4的曲線圖描繪了對于疊加到使用等式1的擬合曲線上的a-乳白蛋白的實驗穿透曲線。圖5的曲線圖描繪了對數(shù)下降值(LRV)作為噬菌體^X174在25mMTris中、pH值為8.1、以每小時3，400的膜體積流動速率下的通過量的函數(shù)。圖6的曲線圖描繪了當吸附為可逆的(產(chǎn)l)和不可逆的(產(chǎn)無限大)時，相對于用于捕獲病毒的吸附膜的通過量參數(shù)(T)計算出的LRV的下降。不可逆吸附被期望用于病毒移除，因為LRV在任何給定的通過量下更大，并且當吸附為不可逆而不是可逆的時，通過量在給定的LRV下更大。圖7為多峰的配體結(jié)合的示意圖。圖8的曲線圖描繪了"MUSTANG"Q牌薄膜過濾器的對數(shù)下降值(Y-軸)作為通過量(X-軸)和鹽濃度(令二0mMNaCl;▲=50mMNaCl;■=150mMNaCl)的函數(shù)。"MUSTANG"是紐約州EastHills,Pall公司的注冊商標。對于詳述參見實施例1。圖9的柱狀圖描繪了在表2中列出的各配體結(jié)合陰離子染料和帶負電的蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白、BSA)的容量。對于詳述參見實施例2。圖10的曲線圖描繪了包含固定的配體胍基丁胺的病毒捕獲膜從包含堿性蛋白(0.5g/L核糖核酸酶)和不同濃度的鹽(令二OmMNaCl;▲=50mMNaCl;B二150mMNaCl)的溶液中移除中性病毒(cpX174)的性^匕fi匕。具體實施例方式大部分的色譜法分離均利用填充有珠子的柱。珠子直徑為重要因素小的珠子導致了快的擴散時間和大的理論板數(shù)，但也產(chǎn)生高的壓降。大的珠子被用于工藝級的分離中以允許增加流動速度而不致產(chǎn)生高的壓降以及最終的床壓縮和最終的填塞。然而，大的珠子具有長的擴散時間、低的板數(shù)和低的動態(tài)容量。在1988年，膜色鐠被首次引進作為克服柱層析的局限性的手段(Brandt等人，1988年)。包含固定的配體的微孔膜被用作色譜介質(zhì)。因為所述膜薄(0.1mm),壓降局限性并不顯著。擴散局限性被消除，這是因為溶解物通過對流而非擴散而被傳送過膜的孔。第一裝置為中空纖維膜，其中表面被活化以用于親和性配體附著。自從1988年就已發(fā)展了膜色譜。一些膜色語的綜述詳細說明了多年來技術(shù)的進展。(參見例如Etze12003年、Ghosh2002年、Zeng等人1999年、Charcosset1998年、Roper1995年、Thommes1995年)。單層的、中空纖維的裝置由于性能差而被放棄。親和色語法被作為主要配體類型的離子交換色語法所代替。供應(yīng)商的宣傳已從蛋白質(zhì)純化轉(zhuǎn)變成諸如質(zhì)粒DNA、病毒和非常大的蛋白質(zhì)O250kDa)的大生物分子的8純化，其中色語法珠子具有低的容量。例子有諸如病毒清除和純化基因治療載體的應(yīng)用。對于膜色譜產(chǎn)品已出現(xiàn)三個主要供應(yīng)商Millipore公司(貝德福德，MA,美國，"INTERCEPT"⑧牌產(chǎn)品)、Pall生物制藥公司(EastHills，NY,美國，"MUSTANG"⑧牌產(chǎn)品)和SartodusAG(哥廷根，德國，"SARTOBIND"⑧牌產(chǎn)品)。本文中給出了適用于膜色譜的原理和實驗方法以更全面地公開本發(fā)明。在填充有珠子的柱上的膜色譜法具有兩個主要優(yōu)點(l)傳質(zhì)的限制被減少或消除，導致溶解物快速結(jié)合到膜表面上的配體位點；以及(2)低跨膜壓降。對于將通過膜表面上的結(jié)合位點而捕獲的目標溶解物，該溶解物必須流入孔結(jié)構(gòu)、擴散到孔的壁上并結(jié)合到配體。該過程的結(jié)果為通過膜的溶液(流出物)與進料溶液相比溶解物濃度下降。穿透曲線(BTC)為流出溶液中的溶解物濃度與時間或流出物體積的關(guān)系圖線。理想的BTC是尖銳的，這意味著沒有溶解物從流出溶液中流出直到膜達到飽和為止，在該時間點流出溶液中的溶解物濃度與進料溶液中的濃度相同。情況不是如此的程度為慢吸附動力學、慢傳質(zhì)和流動系統(tǒng)中混合的影響的度量。流動速率越快，則BTC將更可能變寬。結(jié)合描述BTC尖銳性，以下段落介紹了傳質(zhì)、吸附動力學和子流動系統(tǒng)中混合的原理。對于不存在膜中的軸向分散、傳質(zhì)限制和流動系統(tǒng)中混合時的不可逆吸附情況，可以推導出BTC的簡單代數(shù)模型(Heister&Vermeulen,1952年)。該才莫型衍自使用Langmuir吸附動力學作為本構(gòu)關(guān)系的連續(xù)方程C"(i-r)(1)其中C=c/co,C二流出濃度，Cf進料溶液濃度，11=無量綱的傳質(zhì)單元數(shù)，以及丁=無量綱的通過量。膜中的軸向分散通?？珊雎裕⑶也豢赡嫖綄τ诠に嚰壍鞍踪|(zhì)純化(processscaleproteinpurification)而言通常為好的近似，因為平衡解離常數(shù)對于緊密結(jié)合而言小，并且co是大的。因此，比率co/Kd接近無限大，并且吸附基本上為不可逆的。用于不可逆吸附(c。/K^〉l)的參數(shù)T由下式給定9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(2)其中s為膜的空隙份數(shù)，并且Cl為基于膜的固體體積的膜的總配體容量。通過量參數(shù)為膜的加載量的度量。其為通過進料溶液加載到膜中的溶解物的量與可結(jié)合到膜的溶解物的最大量之間的比率。無量綱時間被定義為r二vt/L,其中v為間隙液體速度，L為膜厚度，以及t為時間。參數(shù)n(傳質(zhì)單元數(shù))由下式給定<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(3)其中ka為溶解物與配體的締合速率常數(shù)(associationrateconstant)。參數(shù)L/n為傳質(zhì)單元高度，相當于等同于通常在色語文獻中發(fā)現(xiàn)的理論塔板(HETP)的高度。當n大，或HETP小時，穿透曲線和洗脫峰是尖銳的。對于圖1中n的各值繪制式(l)。當n=20-25時，BTC尖銳度合理。當n為50及以上時，增加得程度不大。增加n需要高容量(d)、快的締合速率常數(shù)(ka)以及膜中的長停留時間(L/v)。如果期望高流速，如同通常情況一樣，則一個或多個其他參數(shù)值必須具有大的值。因此，大部分色鐠膜使用離子交換結(jié)合(高ka)、高配體密度(高d)和數(shù)個層(高L)以在高流速(高v)下達到尖銳的BTC。從等式(l)的推導中產(chǎn)生的不可逆吸附的假設(shè)對于CQ/Kd接近無限大的值是有效的。對于c。/Kd足夠大時實際截取值被確定為cQ/Kd>60,其通過以下標準設(shè)定對于c。/Kd的有限值，等式(1)落在C為0.1時的精確解的95%之內(nèi)。換句話說，對于C為0.1的精確解^L用于尋找T,然后在該T處從等式(1)得到的C值必需在精確解的95%之內(nèi)。為了消除傳質(zhì)影響，膜中的停留時間(L/v)必須遠遠大于從膜孔的中心擴散到壁的時間尺度其中dp為孔的直徑，并且D為溶解物的擴散系數(shù)。當膜薄(小L)、孔大(大dp)并且在高流速(大V)下操作時，則情況并不常常如此。大部分的膜色譜系統(tǒng)以1-10秒的停留時間運行。當停留時間為約1秒或以上時，小于lpm的膜孔徑消除對于大蛋白的傳質(zhì)限制。然而，一些膜的孔徑為約5pm,在這種情況下，則需要約100秒或以上的停留時間以獲得對于大蛋白的尖銳的BTC。對于諸如質(zhì)粒DNA和病毒的極大生物分子，甚至需要更長的停留時間，因為D更小。作為經(jīng)驗法則，D大致與分子質(zhì)量的1/3冪的倒數(shù)成比例。因此，分離小蛋白(例如a-乳白蛋白(14.4kDa,D=l.lxl(T6cm2/s))的系統(tǒng)可以比分離大蛋白(例如曱狀腺球蛋白(660kDa,D=2.5xl(T7cm2/s))的系統(tǒng)以更高的流速運行。一些例子說明了等式(4)的用途。當《-乳白蛋白和曱狀腺球蛋白被捕獲到孔徑dp為0.65nm、堆疊(stack)厚度L為0.098cm的色譜膜上并以4.9xl(r3cm/s的速度v運行時，BTC是尖銳的(Yang等人，2002年)。一方面，用于擴散的時間尺度(對甲狀腺球蛋白為4ms和對于"-乳白蛋白為lms)遠遠小于膜中的停留時間(LA^20s)。另一方面，當甲狀腺球蛋白被捕獲到在孔徑為5nm、堆疊厚度為0.06cm的色譜膜上并以4.2xl(T2cm/s的速度運行時，BTC寬。在這種情況下，用于擴散的時間尺度(0.25s)非常接近膜中的停留時間(L/v=1.4s)。即使在停留時間為14秒時，BTC對于該系統(tǒng)仍不是尖銳的，這表明了膜中的停留時間需要遠遠大于用于擴散的時間尺度以獲得尖銳的BTC。寬的BTC可單獨起因于在泵、管、配件、膜夾持器、膜的堆疊件和檢測器系統(tǒng)中的液體混合。例如，如果流過膜的液體具有不同的停留時間(例如通過中心的更短的時間和通過邊緣的更長的時間)，則其將使BTC變寬。描述膜色譜法中流動系統(tǒng)中混合的最簡單模型為連續(xù)攪拌槽反應(yīng)器(CSTR)和理想栓塞流反應(yīng)器(PFR)的串聯(lián)結(jié)合(IO):c=1—exp(_^_^z),l一x(5)其中Tsys為系統(tǒng)中的無量綱平均停留時間，以及x為PFR體積分數(shù)(x=在延遲時間等于來自死體積的XTsys后，等式(5)可被用于預測對于非結(jié)合性示蹤劑的BTC。在該時間前(T<xisys)，C等于O(圖ii2)。通常，流動系統(tǒng)中混合并非決定BTC形狀的重要因素，因為XTsys與穿透點處的r值(在OO.l時定義)相比較小。下面的例子說明了如何進行實驗并分析結(jié)果。數(shù)據(jù)取自通過陰離子交換膜捕獲小蛋白O-乳白蛋白)的文獻(Yang等人，2002年)。平板狀聚偏二氟乙烯膜(?；溥蚧罨?DURAPORE"牌膜，Millipore,貝德福德，MA)與2-氨基-乙基三甲基氯化銨進行反應(yīng)以制造陰離子交換膜。這些膜為140pm厚并且具有0.65pm的孔徑、155cm2內(nèi)表面積/cn^正面和r0.7的空隙分數(shù)。將這些夾在上游和下游各2個空白膜之間的直徑為25mm的膜的7層堆疊件(總共11個膜盤)放置到膜夾持器中?？瞻啄び兄诹鲃臃植?。蛋白質(zhì)溶液(在50mMTris中的0.05g/Loc-乳白蛋白，pH值為8.3)被以lmL/分的流動速率加載到膜堆疊件中，并且相對于時間測量流出溶液在280nm的吸光度。通過加載非結(jié)合性示蹤劑(在50mMTris中的0.05g/L的a-乳白蛋白,2MNaCl,pH值為8.3)測量流動系統(tǒng)中的混合。對于加載非結(jié)合性示蹤劑的響應(yīng)使用等式(5)擬合，導致PFR體積分數(shù)x《.67以及對于該系統(tǒng)的無量綱停留時間Tsys=9.4(參見圖3)。為了從原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生該圖線，對于僅使用緩沖液而不使用蛋白質(zhì)的基線(V肌)和繞過膜夾持器時的進料溶液(VFS)測定來自檢測器的電壓信號。然后使用等式C=(V-Vq)/(Vfs-Vo)將來自BTC的電壓信號轉(zhuǎn)換成C。該變換假設(shè)吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，這對如同該例子(Cf0.05g/L)的情況的稀釋蛋白質(zhì)溶液((^2g/L)為有效的假設(shè)。X軸通過使用4.85xl(T3cm/s的v值(v-Q/sA,其中Q-lmL/分鐘，s=0.7,以及A二4.91cm2)和0.098cm的L(=7x140nm)將時間轉(zhuǎn)換成無量綱時間t(=vt/L)而獲得。上述x和T^的值可使用微軟Excel軟件中的SOLVER功能而獲得以最小化模型和數(shù)據(jù)間的差的平方的總和(最小二乘方法)。另外的可能更精確的方法是使用下式從數(shù)據(jù)的第一矩(moment)獲得Tsys:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>°(6)隨后Tsys的該計算值被與等式(5)—起使用以通過在Excel中使用x2007800作為唯一的擬合參數(shù)值而擬合數(shù)據(jù)。使用該方法，Tsys=10.3和x=0.638。該結(jié)果也在圖3中被繪制并且?guī)缀跖c笫一種方法相同。通常，不是直接報導液體體積而是通過除以膜體積而使體積規(guī)一化。這使得結(jié)果無量綱并且與比例尺無關(guān)。然后，體積稱為"膜體積"。例如，為了規(guī)一化流出的液體體積并以膜體積表示其，用其除以膜體積(流出物體積)+(膜體積)=st。當系統(tǒng)體積被規(guī)一化并以膜體積表示時，其等于對于這些數(shù)據(jù)，STsys^2膜體積(Yang等人，2002年)。其中，等于4.6膜體積的xs"Csys為PFR部分，其包括用于7層膜的堆疊件的i膜體積，并且等于2.6膜體積的(l-x)STsys為CSTR部分。1膜體積在該實驗中等于0.481mL。最后，如果在穿透點(€=0.1)處的1值遠遠大于等于6.3-6.6的XTsys,則流動系統(tǒng)中的混合可被忽略。為了忽略傳質(zhì)影響，等式(4)必須被滿足。對于本文所描述的實驗系統(tǒng)，L/v=20s，并且等式(4)的RHS為lms=。因此，用于膜中對流的時間尺度為用于邊界層傳質(zhì)到孔壁的時間尺度的20,000倍大，并且傳質(zhì)可被安全地忽略?；谠撚嬎?，比lmL/分更大、可能甚至200mL/分的流動速率可能已被使用并且還不具有傳質(zhì)限制。因此，雖然使用的流動速率為每小時125膜體積，但也有可能使用每小時25,000膜體積而不遭遇傳質(zhì)限制。使用填充珠子的床的柱色語法通常以每小時30柱體積的流動速度運行，該流動速度遠遠低于可能使用膜色鐠法的流動速度。圖3示出了對于a-乳白蛋白的實驗BTC。穿透點(。=0.1)在1=93.6時發(fā)生。該值為XTsys的14-15倍，這意味著流動系統(tǒng)中的混合可被忽略作為決定BTC形狀的因素。穿透點在66膜體積(n)處發(fā)生。膜的動態(tài)結(jié)合容量則為STCo或3.3mg/mL(以由每毫升膜結(jié)合的毫克數(shù)表示)。為了使等式(l)擬合BTC,臨時假設(shè)兩個未知量(k2和Cl),從而使用等式(2)計算T和使用等式(3)計算n。已知道其他參數(shù)值(s、Cq、v、L和t)。利用T和N的臨時值，使用等式(1)計算C。接著利用ka和d作為擬合的參數(shù)，使用Excel中的SOLVER最小化C的計算值和觀測值間的差的平方。發(fā)現(xiàn)溶液的ka=1900M"s"、并且c!=0.00085M。n值為14。對于c產(chǎn)0.00085M的擬合值以由每升膜固體體積結(jié)合的a-乳白蛋13白摩爾數(shù)表示。膜的固體體積除以膜的總體積等于(1-S)。因此，膜容量的擬合值當以質(zhì)量和總的膜體積(=(l-s)Cl)為基礎(chǔ)表示時為3.7mg/mL。該值密切相應(yīng)于從上述穿透點測定的3.3mg/mL的值。最后，擬和的和觀察的結(jié)合容量相配，這提供了模型和擬合的參數(shù)值的驗證。BTC是不對稱的。相反，BTC首先向C=0.6-0.8急劇上升，然后向C=1.0(但從未到達)緩慢上升(參見圖4)。成功地將膜色譜系統(tǒng)按比例縮小和按比例擴大需要精確的、有科學依據(jù)的模型。等式(l)-(6)可被用于該目的。為了獲得相等的BTC性能(C與時間的關(guān)系相同)，n和T值必須在針對小規(guī)模和大規(guī)模的每一時間點匹配，并且流動系統(tǒng)中的混合(x和Tsys)必須相同或小到足以忽略。當相同的膜材料和原料流被以大規(guī)模和小規(guī)模使用時，諸如co、s、Cl、ka、dp和D的參數(shù)將最可能是常數(shù)。然而，v、L、X和T，可能不是常數(shù)，因為流動速率、膜堆疊件中的層數(shù)和流動系統(tǒng)中混合的程度可隨著規(guī)模的增加而增長。然而，如果L/v保持不變，并且流動系統(tǒng)中的混合被驗證是可忽略的，則預期在不同規(guī)模時具有相等性能。然后，電壓偏差在運行參數(shù)(c。和v)和膜色譜裝置參數(shù)(s、Cl、ka、dp和L)中的影響可使用模型進行評價，并且可被用于避開其中性能太敏感而不能正常變化的區(qū)域。如前面所述，對于在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)被病毒污染的可能性是需要監(jiān)管問題。步驟被明確地包括在下游處理中以滿足監(jiān)管要求；包括從蛋白質(zhì)產(chǎn)品清除任何潛在病毒污染的冗余和補充的單元操作。對于病毒清除應(yīng)用，性能通過僅為LRV=-Log!Q(C)的對數(shù)下降值(LRV)進行測量。對于陰離子交換柱色謙法的典型的LRV值為LRV=4-6(Curtis等人,2003年)。從等式(l)的推導中產(chǎn)生的不可逆吸附的假設(shè)對于上述Co/Kd接近無限大的值是有效的。這在其中進料溶液濃度大的工藝級蛋白質(zhì)分離中對于BTC是好的假設(shè)。相反，在病毒清除操作中，進料溶液通常包含極小濃度的病毒(pM-nM)。因此，取決于Kd值，下列兩種限制情況是可能的(l)cQ/Kd>〉l和不可逆吸附；以及(2)co/Kd"^和線性吸附。對于不可逆吸附，其中c。/Kd接近無限大，發(fā)現(xiàn)對于co/Kd足夠大時的實際截取值為cG/Kd>30,其通過設(shè)定的下列標準進行測定等式(l)落在LRV=4時的精確解的95%內(nèi)。對于不可逆吸附而言LRV、T和n之間的數(shù)學關(guān)系可衍自等式(l):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>等式(7)顯示出隨著T的增加，LRV呈線性下降。該圖線的斜率為約-n/ln(10),并且y截距為約n/ln(10)。參見圖6。對于不可逆吸附，等式(2)可被重新整理以得到當1>>1時以參數(shù)T的任何值處理的膜體積的數(shù)(st):6T不可逆n(8)等式(8)中的參數(shù)T為對加載到膜中的材料的相對量的無量綱度量。T=0.0相應(yīng)于進料溶液剛開始在膜的出口處顯現(xiàn)的點。丁=1.0相應(yīng)于加載到膜中的總質(zhì)量等于總膜容量的點。對于無限尖銳的BTC(n^°°),T=1.0也相應(yīng)于膜的100%飽和。然而，這是不切實際的。用于操作的實際目標可通過等式(7)的檢查(examination)而發(fā)現(xiàn)。實際上來說，結(jié)合大加載容量的LRV二4適用于大部分應(yīng)用。例如，本文所迷的實驗在T=0.08和n=10或T=0.90和n=90處達到LRV=4。因此，希望具有大的n值，因為可達到更大的通過量(更大的T),同時還達到LRV=4。為了在LRV=4.0時獲得90%的飽和容量(丁=0.9)，等式(7)顯示出90%的飽和容量需要達到n值等于92。從等式(3)，達到n=92需要高容量(d)、厚的膜堆疊件(L)、低流動速率(v)和快速吸附速率常數(shù)(ka)。例如，對于在部分3中分析的膜系統(tǒng)，不變的膜參數(shù)為ka=1900M"s"、c!=0.00085M和s=07。因此，為了達到上述目標(在丁=0.9時，LRV-4)需要LA^133s。該停留時間比用于實驗的時間(LA^20s)更長。該例子說明了一般的經(jīng)驗法則與達到用于病毒清除的目標LRV相比，更易于獲得對于蛋白質(zhì)純化的尖銳的BTC。對于其中cQ/Kdl的線性吸附情況，等式(l)不是有效的。在這種情況下，BTC由下式給定15C=1-exp(-wr)J"exp(-7)/0(2^/7"T)匈,。(9)其中Io為零階修正貝塞耳函數(shù)。導致LRV=4的n和T值可從等式(9)計算出。通常，當對于n的任何給定值LRV=4時，T的相應(yīng)值在線性吸附情況中比在不可逆吸附情況中更小。換句話說，如在等式(7)的不可逆吸附情況中一樣，對于線性吸附情況的LRV僅取決于n和T,但對于線性吸附情況的LRV值通常在n和T的給定值下更小。只有當T=0時，對于線性吸附情況的LRV等于對于不可逆吸附情況的LRV。這是因為當T=0時，等式(9)降至C=exp(-n)(由于10(0)=1)，并且LRV=n/ln(10)，這和當T=0時的等式("的結(jié)果相同。T的定義對于線性吸附情況是不同的(l一s)c'(r一l),(10)其中Kd為離解平衡常數(shù)，等式(10)可被重新整理以計算當1>>1時以T的任何值處理的進料溶液的膜體積線性從等式(ll)我們可以看出，對于線性情況而言以T的給定值處理的進料溶液的體積完全和進料溶液濃度無關(guān)，然而對于不可逆吸附情況，如在等式(8)中所述其與進料溶液濃度成逆相關(guān)。同樣，由于對于線性吸附情況Kd>>Co,因此以st或T表示的通過量與對于不可逆吸附情況相比將更低。從控制的觀點來看，如果膜色譜產(chǎn)品對于固定濃度(co)、加載體積(st)和停留時間(L/v)的具體進料溶液;故顯示達到LRV=4,則該LRV對于更小的加載體積、更長的停留時間或更稀釋的進料溶液將超過4。對于病毒清除用的膜色語系統(tǒng)的驗證應(yīng)利用測量隨著時間流逝的流出物分數(shù)的LRV而不是整個流出物池的LRV,并且LRV對T的趨勢可被測定以有助于設(shè)定允許的操作限制。從膜設(shè)計的觀點來看，我們已設(shè)定了上述目標(LRV二4.0和T=0.9)，但仍需要設(shè)定一些另外的約束以完全限定問題。例如，什么樣的流動速率和容積通過量與竟爭技術(shù)相比將是有吸引力的？解答該問題的一個方法是從商業(yè)上成功的病毒過濾系統(tǒng)獲取用于流動速率和容積通過量的值。應(yīng)該指出的是病毒過濾通過篩選裝置移除病毒，這與用于膜色譜法的吸附機制完全不同。然而，病毒過濾膜的性能能力也可被用作膜色譜系統(tǒng)用目標。商業(yè)上成功的病毒過濾系統(tǒng)為得自Millipore(貝德福德，MA)的"VIRESOLVE"⑧牌過濾器。這些過濾器當以150L/m2-h的流動速率、300L/m2的通過量和2.0bar的壓降運行時，對于噬菌體cpX174可達到LRV=4.0(MilliporeTechnicalBrief2000)。該流動速率和通過量目標對于膜色譜系統(tǒng)分別相應(yīng)于svmm=4.2x1(T3cm/s和STmin/Lmm=30cm。膜色譜的一個優(yōu)點是較低的壓降。在2.0bar處，當基于紀錄的水壓滲透性L=6.2cm時，前面分析的膜系統(tǒng)會達到目標流動速率(Phillips等人，2005年)。因此，壓降不是限制。等式(7)和(8)可用于不可逆吸附的情況，等式(3)用于在通過滿足上述設(shè)定的對流動速率(svmm=4.2xl(T3cm/s)、通過量(STn^:Un=30cm)和病毒清除(LRV4.0)的目標而限制的條件下計算最小L。上述數(shù)據(jù)被用于舉例說明這些計算。滿足該流動速率和病毒清除目標所需的L皿n值，通過以下方法得到將LRV二4.0和T^.9代入等式(7)以獲得r^92,然后將其與sv,=4.2xl(T3cm/s—起代入等式(3)以解答Lmm。滿足通過量目標所需的L誦值通過將ST腿L腿叫0cm代入等式(8)的LHS中而得到。為了滿足通過量需求，膜必須具有Lmm=0.46cm。然而，該值太小以至于不能滿足LRV4.0的病毒清除目標，其需要Lmin=0.8cm。因此，比Lmm=0.8cm更厚的膜堆疊件將超過上述設(shè)定的目標。本文概述的原理可用于指導病毒清除用膜色譜系統(tǒng)的設(shè)計。期望的系統(tǒng)參數(shù)包括(1)高的膜容量c"(2)厚的膜堆疊件L、(3)稀釋的進料溶液co和(4)快的締合速率常數(shù)ka。這是在不可逆吸附的情況。對于線性吸附情況溶液略有不同。在這種情況下，Kd必須是已知的，等式(ll)開始發(fā)揮作用，并且進料溶液濃度不影響性能。實際上，上述目標(在T=0.9時，LRV二4)在線性吸附的情況下不能獲得，這是因為當對于n的所有合理取值LRV等于4時，T<0.9。因此，通過量T在n和LRV的給定值下較小，并且與不可逆吸附情況相比，對于線性吸附情況在n和T的給定值下LRV更小。在線性吸附情況中，n值可被選擇并且當LRV二4時，測定T值。從等式(3)計算滿足病毒清除目標的L值，并且從等式(ll)計算滿足流動速率目標的L加n值。模型可被用于分析取自文獻(13)的數(shù)據(jù)，其中對于類似于上文所述膜色譜系統(tǒng)的膜色譜系統(tǒng)，測量LRV。圖5示出了通過量(=8"0對于cpX174的LRV的影響。在該實驗中的進料溶液非常稀1.5x107pfu/mL(co。lxlO-"M)。膜容量據(jù)說為d=0.0058M,其使用甲苯磺酰谷氨酸進行測量，并且L=0.1cm,以及^0.7。從這些值，等式(2)中的參數(shù)T可被計算出T4xl0-u。本質(zhì)上，由等式(7)，T-0并且LRV二n/ln(10)。因此，LRV并不取決于通過量T,并且這可能是為什么在圖5中觀察到不取決于T。如前所述，病毒清除在制造諸如單克隆抗體(mAb)的來自生物技術(shù)的藥品中是必需的。單克隆抗體制備目前是美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)增長最快的部分，30%的年增長率和在2004年超過70億美元的年銷售額(Das2003)。世界范圍內(nèi)的管理機構(gòu)(包括美國食品與藥物管理局(FDA))在新的生物制藥產(chǎn)品被批準以供人類使用前要求證明沒有病毒污染。參見Fed.Reg.63，51074-51084(1998年)。確保病毒安全的關(guān)鍵組成部分包括特定的病毒移除步驟(例如過濾)，以及測量病毒移除方案的清除容量和穩(wěn)健性的小規(guī)模研究。響應(yīng)近來新藥物審批的平穩(wěn)期，F(xiàn)DA已確定了可加速藥物開發(fā)關(guān)鍵路徑的一系列重要研究目標。制造科學的現(xiàn)代化(包括發(fā)展改善的病毒安全策略)在該目標的列表上位置靠前。納米級大小的病毒粒子使將其從生物制藥過程中間物分離成為具有挑戰(zhàn)性的制造問題。病毒粒子僅結(jié)合到常規(guī)的色語法珠子的表面，因為其過大以致不能進入孔的細網(wǎng)絡(luò)(Endres等人，2003年；Yamamoto等人，1999年；Lyddiatt和O，Sullivan,1998年)。因此，多孔珠對病毒粒子的結(jié)合容量遠遠低于其對可進入珠子全容積的更小分子的結(jié)合容量。該現(xiàn)象引起了奇怪的問題色譜法珠子對小雜質(zhì)、宿主細胞蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的結(jié)合容量遠遠大于其對更大的目標病毒粒子的結(jié)合容量(Yang等人，2003年)。病毒粒子以與結(jié)合到珠子相同的方式也僅結(jié)合到膜的表面。然而，膜具有比珠子大得多的可用表面積。例如，與裝填有珠子(直徑為1890pm)的柱的約0.11m2/mL相比，微孔膜的內(nèi)表面積為約l.lm2/mL(Soltys和Etzel，2000年)。簡而言之，膜的表面積比珠子的大一個數(shù)量級。此外，膜的吸附容量隨著被吸附的粒子大小的增加而增加，因為粒子越大，則在膜表面上形成的層越厚(Endres等人，2003年)。凈效應(yīng)是吸附膜對大的納米級粒子具有相對高的容量以及對小的分子具有相對低的容量(DePalma,2003年)。這和珠子的情形完全相反。因此，當待捕獲的粒子尺寸增加時，與珠子相比，使用膜的相對優(yōu)點顯著增加。這使得吸附膜非常適用于病毒清除。常規(guī)的色語法珠子被設(shè)計用于蛋白質(zhì)分離，而不是病毒分離(Lyddiatt和O，Sullivan，1998年)。吸附膜具有成本低、體積小和可一次性的優(yōu)點。相反，珠子被設(shè)計用于多次應(yīng)用。因此，工藝經(jīng)濟鼓勵珠子的再循環(huán)，通常數(shù)百次(以及有時數(shù)千次)的循環(huán)(O，Leary等人，2001年)。對于珠子的循環(huán)，再生是必需的。因此，固定在珠子上的配體必須可逆的結(jié)合其目標。對于珠子，樹脂清除和壽命確認成本相當大。這些限制對于吸附膜是不存在的，因為該吸附膜是一次性的并且無需可逆地結(jié)合病毒用于病毒清除應(yīng)用。由于不需要可逆結(jié)合，因此不可逆的、更緊密結(jié)合的配體是實用的。吸附膜的更高的動態(tài)容量減少了吸附劑體積，這需要更小的緩沖液體積、低耗的醫(yī)藥用水以及用于緩沖液槽和泵的更小的占地面積。這些優(yōu)點導致降低了設(shè)備成本，而后者是用于生物工藝的主要費用。"通過和處置"運作模式與色譜柱相比也減少了所需的設(shè)備空間，這消除了用于該單元操作的專用空間的需要。通過膜吸附體達到的功能強大、均勻且可預測的病毒清除使能夠建立一般性的和等同的驗證策略(genericandbracketedvalidationstrategies)(Anon.1997年)。FDA將一般性清除研究定義為如下情形在模型抗體的純化工藝中，用幾個步驟證明病毒移除和失活。然后，這些數(shù)據(jù)可依照相同的程序被外推到其他抗體。等同驗證方法是其中，對于具體模數(shù)，在給定參數(shù)(例如離子強度、駐留時間、溫度等)的兩個不同的值下證明病毒移除/失活，并且可使用落在該范圍內(nèi)的參數(shù)的任何值。兩個對于功能強大的病毒清除步驟(例如，低pH值滅活和陰離子交換色譜)的矩陣/等同研究的例子已被描述在文獻中(Brorson等人，2003年；Curtis等人，2003年)。功能強大的病毒移除單元操作的等同19性和一般性驗證被FDA提議以使用于臨床試驗階段mAb的總體病毒安全保證策略合理化和現(xiàn)代化。這些方法可消除多余的測試，在產(chǎn)品研發(fā)期間賦予靈活性，并且促進產(chǎn)品研發(fā)。因此，本發(fā)明具有許多優(yōu)點。例如，使用膜消除勞動密集型柱填充和驗證，減少占地面積和設(shè)備需求，并且由于合理化的法規(guī)遵從減少總成本。由于其費用，病毒移除驗證研究對于進行新型抗體早期階段研究的較小公司和獨立的學術(shù)調(diào)查人通常是絆腳石。制造大批單個或多個產(chǎn)品的大型生物技術(shù)公司也極大地得益于降低清除和介質(zhì)壽命驗證成本和減少使用的占地面積、緩沖部件、設(shè)備、槽和醫(yī)藥用水。表1-配體組<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>一個強陰離子交換部分(2-氨乙基三曱基氯化銨，AETMA)和兩個多峰部分(三(2-氨乙基)胺，TAEA;以及酪氨醇)用作配體例子(參見表1)。本發(fā)明的一個優(yōu)點是膜顯示出功能強大的病毒清除，即使存在相對高濃度的鹽的情況下(例如，150mM的鹽)。這對達到功能強大的病毒清除很重要，因為許多用于生物制藥制造的工藝溶液的導電性均在15-30mS/cm的范圍內(nèi)。多峰的配體為具有諸如氫鍵結(jié)合和使其更加耐鹽的疏水性交互作用的次級相互作用的陰離子交換劑(Johansson等人，2003年)。對照常規(guī)的Q配體(AETMA)測量耐鹽性，其在電導率是目標范圍的1/3-1/6的情況下迅速損失了對于一些病毒(例如，cpX174)的容量，例如在從0mM變化至50mMNaCl過程中使病毒清除從為六的對數(shù)下降值(LRV)下降至為一(1)的LRV(Phillips和Lutz,2003年)。Q配體對于病毒清除操作用陰離子交換色譜法是常見的選擇(Xu和Brorson,2003年;Curtis等人,2003年)。笫二配體TAEA為非芳香族陰離子交換配體，其在pH值為7時帶正電，引起了mAb的靜電排斥作用。TAEA的耐鹽性是Q配體的25倍(Johansson等人，2003年)。第三配體酪氨醇為被拒絕用于蛋白質(zhì)純化的配體的好的例子，但是該配體非常適合作為用于一次性的病毒捕獲膜的配體。Johansson等人(2003年)拒絕酪氨醇用于蛋白質(zhì)純化，因為"結(jié)果明確地證明芳香族陰離子交換劑具有過強的次級相互作用以致其實際上不能使用。"然而，"與最好的非芳香族陰離子交換劑相比，芳香胺導致更高的穿透容量"。酪氨醇的動態(tài)結(jié)合容量比五個最好的非芳香族陰離子交換配體的平均水平大63%,并且當在高鹽緩沖液(23mS/cm)中測試時是Q配體的36倍。酪氨醇^皮Johannson等人拒絕，因為其顯示出結(jié)合蛋白的回收率低。然而，對于一次性的病毒捕獲膜的基本目標與蛋白質(zhì)純化中的那些不同并且截然相反。在病毒捕獲(與蛋白質(zhì)純化相對比)中，將蛋白質(zhì)結(jié)合到過濾介質(zhì)(特別是mAb)必須被最小化。在病毒捕獲中，將病毒結(jié)合到過濾介質(zhì)優(yōu)選為不可逆的，因為無需回收結(jié)合的病毒。相反，在蛋白結(jié)合中，結(jié)合現(xiàn)象必須為可逆的或期望的蛋白不能被從柱洗脫。防止mAb結(jié)合可通過增加配體的pKa值使得mAb和配體在裝填期間均帶正電而實現(xiàn)。這引起了mAb從配體的靜電排斥(Boschetti,2002年；Morrow，2004年)。相反，病毒是帶負電或是中性的，并且結(jié)合到配體。例如，酪氨醇滿足這些需求。其具有10.8的pKa值，這使得其在pH值為中性時帶正電。大部分治療性mAb趨向具有在8-10之間的pl。該狹窄的pl范圍是因為治療性mAb趨向為人類IgGl或趨向極少程度的IgG4。由于抗體的V區(qū)域為總分子的小百分比，因此電荷很大程度上由同種型測定。因此，mAb在pH值為中性時帶正電，這防止其結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)(Curtis等人，2003年)。另一方面，病毒可具有多種pl并且許多具有負pl。用于本發(fā)明的多峰配體基于上述標準和結(jié)果進行選擇，即由于強pKa值(例如，>10)。配體,皮固定在樣i孔膜上并且含病毒的流體在病毒被配體捕獲的同時流過膜。包含結(jié)合病毒的膜是一次性的。如圖7所示，膜的表面(M)包含具有雙官能團的固定部分。一個官能團(X)帶正電荷以引起諸如單克隆抗體的蛋白質(zhì)的靜電排斥作用，該蛋白質(zhì)在pH值為中性時帶正電。另一個官能團(Y)提供固定的配體和病毒間的非靜電次級相互作用。兩個官能團與病毒和蛋白質(zhì)僅經(jīng)歷了非共價相互作用。該部分通過連接分子(L)固定到膜上，所述連接分子本身可增加這些官能團的一個或兩個。21對于部分X④，在pH值為中性時所期望的正電荷可通過pKa值為7或更大、優(yōu)選10或更大的胺而達到。例子為伯(RNH》、仲(R2NH)、叔(R3N)和季銨(R4N+)。對于部分Y,所期望的次級相互作用可來自非共價相互作用，例如路易斯酸-堿對、氫鍵結(jié)合、疏水相互作用、偶極子-偶極子吸引、誘導作用和分散力。例如，氬鍵相互作用源于強偶極子-偶極子交互作用，其中氫原子用作兩個電負性原子(通常為F、O或N)間的鍵。酰胺(RCK)NRH)是例子，因為共價結(jié)合到N原子的氫可與來自另一個酰胺的酰基上的O原子共享。疏水性交互作用可源于非極性基團，例如烷基部分(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、異丙基、異丁基等)和芳基部分(例如，苯基)。對于部分L,可使用原子或分子亞單位的鏈以將配體共價連結(jié)到膜。連接分子可包含具有1-20個碳原子的烷基鏈、具有1-15個糖基的碳水化合物鏈、具有1-15個糖基的葡聚糖鏈、具有1-25個氨基酸的氨基酸鏈、戊二醛、聚乙二醇、二縮水甘.油醚和本領(lǐng)域已知的其他連接化學物質(zhì)(HermansonGT、KrishnaMalliaA和SmithPK,ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,SanDiego,1992年)。膜可為任何微孔膜材料，其包括，但不限于纖維素、再生纖維素、二醋酸和三醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯。期望的膜孔徑為0.1-lOnm,并且0.5-1.5(im的孔徑是最理想的。期望膜具有用于內(nèi)孔結(jié)構(gòu)的高表面積，這通常相應(yīng)于細小的孔徑。然而，如果孔徑過小，則膜趨向填塞存在于進料溶液中的細微粒?？妆砻婊瘜W可被改性以包括聚合物涂層或刷子從而增加膜本身的基底材料上的容量。在這種情況下，上述配體化學會被應(yīng)用于聚合物涂層或刷子。本發(fā)明的一個實施方式是在相同的膜上分別粘附兩個配體官能團，如圖7所示。也就是說，配體X0和Y可通過分離的連接分子L而分別粘附到膜表面上互相鄰近的位置。然后，所述膜具有兩個期望的功能(l)耐鹽性，由于來自配體Y的強效非靜電次級相互作用，以及(2)諸如單克隆抗體的蛋白質(zhì)的靜電排斥作用，這是由于來自配體X@的同種電荷。本文公開的本發(fā)明的更廣泛的影響是影響關(guān)于生物制藥制造的監(jiān)22管政策。簡而言之，通過化工原理應(yīng)用于主要涉及州和聯(lián)邦監(jiān)管機構(gòu)的監(jiān)管問題，產(chǎn)生的結(jié)果可指導公共衛(wèi)生政策的決策。潛在的主要成果對于正在開發(fā)治療性mAb產(chǎn)品的學術(shù)中心和小型生物技術(shù)公司起到監(jiān)管免除(regulatoryrelief)的作用。通過膜吸附劑建立用于病毒移除的等同一般性條件，新的mAb的開發(fā)者將會引用項目成果代替進行昂貴且耗時的確認研究。資源將被釋放用于更富有成果的目的，促進了治療性mAb對于消費者的可用性。實施例以下實施例被包括僅為了更加全面地描述本文所公開并要求保護的本發(fā)明。實施例并未以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1:在病毒清除的領(lǐng)域中存在一個長期未解決的問題病毒清除用傳統(tǒng)的吸附膜產(chǎn)品不能從具有甚至中等鹽濃度的進料溶液移除中性病毒。耐鹽性在設(shè)計功能強大的病毒清除技術(shù)中是關(guān)鍵因素，因為許多用于制造生物制藥產(chǎn)品的工藝溶液必須包含鹽以最小化產(chǎn)品聚集。傳統(tǒng)的吸附膜產(chǎn)品利用用于結(jié)合病毒的季胺配體。"MUSTANG"Q牌產(chǎn)品為傳統(tǒng)的過濾膜的優(yōu)良例子，該過濾膜將非常易于移除具有極小鹽濃度的溶液中的中性病毒。舉例來說，"MUSTANG"⑧Q牌的膜將移除pH值為7.5的進料溶液中的中性病毒(cpX174,p^6.6)至為七(7)的對數(shù)下降值(LRV),但是這僅在所述溶液并不包含任何加入的鹽(NaCl)的情況下。參見圖8(-令-)。但是進行相同的分離、使用相同的包含50mMNaCl的進料溶液可將膜的LRV能力下降至基本上為零。參見8(-A-)。在150mM的NaCl情況下看見相同的影響。參見8(-園-)。簡而言之，在低鹽濃度下，病毒自由地通過"MUSTANG"Q牌吸附膜并進入產(chǎn)品。類似的結(jié)果已由其他人示出。例如，當將"MUSTANG"⑧Q牌吸附配體固定到購自Millipore的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上時，cpX174的病毒清除在將含鹽濃度從0增加到50mM鹽時從6LRV下降到小于lLRV(Phillips和Lutz,2003年)。這些結(jié)果的意義是在50mM-150mM范圍內(nèi)的鹽濃度在生物制藥加工工業(yè)中并不罕見。在這些實施例中，使用中性的病毒cpX174是因為它是通常用于過濾研究以表示對人類有害的潛在外源病毒的各種物理特性(例如，大小、pl、膜的存在或不存在)的五種模型的非病原性噬菌體病毒的一種。簡而言之，cpX174病毒是用于建才莫危險病原體的病毒清除的領(lǐng)域公認的病毒。目前用于生物制藥的病毒安全保證策略應(yīng)當排除病毒在進料溶液中的存在。細胞系和原材料的嚴格控制應(yīng)該也防止將病毒引入制造工藝。例如,參見在InternationalConferenceonHarmonisationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse(ICH)的支持下下于1998年9月發(fā)表的公文，標題為"GuidanceforIndustry:Q5A-VimlSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin"。(該文件被廣泛地在本行業(yè)中以"ICHQ5A"被提到)。然而，盡管最佳實踐貫穿制造工藝，但生物加工中的病毒污染基本上仍為可在加工中的任一點(例如，從污染原材料到污染包裝)發(fā)生的隨機事件。因此，不可能任何精確性地預測哪種病毒是下一種將引入制造工藝的。因此，制造商必須準備移除所有病毒，即使中性的病毒。實施例2:為了解決實施例1中說明的耐鹽性的問題，檢查八種(8)配體(表2)。使用兩種不同的功能測試對這些配體進行評價。在第一種功能測試中，用官能化的再生纖維素膜培養(yǎng)在pH值為6.0、含有和不含有加入的NaCl的20mM哌。桊中的牛血清白蛋白(BSA)。然后，使用2,2'-聯(lián)喹啉_4,4'_二曱酸(bicinchoninicacid)(BCA)比色法對結(jié)合的BSA進行測量。功能測試1在其中pH值接近蛋白的等電點的條件(BSA的p^5.1)下測量膜的靜態(tài)蛋白結(jié)合能力。在該功能測試中，蛋白僅具有微弱的電荷并且對外加鹽敏感。設(shè)計該第一種功能測試以模仿其中電荷弱的中性病毒的結(jié)合。功能測試2使用流動模式的官能化膜測量對于中性病毒cpX174的LRV,其中使用了TE緩沖液(10mMTris、lmMEDTA，pH值為7.5)并含有和不含有加入的NaCl。使用烯丙基縮水甘油醚將各配體固定在孔徑為0.45pm的再生纖維素膜上。然后將烯丙基化的膜溴化。最后，通過配體上的伯胺將配體連接到膜上。結(jié)果在表2中示出表2配體組配體結(jié)構(gòu)NaCl(mM)BSA靜態(tài)容量(mg/m2)cpX174LRV2-氨乙基三甲基氯化銨(AETMA)CH，H2NCH2CH2——N——CH3Cl.HCI5515042150106.60.10.1酪氨醇(TYR)638NH，502841501376.40,9色氨醇(TRP)668502971501311.11.0章魚胺(OCT)OH280502卯1502501.10.72-氨基苯并咪唑(ABI)414502041501081.81.025<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2中的第一種配體為用于現(xiàn)有產(chǎn)品如"MUSTANG"⑧Q牌膜的傳統(tǒng)的強陰離子交換部分[2-氨乙基三甲基氯化銨，AETMA]。如實施例1所預期，AETMA不耐鹽。其即使在中等鹽濃度的情況下仍迅速地損失針對病毒(cpX174)的容量。其他配體為耐鹽部分的例子，取自Johansson等人的把使用瓊脂糖色語法珠子進行蛋白質(zhì)純化(相對于病毒清除)作為目標的工作(2003年)。Johansson等人開發(fā)了用于使用可再生和可重復使用的瓊脂糖珠純化蛋白質(zhì)的耐鹽配體。然而，本工作的目標是不同的，因為待解決的問題是在制造工藝的過程中的病毒清除。該工藝必需簡單、可重復并且可證實正確的。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用一次性膜。還優(yōu)選病毒和膜間的結(jié)合性交互作用是不可逆的。最后，在本發(fā)明中，病毒被從工藝溶液選擇性地清除；所述膜并不結(jié)合治療性蛋白質(zhì)。換句話說，在本發(fā)明中，病毒被選擇性地并不可逆地捕獲到膜上，同時治療性蛋白質(zhì)把向物未被吸附到膜上。然后，拋棄廢膜以避免污染后續(xù)批次的治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品。也就是說，不是如在Johansson等人中那樣使用帶正電的配體以結(jié)合治療性蛋白質(zhì)，本發(fā)明使用了截然相反的方法使用配體上的正電荷以排斥帶正電的治療性蛋白質(zhì)，并且同時結(jié)合帶負電的病毒，從而將其從工藝料流中移除。參見圖9,各配體結(jié)合陰離子染料的容量與各配體結(jié)合帶負電的蛋白質(zhì)(BSA)的容量有很好的相關(guān)性。然而，各配體的病毒清除無法很好地通過染料容量或蛋白質(zhì)容量(表2)進行預測。另外，蛋白質(zhì)結(jié)合容量的耐鹽性與針對病毒清除的耐鹽性并不很好地相關(guān)。簡而言之，圖9所示的結(jié)果是相關(guān)的，因為其證明了膜的耐鹽病毒結(jié)合特性無法從相同膜的蛋白質(zhì)結(jié)合容量預測。例如，非芳香族配體TAEA、DHP和AGM對染料和BSA均具有類似的容量。參見圖9。但是TAEA的病毒清除遠遠大于對于DHP或AGM的病毒清除(參見表2)。此外，BSA容量的耐鹽性對于TAEA、DHP和AGM是相似的，但是就病毒清除的耐鹽性而言，DHP比TAEA或AGM小得多。對于芳香族配體，BSA容量的耐鹽性對于TYR、TRP和ABI是相似的，并且OCT是最高的(參見表2)。相反，就病毒清除的耐鹽性而言TYR是最高的，并且OCT、TRP、和ABI是相似的。此外，OCT對于BSA比AGM或TAEA具有更高的耐鹽性，然而OCT與AGM或TAEA相比具有明顯更低的用于病毒清除的耐鹽性。結(jié)合中性蛋白質(zhì)和陰離子染料的能力不能用于預測結(jié)合中性病毒的能力。芳香族配體TYR為被拒絕用于蛋白質(zhì)純化的配體的好的例子，因為其對蛋白質(zhì)的結(jié)合過強。然而，TYR配體非常適用于病毒清除。如表2所示，在缺乏加入的鹽時，TYR對病毒顯示出6.4的LRV。在存在50mM鹽的情況下，清除下降到2.7LRV,并且在存在150mM鹽的情況下，下降到0.9LRV。這些結(jié)果優(yōu)于AETMA，其在鹽的存在下的清除可忽略(LRV。0.1)。這些結(jié)果說明了一點即對于病毒清除用耐鹽性一次性膜的需求是如此不同于對于蛋白質(zhì)純化用耐鹽性可重復使用的珠子的需求，以致于被拒絕用于蛋白質(zhì)純化的配體是病毒清除用所需的并優(yōu)異的。27實施例3:除了耐鹽性病毒清除之外，本發(fā)明的另一個優(yōu)點是堿性蛋白(basicprotein)如單克隆抗體(mAb)不結(jié)合到膜。這可通過增加配體的pKa值使得mAb和配體在加載期間均帶正電而實現(xiàn)。這引起了mAb從配體的靜電排斥，但是對膜結(jié)合病毒的能力沒有不利的影響。大部分治療性mAb的pi均在約8-約10之間。該狹窄的pi范圍存在是因為治療性mAb趨向為人類IgGl，或小得多的程度上為IgG2和IgG4。因為抗體的V區(qū)域是整個分子的小部分，因此電荷很大程度上由同種型測定。因此，mAb通常在pH值為中性時帶正電，這防止結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)(Curtis等人，2003年)。另一方面，病毒具有各種更低的pl,并且許多在pH值為中性時帶負電。例如，AGM滿足這些需求。其在pH值為中性時具有正電荷，這是因為胍部分的pKa值為12.5。根據(jù)實施例2的方法，制造一次性微孔的再生纖維素病毒捕獲膜，該膜包含固定在其上的配體AGM。將堿性蛋白核糖核酸酶A(pl~9.5)用作mAb替代物。將包含中性病毒cpX174和0.5g/L的堿性蛋白核糖核酸酶A(兩者均溶解到TE緩沖液(10mMTris、ImMEDTA,pH值為7.5)中)的進料溶液(含有和不含有加入的NaCl)裝填到膜中。結(jié)果在圖10中示出。病毒清除并沒有由于堿性蛋白的存在而減少。例如，與在沒有堿性蛋白(不含和含加入的鹽)的情況下的5.5-6.0LRV的病毒清除相比(表2),AGM的病毒清除在添加堿性蛋白后完全沒有減少(LRV"6.0,圖10)。該實施例的意義是雙重的其證明了本發(fā)明的耐鹽性病毒捕獲和通過靜電排斥作用對堿性蛋白的同時排斥。參考文獻匿名."GuidanceonViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin."Fed.Regist.，63，51074-51084，1998.匿名."PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse"CenterForBiologiesEvaluationandResearch,FoodandDrugAdmmistration,U.S,DepartmentofHealthandHmnanServices,Rodcville，MD，1997,Aranha-Creado，H.，Brandwein，H,"ApplicationofBacteriophagesasSurrogatesforMammalianViruses:ACaseforUseinFilterValidationBasedonPrecedentsandCurrentPracticesinMedicalandEnvironments]Virology"PDAJ,Pharm,Sci.丁echnol.，53，75-82，1999.Barsoum，J.,"ConcentrationofRecombinantBaculovirusbyCatioiKExchangeChromatography"BioTechniques,26，834-840，1999Benson,S.D.)Bamford，J.K,，Barnford，D.H,，Bumett，R.M.'ViralEvolutionRevealedbyBacteriophagePRD1andHumanAdenovirusCoatProteinStructures."Cell,98，825-833，1999.Bitzer，M，H.Yang，MR.Etzel,"AnalysisofProteinPurificationUsingIon-ExchangeMembranes,"mdEng.Chem.Res"38,4044-4050(1999),Bitzer，M,，"MassTransferLimitationsUsingIonExchangeMembranes,"bibl.DiplomarbeitThesis,UniversityofStuttgart,Genrmny(1997).Boschetti，E.，"AntibodySeparationbyHydrophobicChargeinductionChromatography"TrendsBiotechnol.，20>333337，2002,Boulanger，P,，Kroner-Lux，G,,Moullier，P.，Rolling,F.，Savetti，A,，"AVersatileandScalableTwoStepIon-ExchangeChromatographyProcessforthePurificationofRecombinantAdeno-AssociatedVirusSerotypes-2and5."MolecularTherapy)6,678-686，2002.Brandt,S,GoffeRA,KesslerSB，0ConnorJL,Membrane-basedaffinitytechnologyforcommerciaiscaieseparations.Bio/Technology1988;6:779-782.Brorson，K.,Krejci，S.,Lee，K.，Hamilton,E,，Stein，K.，Xu，Y."BracketedGenericInactivationofRodentRetrovirusesbyLcxwpHTreatmentforMonoclonalAntibodiesandRecombinantProteins"Biotechnol.Bioeng"82,321-329,2003.Brough，Antoniou，C,)Carter,J,，Jakubik，J.,Xu，Y.，Lutz，H,"PerformanceofaNovelViresolveNFRVirusFilter"Bioteclinol.Prog.，18,782-795,2002.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>Fischer,J.,"SeparationofNanometer-SizedBiologicalParticlesUsingMembraneChromatography:AnAnalysisofAdsorptionKinetics."M.S.Thesis,Univ.Wisconsin,2000.Fogler,HS.ElementsofChemicalRea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