專利名稱：一種用于純化分離含烯鍵活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含烯鍵活性物質(zhì)的純化，具體來說，涉及一種采用銀 化反相高壓液相層析技術(shù)從油脂或天然藥物中分離得到高純度含烯 鍵活性物質(zhì)，特別是不飽和脂肪酸及其衍生物的方法。
背景技術(shù)：
含烯鍵活性物質(zhì)廣泛存在于油脂或天然藥物體內(nèi)，對人體具有保 健和藥理活性作用。如油脂中的油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸 等不飽和脂肪酸有明顯降低高密度脂蛋白、血清膽固醇的作用，進而 減少高血壓、心臟病及中風等疾病發(fā)病率，同時在維護生物膜的結(jié)構(gòu) 和功能方面有重要作用，該類產(chǎn)品可以廣泛應用于醫(yī)藥、營養(yǎng)補充劑、 保健食品等領(lǐng)域。天然藥物含有揮發(fā)油、有機酸、生物堿、黃酮、皂 甙等各種活性物質(zhì)，其中很多化合物含有烯鍵，結(jié)構(gòu)十分類似，難以 分離純化，但藥理活性卻有差別甚至毒性差別很大，因此發(fā)展針對含 烯鍵化合物的高選擇性的純化技術(shù)十分必要。目前主要用于油脂中不飽和脂肪酸的分離純化技術(shù)有低溫結(jié)晶、 尿素包結(jié)技術(shù)、超臨界萃取技術(shù)、精餾和分子蒸餾技術(shù)。這些分離技 術(shù)在生產(chǎn)中還存在著一些不足，主要是損失大，收率低，不穩(wěn)定，分離 困難，純度不高，某些技術(shù)成本太高(如分子蒸餾)等。目前用于天 然藥物中含烯鍵活性物質(zhì)的分離純化技術(shù)比較少，常用銀化硅膠層析 技術(shù)，該技術(shù)是在硅膠表面浸漬硝酸銀后在常壓或中壓下對樣品進行 分離。然而，這種技術(shù)有很多缺點硝酸銀在硅膠柱上的浸漬不均勻而影響分離效率；在中常壓下柱分離效率不高；銀化硅膠柱對光敏感， 只可現(xiàn)用現(xiàn)制備，手工制備過程復雜繁瑣，重現(xiàn)性差；分離消耗時間 長；分離消耗有機溶劑量大。本發(fā)明將銀離子添加到洗脫劑中，采用普通反相液相層析柱，在 高壓下對樣品進行分離純化，具有純化能力強、分離效率高、速度快、 有機溶劑消耗量小、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。經(jīng)檢索尚未見到銀化反相高壓 液相層析有關(guān)的專利文獻報導。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單快速、收率高、純度高(純度 95%以上)的含烯鍵活性物質(zhì)的純化方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是將銀離子添加到洗脫劑中，采用反相 高壓液相層析法對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質(zhì)進行分離或 純化，其中使用的反相高壓液相層析系統(tǒng)包括高壓輸液泵、進樣器、 反相制備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)。其 中，層析柱為反相制備層析柱(C18, C8等)，柱長20 50 cm，內(nèi)徑 1 20 cm,填料顆粒5 30 |om，流量10 mL 100 mL/min，壓力2 50 MPa。進一步地，所述含烯鍵活性物質(zhì)在自然界中主要以不飽和脂肪酸 及其衍生物形式存在，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等等。進一步地，洗脫劑優(yōu)選二元洗脫劑， 一相為甲醇或類似溶劑，例 如乙腈或乙醇等，另一相為銀離子酸性水溶液。進一步地，所述銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存 在，濃度為O. l 0.5mol/l，酸為醋酸，水溶液中酸的濃度為0. 1% 1% (重量百分比濃度)，其中的水優(yōu)選二次蒸餾水。根據(jù)油脂或天然藥物中含烯鍵活性物質(zhì)對的分離難易程度，采用等度或梯度洗脫劑洗脫，檢測器檢測目標餾分，將自動餾分收集器收 集到的目標餾分合并，用脂溶性溶劑萃取，濃縮至干或結(jié)晶，可得純度在95%以上的含烯鍵活性物質(zhì)純品。本發(fā)明的優(yōu)點是采用銀化洗脫劑，可根據(jù)目標物質(zhì)純化的難易 程度，在線調(diào)節(jié)銀離子濃度繼而調(diào)節(jié)系統(tǒng)的分離純化能力，具有可控 性好、自動化程度高的特點；采用普通反相制備層析柱，具有經(jīng)濟、 方便的特點，本發(fā)明采用高壓液相層析系統(tǒng)，具有純化能力強、分離 效率高、速度快、有機溶劑消耗量小、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合油脂或 天然藥物中含烯鍵活性物質(zhì)的制備和純化。


圖1為N—異丁基十二碳四烯酰胺的銀離子反相高壓液相層析 圖。其中1為(2E，4Z，8Z，10Z)- N-異丁基十二碳四烯酰胺；2為 (2E， 4E， 8Z， 10E) - N-異丁基十二碳四烯酰胺。圖2為亞油酸的銀離子反相高壓液相層析圖。其中3為亞油酸。 圖3為墻草堿的銀離子反相高壓液相層析圖。其中4為墻草堿。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施過程作進一步地詳細說明。 本發(fā)明的從油脂或天然藥物中純化含烯鍵活性物質(zhì)的方法先采用合適的溶劑(如正己烷)，從油脂或天然藥物中提取出含烯鍵活性物質(zhì)，并經(jīng)柱層析粗分離，再將所得到的粗分離組分采用銀化反相高壓液相層析進行精分離，合并目標餾分可制備得到純品，具體過程為 將銀離子添加到洗脫劑中，優(yōu)選二元洗脫劑，采用反相高壓液相層析 對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質(zhì)進行分離。所述的反相高壓液 相層析系統(tǒng)包括高壓輸液泵、進樣器、反相制備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)(未示出具體結(jié)構(gòu)圖)。所述的層析柱為反相制備層析柱(C18， C8等)，柱長20 50 cm，內(nèi)徑1 20 cm, 填料顆粒5 30 (om，流量IO mL 100 mL/min，壓力2 50 MPa。所 用的二元洗脫劑， 一相為甲醇或乙醇或乙腈，另一相為銀離子酸性水 溶液。銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存在，其濃度為 0. 1 0.5M，酸性水溶液中的酸指醋酸，其濃度為0. lwt% lWto/。， 水為二次蒸餾水。根據(jù)油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質(zhì)對的分離 難易程度，采用等度或梯度洗脫劑洗脫，檢測器檢測目標餾分，將自 動餾分收集器收集到的目標餾分合并，用脂溶性溶劑萃取，濃縮至干 或結(jié)晶，可得純度在95。/。以上的含烯鍵活性物質(zhì)。實施例1從杜衡中制備(2E， 4Z， 8Z， 10Z)-N-異丁基十二碳四烯酰胺(2E， 4Z， 8Z， 10Z)-N-異丁基十二碳四烯酰胺存在于藥用植物杜衡 中，具有解熱鎮(zhèn)痛等藥理活性。與(2E，4E，8Z，10E)-N-異丁基十二碳四烯酰胺是順反異構(gòu)體，同時存在于杜衡中。將杜衡全草于6(TC下恒溫干燥20min,粉碎至50目，準確稱取 1 kg，用正己烷兩次回流提取(2X2 L) 24 h，濃縮的樣品進行硅膠 柱層析，以正己烷一無水乙醚(l:l)為洗脫劑，得到含烯鍵的酰胺粗 品。取l/10份樣品溶解于5mL甲醇中，進行銀化反相高壓液相層析 分離。在Waters Delta Pr印4000制備級高壓液相層析儀(996光 電二極管陣列檢測器、Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱 采用日本資生堂C18高壓制備層析柱(250x25 mm， 5 pm); 二元洗脫 劑， 一相為甲醇，另一相為濃度0.5wt。/。的醋酸水溶液，其中添加有 0. 3 mol/L的銀離子，梯度洗脫條件20分鐘從40%甲醇升高到100%甲醇。流速為20 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL， 柱溫為室溫。制備層析圖見圖l。分別將12. 4min 13. 4 min流出的餾分及15. 2 min 18min流出 的餾分收集，用正己烷萃取，重結(jié)晶，即可得到兩個異構(gòu)體的純品(純 度為99%，氣相色譜檢測)。第一個餾分的物理性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)如下無色晶體，mp 63°C，
UV max (MeOH): 261.7， 235. 8 nm; IR v max Cm—1: 3300 (NH) ， 2910 (CH)， 1720 (C=0)， 1650 (C0NH)， 1550， 990 (trans, C=C), 690 (cis, C二C); EI/MS: 70 eV， m/z 247. 2 [M]+ (0.02)， 246.2 [M-H]+ (0.04), 167.1 [M-C6H8]+ (5.6)， 81.0 [M-C10H16N0] + (100)， 67.0 [!^1^0] + (3.2)， 41.0 [M-C13H2。N0]+ (5.5); 1H—NMR (400 MHz, CDC13) S 5. 82 (IH， d， J = 15 Hz H-2)， 7. 54(1H， dd， J 二 15， 11. 5 Hz H-3)， 6.11 (IH， dd， J = 11.5， 11.5 Hz H-4)， 5,78 (1H， dt， J 二 11.5， 7 Hz H—5)， 2.33 (2H， br dt， J 二 7， 7 H_6)， 2.27 (2H， br dt， J 二 7, 7 H-7)， 5.42 (1H, dt， J = 10， 7 Hz H-8)， 6.32 (1H， brt， J 二 10 HzH-9)， 6.25 (1H， tq， J = 10， 7 Hz H-10) ， 5.55 (1H， dq， J = 10， 7 Hz H-ll)， 1.75 (3H， dd， J = 7， 2 Hz H-12)， 3. 16 (2H， t， J : 7HzH-1，)， 1.80 (IH， m， H-2，)， 0.93 (6H， d， H-3， ， 4，)。通過 結(jié)構(gòu)解析可證明為(2E, 4Z， 8Z， lOZ)-N-異丁基十二碳四烯酰胺。 實施例2從大豆油中制備亞油酸將100g大豆油用200mL正己垸溶解后用硅膠層析柱進行粗分離， 采用正己烷一乙酸乙酯(1:1)為洗脫劑，用氣相色譜追蹤亞油酸粗組 分。將50mL甲醇萃取后進行銀化反相高壓液相層析分離。在Waters Delta Pr印4000制備級高壓液相層析儀(996光電二極管陣列檢測 器、Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱采用日本資生堂C18高壓制備層析柱(250x25 mm， 5 pm); 二元洗脫劑， 一相為甲醇，另 一相為0. 5%醋酸溶液并添加0. 3 M的銀離子，梯度洗脫條件30分 鐘從40%甲醇升高到100%甲醇，保持20分鐘。流速為20 mL/min， 檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL,柱溫為室溫。制備層析圖見圖 2。將22min 24min流出的餾分收集，用正己垸萃取，即可得到亞 油酸的純品(純度為98Q^，氣相色譜檢測)。采用質(zhì)譜定性。 實施例3從北細辛中制備墻草堿墻草堿存在于中藥北細辛中，具有解熱鎮(zhèn)痛等藥理活性。結(jié)構(gòu)為 (2E， 4E)-N-異丁基-2， 4-癸二烯酰胺。將北細辛根于60。C下恒溫干 燥20min，粉碎至50目，準確稱取1 kg，用正己烷兩次回流提取(2 X2L) 24 h，濃縮的樣品進行硅膠柱層析，以正己垸一乙酸乙酯(l:l) 為洗脫劑，氣相色譜跟蹤目標成分，以獲得粗組分。取l/3份樣品溶 解于5mL甲醇中，進行銀化反相高壓液相層析分離。在Waters Delta Pr印4000制備級高壓液相層析儀(996光電二極管陣列檢測器、 Millennium 32層析工作站)上完成。層析柱采用日本資生堂C18高 壓制備層析柱(250x25 mm, 5 pm); 二元洗脫劑， 一相為甲醇，另一 相為濃度0.3wty。的醋酸水溶液，其中添加有0.2 mol/L的銀離子， 梯度洗脫條件40分鐘從40%甲醇升高到100%甲醇并保持10分鐘。 流速為20 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣體積5 mL，柱溫為室 溫。制備層析圖見圖3。值得注意的是，盡管本文只給出了一些具體的含烯鍵活性物質(zhì)， 特別是不飽和脂肪酸及其衍生物從油脂或天然藥物中分離(純化)的 實施例，但是，由于本發(fā)明的方法的普適性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 基于本領(lǐng)域的公知常識進行概括，確定任何常規(guī)的從油脂或天然藥物中分離(或純化)的含烯鍵活性物質(zhì)都可以采用本發(fā)明的方法進行分 離純化，其它具體的含烯鍵活性物質(zhì)的實施例不再一一贅述。盡管上文對本發(fā)明的具體實施方式
進行了詳細的描述和說明，但 應該指明的是，我們可以對上述實施方式進行各種等同改變和修改， 但這些都不脫離本發(fā)明的精神和所附的權(quán)利要求所記載的范圍。
權(quán)利要求
1、一種從油脂或天然藥物中分離得到高純度含烯鍵活性物質(zhì)的方法，其特征在于將銀離子添加到洗脫劑中，采用反相高壓液相層析系統(tǒng)對油脂或天然藥物中的含烯鍵活性物質(zhì)進行分離。
2、 按照權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括在銀化反相高壓液相層 析之前用合適的溶劑從油脂或天然藥物中提取出含烯鍵活性物質(zhì)，并 經(jīng)柱層析粗分離的步驟。
3、 按照權(quán)利要求2所述的方法，進一步包括在銀化反相高壓液相層析之后用適當?shù)娜軇┹腿〉牟襟E。
4、 按照權(quán)利要求3所述的方法，進一步包括在萃取后重結(jié)晶的步驟。
5、 按照權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于所述含烯鍵 活性物質(zhì)為在自然界中主要以不飽和脂肪酸或其衍生物形式存在的 活性物質(zhì)。
6、 按照權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，所述反相高壓液相層析系統(tǒng)包括高壓輸液泵、進樣器、反相制備層析柱、檢測器、自動餾分收集器和數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)。
7、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反相高壓液相層析系統(tǒng)中的層析柱為反相制備層析柱，柱長20 50 cm，內(nèi)徑1 20 cm，填料顆粒5 30(im，洗脫劑流量10 mL 100 mL/min，系統(tǒng)壓力 2 50 MPa。
8、 按照權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于所述洗脫劑 為二元洗脫劑，其中一相為銀離子酸性水溶液，洗脫為等度洗脫或梯 度洗脫。
9、 按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述二元洗脫劑的另一相為甲醇或乙腈或乙醇。
10、按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述銀離子酸性水溶液中的銀離子以硝酸銀形式存在，濃度為0. 1 0.5 mo1/1，所述酸 為醋酸，酸性水溶液中醋酸的濃度為0. lwt% lwt%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從油脂或天然藥物中分離出高純度含烯鍵活性物質(zhì)的方法，包括將銀離子添加到洗脫劑中，使用反相高壓液相層析系統(tǒng)對難分離的含烯鍵活性物質(zhì)進行高選擇性分離，收集合并目標餾分可得到高純度的目標化合物。本發(fā)明使用銀化洗脫劑，可根據(jù)目標物質(zhì)純化的難易程度，在線調(diào)節(jié)銀離子濃度繼而調(diào)節(jié)系統(tǒng)的分離純化能力，具有可控性好、自動化程度高的優(yōu)點；本發(fā)明使用了普通的反相制備層析柱，具有經(jīng)濟、方便的特點，本發(fā)明采用高壓液相層析系統(tǒng)，具有純化能力強、分離效率高、速度快、有機溶劑消耗量小、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合油脂或天然藥物中含烯鍵活性物質(zhì)的制備和純化。
文檔編號B01D15/32GK101234944SQ20081010144
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月6日
發(fā)明者儲曉剛, 云 凌, 峰 張, 李秀琴, 煒 雍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院