專利名稱：一種微生物微膠囊大量制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物微膠囊大量制備的方法，屬于微生物和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
在生物技術(shù)領(lǐng)域，微膠囊技術(shù)是伴隨固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展而形成的，即利用形成微膠囊的方法將生物物質(zhì)如細(xì)胞等包埋起來。微膠囊固定化微生物細(xì)胞的優(yōu)勢表現(xiàn)在1)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中形成一種微小的培養(yǎng)環(huán)境，降低了培養(yǎng)時剪切力對細(xì)胞的影響，使攪拌和直接通氣等操作不會影響細(xì)胞的正常生長，提高了細(xì)胞密度，并使細(xì)胞得以重復(fù)和繼續(xù)使用，而不會大量地流失。2)微膠囊可以把目的產(chǎn)物截留于膜內(nèi)，通過微膠囊與培養(yǎng)液的分離即可實現(xiàn)產(chǎn)物與培養(yǎng)液的分離，可直接從大量稀溶液中把需要的產(chǎn)物提取出來，提高了目的產(chǎn)物的濃度，大大縮小了處理液量，減少了分離過程的負(fù)荷。3)微膠囊產(chǎn)品本身還具有良好的流動性和分散性，因此易與其它原料混合均勻，同時便于運輸、貯存和添加使用。4)通過微膠囊包被的細(xì)胞，如微生態(tài)制劑等可更好的耐受體內(nèi)胃腸道等環(huán)境，大大增加益生菌的體內(nèi)存活率，并使服藥過程變得更加簡單，通過控制芯材釋放和作用的時間、數(shù)量和位置，還可實現(xiàn)定點和定量給藥。因此，生物微膠囊在飼料、食品及醫(yī)療等的多個領(lǐng)域表現(xiàn)了極好的應(yīng)用和市場前景。
但目前發(fā)酵前包被法生產(chǎn)微生物微膠囊的技術(shù)很難做到大量生產(chǎn)，大部分方法和設(shè)備都在10ml/h微膠囊的水平，甚至更低，因而造成生產(chǎn)成本極高，難于被市場接受。而目前大量使用的發(fā)酵后包被法，雖然可以實現(xiàn)大量生產(chǎn)。但是，發(fā)酵后包被法需要的微生物細(xì)胞數(shù)量巨大，大量的細(xì)胞存在造成了高質(zhì)量微膠囊的得率降低。而且發(fā)酵后包被法往往需要較高溫度和壓力的存在，這就很容易的造成微生物細(xì)胞活性的損失，降低了產(chǎn)品質(zhì)量。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以用于大量制備微生物微膠囊的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 一種微生物微膠囊大量制備的方法，包括如下步驟 (1)囊材溶液的配制配制質(zhì)量體積比濃度為1-2％w/v的海藻酸鈉溶液，滅菌備用； (2)固化劑的配制制得0.1-0.3mol/L的氯化鈣溶液，滅菌備用； (3)微生物微膠囊制備滅菌囊材溶液在無菌條件下，加入對數(shù)生長期的微生物種子液，至密度為106cfu/ml，用高壓空氣，經(jīng)無菌濾膜和噴頭噴入無菌氯化鈣溶液，不斷均勻攪拌，噴完后慢速攪拌固化10-30min，傾出上清液，得直徑為300-700微米的微膠囊，用無菌水洗微膠囊1-3次，培養(yǎng)液清洗微膠囊1-2次； (4)包被后培養(yǎng)將包有微生物細(xì)胞的微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，過濾分離微膠囊即得產(chǎn)品。
所述海藻酸鈉溶液的濃度為1.5％w/v。
所述氯化鈣溶液的濃度為0.1mol/L。
所述高壓空氣流速為0.6m3/h。
所述海藻酸鈉與微生物細(xì)胞混合液流速為45ml/min。
所述噴頭為實心錐型圓形噴霧，連接管道為1/4英寸。
所述滅菌備用是指在115℃，滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述噴完后慢速攪拌固化20min。
本發(fā)明采用發(fā)酵前包埋方法，將低密度微生物細(xì)胞均勻分散在囊材中，然后用無菌氣體，將囊材和微生物混合液噴霧到凝固劑中，進行絡(luò)合反應(yīng)得到微生物微膠囊。最后通過包被后的培養(yǎng)控制，得到含有期望微生物密度的微膠囊。大大減少了微囊化過程細(xì)胞的利用量，避免了后包埋過程由于受細(xì)胞密度影響而造成的微囊化效率和產(chǎn)率較低的不利因素，更易于得到形態(tài)和穩(wěn)定性更好的微囊化產(chǎn)品。同時，菌體可繼續(xù)在微膠囊微環(huán)境下增殖，細(xì)胞密度大小可控，并可達到比后包埋更高的微囊化菌體密度。按1-3×106個/ml制備的直徑為0.3-0.7mm包被屎腸球菌的濕膠囊，經(jīng)16小時左右發(fā)酵，可得含高密度和高活性屎腸球菌的微膠囊產(chǎn)品，活菌數(shù)可達1010個/ml濕膠囊。
本發(fā)明的優(yōu)點是克服了目前發(fā)酵前包被法制備微生物微膠囊不能大量生產(chǎn)的缺陷，大量生產(chǎn)，操作簡單，材料和設(shè)備成本低廉。
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本文公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

具體實施例方式 實施例1 一.材料 1.海藻酸鈉溶液，1.5％w/v。
2.CaCl2溶液，0.1mol/L。
3.屎腸球菌菌種，于2008年5月22日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)，建議的分類名為屎腸球菌Enterococcus Faecium，保藏號為CGMCC No.2516。
二.方法 1.菌種種子液的制備將保存屎腸球菌菌種接種在液體培養(yǎng)基中，37±1℃恒溫培養(yǎng)8-10小時，當(dāng)活菌數(shù)達到對數(shù)生長期，密度約107-108cfu/ml時結(jié)束培養(yǎng)，備用。
2.囊材溶液的配制及滅菌在不斷攪拌下按最終為1.5％w/v的濃度，分批加海藻酸鈉入去離子水中，制成為透明膠液，115℃下滅菌20分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.固化劑的配置及滅菌CaCl2溶液，用蒸餾水配成0.1mol/l溶液，115℃下滅菌20分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.微膠囊制備無菌條件下，將種子液加入到海藻酸鈉溶液中，按1-3×106個/ml海藻酸鈉的密度調(diào)配，充分?jǐn)噭蚝螅酶邏簾o菌氣體經(jīng)噴頭噴入CaCl2溶液中(海藻酸鈉微生物混合液與CaCl2溶液的體積比最低為1∶3)，均勻緩慢攪拌，固化20分鐘左右，即得待培養(yǎng)微膠囊，微膠囊直徑為0.3-0.7mm。將含有屎腸球菌的微膠囊接入發(fā)酵液中，37℃，150rpm恒溫培養(yǎng)，16小時左右，即得含高密度和高活性屎腸球菌的微膠囊產(chǎn)品，經(jīng)檢測，活菌數(shù)達到1010個/ml濕膠囊。
本發(fā)明將微生物通過微囊化轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的細(xì)粉顆粒，改變微生物存在的形態(tài)，產(chǎn)品具有良好的流動性和分散性，能夠有效地防止菌體失活，提高微生物類產(chǎn)品的穩(wěn)定性。體內(nèi)應(yīng)用時還能防止胃液的破壞，從而使盡可能多的菌體到達腸道，真正起到保健和治療的作用；可將配伍禁忌的各種成分在同一產(chǎn)品中隔開。
權(quán)利要求
1.一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于包括如下步驟
(1)囊材溶液的配制配制質(zhì)量體積比濃度為1-2％w/v的海藻酸鈉溶液，滅菌備用；
(2)固化劑的配制制得0.1-0.3mol/L的氯化鈣溶液，滅菌備用；
(3)微生物微膠囊制備滅菌囊材溶液在無菌條件下，加入對數(shù)生長期的微生物種子液，至密度為106cfu/ml，用高壓空氣，經(jīng)無菌濾膜和噴頭噴入無菌氯化鈣溶液，不斷均勻攪拌，噴完后慢速攪拌固化10-30min，傾出上清液，得直徑為300-700微米的微膠囊，用無菌水洗微膠囊1-3次，培養(yǎng)液清洗微膠囊1-2次；
(4)包被后培養(yǎng)將包有微生物細(xì)胞的微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，過濾分離微膠囊即得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述海藻酸鈉溶液的濃度為1.5％w/v。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述氯化鈣溶液的濃度為0.1mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述高壓空氣流速為0.6m3/h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述海藻酸鈉與微生物細(xì)胞混合液流速為45ml/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述噴頭為實心錐型圓形噴霧，連接管道為1/4英寸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述滅菌備用是指在115℃，滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物微膠囊大量制備的方法，其特征在于所述噴完后慢速攪拌固化20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物微膠囊大量制備的方法，屬于微生物和生物技術(shù)領(lǐng)域。一種微生物微膠囊大量制備的方法，包括如下步驟(1)囊材溶液的配制配制質(zhì)量體積比濃度為1-2％w/v的海藻酸鈉溶液，滅菌；(2)固化劑的配制制得0.1-0.3mol/L的氯化鈣溶液，滅菌；(3)微生物微膠囊制備滅菌囊材溶液加入對數(shù)生長期的微生物種子液，至106cfu/ml左右密度，用高壓空氣，經(jīng)無菌濾膜和噴頭噴入無菌氯化鈣溶液，攪拌固化，傾出上清液，得微膠囊，洗膠囊；(4)包被后培養(yǎng)將包有微生物細(xì)胞的微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，過濾分離即得。本發(fā)明的優(yōu)點是克服了發(fā)酵前包被法制備微生物微膠囊不能大量生產(chǎn)的缺陷，大量生產(chǎn)，操作簡單，材料和設(shè)備成本低廉。
文檔編號B01J13/04GK101288836SQ20081011491
公開日2008年10月22日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者綦文濤, 郝淑紅, 王婷婷, 張曉琳, 郭偉群, 李愛科 申請人:國家糧食局科學(xué)研究院