專利名稱：復(fù)合GMA/ZrO₂共聚物微球及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合GMA/&02共聚物微球及其制備方法與該共聚物微球在天然 產(chǎn)物(石榴皮多酚)分離純化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擴(kuò)張床吸附(Expanded Bed Adsorption,EBA)技術(shù)是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的 一種新型蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。它能直接從發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液或勻漿液中捕獲目標(biāo)產(chǎn)物， 集固液分離、濃縮和初期純化于一個(gè)單元操作之中。這既減少了操作步驟，提高了產(chǎn)品收 率，也降低了純化費(fèi)用和資金投入，被譽(yù)為近些年來出現(xiàn)的第一個(gè)新的單元操作。擴(kuò)張床吸 附技術(shù)綜合了填充床和流化床的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了填充床和流化床自身的一些缺陷。吸附 基質(zhì)依靠液體逆流運(yùn)動(dòng)在床層中保持懸浮狀態(tài)，同時(shí)其自身具有一定的密度和粒徑分布， 因此能夠在擴(kuò)張床中形成穩(wěn)定的分級(jí)床層，滿足吸附要求。開發(fā)合適的擴(kuò)張床吸附基質(zhì)是擴(kuò)張床技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵之一。應(yīng)用于擴(kuò)張床技術(shù) 的吸附基質(zhì)主要分核殼型和均質(zhì)型兩類前者由一個(gè)或多個(gè)相對(duì)集中的顆粒組成內(nèi)核，采 用親水性材料包裹高密度的惰性材料，如瓊脂糖_石英砂、瓊脂糖_不銹鋼、葡聚糖_ 二氧 化硅、纖維素_ 二氧化鈦等；后者采用高密度的大孔勻質(zhì)材料，整體上不具有明顯的核殼結(jié) 構(gòu)，如多孔玻璃、多孔氟化二氧化鋯、多孔陶瓷_聚丙烯酰胺等。合成共聚物微球作為基質(zhì) 在固定床層析中已得到廣泛的應(yīng)用，但其作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)發(fā)揮效用還鮮見報(bào)道。目前 擴(kuò)張床基質(zhì)已成功地應(yīng)用于包涵體、單克隆抗體、大腸桿菌勻漿、酵母細(xì)胞勻漿、枯草桿菌 培養(yǎng)液、酵母培養(yǎng)液以及動(dòng)物組織產(chǎn)物的提取，但尚未見關(guān)于擴(kuò)張床基質(zhì)在天然產(chǎn)物分離 純化中應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種核殼型復(fù)合GMA/&02共聚物微球及其制備方法以及 該共聚物微球作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)在石榴皮提取物分離純化石榴皮多酚中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的復(fù)合GMA/&02共聚物微球?yàn)楹藲?fù)合結(jié)構(gòu)，內(nèi)核的組分為&02， 外殼的組分為甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA與二乙烯苯DVB，微球中，Zr02的質(zhì)量百分含量為 0. 5 14%，GMA的質(zhì)量百分含量為50 70%，余量為DVB ；共聚物微球的粒徑分布范圍為 120 400 iim。本發(fā)明所提供的復(fù)合GMA/&02共聚物微球的制備方法，包括以下步驟1)將&02、甲苯與硬脂酸按質(zhì)量比3 1 20 1混合，攪拌升溫至85 95°C 反應(yīng)3 5h，烘干，得到表面改性的&02 ；2)將氯化鈉和明膠加入去離子水中，升溫至55 65°C，加熱攪拌0.5 1.5h， 得到含有氯化鈉和明膠的分散相水溶液，分散相水溶液中氯化鈉和明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 2 10%禾口 0. 5 3% ；3)將步驟1)制得的表面改性的&02與單體甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、交聯(lián)劑二乙烯苯(DVB)、引發(fā)劑過氧化苯甲酰(BP0)和致孔劑(甲苯與正庚烷)混合，攪拌得到聚 合相溶液，其中，Zr02的用量為GMA質(zhì)量的1 15%，GMA與DVB的體積比為10 1 1， BP0的用量為GMA質(zhì)量的0. 5 1. 5%，致孔劑的用量為GMA體積的50 150%，致孔劑中， 正庚烷的用量為甲苯體積的10 75% ；4)將步驟2)制得的分散相溶液與步驟3)制得的聚合相溶液按體積比1. 5 5 1混合，在55 65°C條件下攪拌反應(yīng)0. 5 1. 5h，而后繼續(xù)攪拌升溫至85 95°C反 應(yīng)6 10h固化、洗滌、干燥，得到GMA/&02共聚物微球，再將GMA/&02共聚物微球加入到 N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹；5)將0 -環(huán)糊精(0 -⑶)溶于DMF中并加入氫化鈉(NaH)后，常溫下攪拌反應(yīng)至 無氫氣放出為止，得到澄清透明的⑶鈉鹽溶液，其中，DMF的用量為⑶質(zhì)量的2 5 倍，NaH的加入量為3 -CD質(zhì)量的0. 1 0. 5% ；6)將溶脹后的GMA/Zr02共聚物微球加入步驟5)中制備的0 -⑶鈉鹽溶液中，并加 入碘化鉀(KI)與四丁基溴化銨(Bu4NBr)，其中，0 _⑶鈉鹽溶液的用量為GMA/&02共聚物 微球質(zhì)量的5 15倍，KI與Bu4NBr的用量均為3 -⑶鈉摩爾數(shù)的1. 5 3倍，50 80°C 加熱攪拌反應(yīng)10 15h，而后加入質(zhì)量濃度為25 40%的NaOH溶液，并滴加環(huán)氧氯丙烷 (EPH)和去離子水，50 80°C繼續(xù)加熱攪拌反應(yīng)2 5h，其中，NaOH溶液的加入量為0 -⑶ 鈉鹽溶液體積的20 50%，EPH和去離子水的加入量均為NaOH溶液體積的10 30%，最 后加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系至pH = 6 8后，抽濾、洗滌、烘干，得到復(fù)合GMA/&02共聚物微 球。本發(fā)明采用懸浮聚合法，通過GMA骨架的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將&02顆粒緊密包埋其 中，防止&02的泄漏，起到了增加微球密度的作用，且保留了 GMA骨架的大孔結(jié)構(gòu)、親水性 和反應(yīng)活性，因此，本發(fā)明所提供的復(fù)合GMA/&02共聚物微球可作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)，用于 從石榴皮提取物中分離純化石榴皮多酚，具體步驟如下1)用復(fù)合GMA/&02共聚物微球裝填擴(kuò)張床柱，并用濃度為0. 01 0. 05mol/L,pH 為5 8的磷酸鹽緩沖溶液平衡吸附層析柱1 2h后，將稀釋后的石榴皮提取物上柱；2)吸附結(jié)束后，用去離子水洗滌柱體至洗滌液在紫外檢測(cè)中于275nm處無吸收 峰；3)用濃度為40 80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為4 10倍柱體積， 分離提純出石榴皮多酚。本發(fā)明具有以下有益效果1)本發(fā)明復(fù)合GMA/&02共聚物微球形狀規(guī)則，有利于擴(kuò)張床操作的穩(wěn)定；密度較 大(密度為1. 1 1.6g/cm3)，可以滿足擴(kuò)張床操作高處理量的要求；密度和粒徑大小可以 調(diào)節(jié)，能適應(yīng)擴(kuò)張床操作的不同需求；PH值使用范圍廣、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠滿足擴(kuò)張床操 作在位清洗的要求；作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)，用于從石榴皮提取物中分離純化石榴皮多酚時(shí)， 分離速度快，生物相容性好，在天然產(chǎn)物分離純化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。2)本發(fā)明復(fù)合GMA/&02共聚物微球原料毒性低，環(huán)境污染小，成本低廉，制備工藝 簡(jiǎn)單，易于控制和放大生產(chǎn)。以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的&02顆粒的粒徑為20-40nm。實(shí)施例11)將17. 5g Zr02,400ml甲苯和17. 5g硬脂酸混合，攪拌升溫至95°C反應(yīng)3h，烘干， 得到表面改性的&02 ；2)于裝有攪拌器、冷凝管和溫度計(jì)的1L的三口燒瓶中加入1. 25g明膠、5g氯化鈉 和250ml去離子水，升溫至55°C攪拌1. 5h ；3)將 lg 表面改性的 Zr02 加入到含有 100ml GMAUOml DVB、0. 5g BP0、45. 5ml 甲 苯和4. 5ml正庚烷的混合溶液中，攪拌得到穩(wěn)定分散的聚合相溶液；4)將步驟3)得到的聚合相溶液加入到步驟2)得到的分散相溶液中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn) 速至300rpm，維持轉(zhuǎn)速不變，55°C下反應(yīng)1. 5h后，升溫至85°C保溫10h，固化得到白色微球， 熱水洗滌，丙酮抽提除去致孔劑，真空干燥至恒重，得到共聚物微球，并將60g共聚物微球 加入到干燥的DMF中溶脹；5)將50g 0 -⑶溶解于DMF中加入0. 05g NaH,常溫下于普通搖床中攪拌反應(yīng)至 無氫氣放出時(shí)為止；6)將步驟4)中溶脹好的共聚物微球投入步驟5)中的0 -⑶鈉鹽溶液中，并加入 llg KI與16. 5g Bu4NBr，于50°C的水浴搖床中攪拌反應(yīng)10h，而后加入125ml 25% NaOH溶 液，并滴加12. 5ml EPH和12. 5ml去離子水后，于50°C的水浴搖床中繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，最后 加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系PH = 6. 5后，抽濾、固體產(chǎn)物先用DMF淋洗，再用熱水洗滌直至洗滌 液在紫外光譜檢測(cè)中無吸收峰，篩分得到粒徑分布為160 325 u m,密度為1. 09g/cm3的復(fù) 合GMA/&02共聚物微球；7)用制得的復(fù)合GMA/&02共聚物微球裝填擴(kuò)張床柱，裝填高度為10cm，用 0. 01mol/L,pH = 8的磷酸鹽緩沖液在線性流速為280cm/h，擴(kuò)張率為2. 1的條件下，平衡吸 附層析柱lh后，將稀釋后的石榴皮提取物上樣，吸附結(jié)束后，用去離子水洗滌4個(gè)柱體積， 至洗滌液在紫外光譜儀275nm無吸收峰，按照固定床模式用濃度為50 % 70 %的乙醇溶液 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為9個(gè)柱體積，得到的石榴皮多酚經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為65. 46%。實(shí)施例21)將52. 5g Zr02,400ml甲苯和17. 5g硬脂酸混合，攪拌升溫至85°C反應(yīng)5h，烘干， 得到表面改性的&02 ；2)于裝有攪拌器、冷凝管和溫度計(jì)的1L的三口燒瓶中加入7. 5g明膠、25g氯化鈉 和250ml去離子水，升溫至65°C攪拌0. 5h ；3)將 16g 表面改性的 Zr02 加入到含有 100ml GMA、100ml DVB、1.5g BP0、85ml 甲 苯和65ml正庚烷的混合溶液中，攪拌得到穩(wěn)定分散的聚合相溶液；4)將步驟3)得到的聚合相溶液加入到步驟2)得到的分散相溶液中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn) 速至500rpm，維持轉(zhuǎn)速不變，65°C下反應(yīng)0. 5h，升溫至95°C保溫6h，固化得到白色微球，熱 水洗滌，丙酮抽提除去致孔劑，真空干燥至恒重，得到共聚物微球；并將30g共聚物微球加 入到干燥的DMF中溶脹；5)將50g 0 -⑶溶解于DMF中并加入0. 375g NaH,常溫下于普通搖床中攪拌反應(yīng) 至無氫氣放出時(shí)為止；
6)將步驟4)中溶脹好的共聚物微球投入步驟5)中的0 -⑶鈉鹽溶液中，并加入 22g KI與33g Bu4NBr，于80°C的水浴搖床中攪拌反應(yīng)15h，而后加入50ml 40%Na0H溶液， 并滴加15ml EPH和15ml去離子水后，于80°C的水浴搖床中繼續(xù)攪拌反應(yīng)5h，最后加入鹽 酸溶液調(diào)節(jié)體系pH = 7. 8后，抽濾、固體產(chǎn)物先用DMF淋洗，再用熱水洗滌直至洗滌液在紫 外光譜檢測(cè)中無吸收峰，篩分得到粒徑分布為120 380 u m,密度為1. 56g/cm3的復(fù)合GMA/ Zr02共聚物微球；8)用制得的復(fù)合GMA/&02共聚物微球裝填擴(kuò)張床柱，裝填高度為15cm，用 0. 05mol/L,pH = 5的磷酸鹽緩沖液在線性流速為370cm/h，擴(kuò)張率為2. 4的條件下，平衡吸 附層析柱2h后，將稀釋后的石榴皮提取物上樣，吸附結(jié)束后，用去離子水洗滌4個(gè)柱體積， 至洗滌液在紫外光譜儀275nm無吸收峰，按照固定床模式用濃度為50 70 %的乙醇溶液進(jìn) 行梯度洗脫，洗脫體積為7個(gè)柱體積，得到的石榴皮多酚經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為68. 75%。實(shí)施例31)將35g Zr02,400ml甲苯和17. 5g硬脂酸混合，攪拌升溫至90°C反應(yīng)4h，烘干， 得到表面改性的&02 ；2)于裝有攪拌器、冷凝管和溫度計(jì)的1L的三口燒瓶中加入3. 75g明膠、12. 5g氯 化鈉和250ml去離子水，升溫至60°C攪拌lh ；3)將 12g 表面改性的 &02 加入到含有 100ml GMA,40ml DVB、1. 2g BP0、62. 5ml 甲 苯和62. 5ml正庚烷的混合溶液中，攪拌得到穩(wěn)定分散的聚合相溶液；4)將步驟3)得到的聚合相溶液加入到步驟2)得到的分散相溶液中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn) 速至400rpm，維持轉(zhuǎn)速不變，60°C下反應(yīng)lh后，升溫至90°C保溫8h，固化得到白色微球，熱 水洗滌，丙酮抽提除去致孔劑，真空干燥至恒重，得到共聚物微球；并將50g共聚物微球加 入到干燥的DMF中溶脹；5)將50g 0 -⑶溶解于DMF中加入0. 2g NaH,常溫下于普通搖床中攪拌反應(yīng)至無 氫氣放出時(shí)為止；6)將步驟4)中溶脹好的共聚物微球投入步驟5)中的0 -⑶鈉鹽溶液中，并加入 12g KI與20g Bu4NBr，于70°C的水浴搖床中攪拌反應(yīng)15h，而后加入75ml 40%Na0H溶液， 并滴加18ml EPH和18ml去離子水后，于70°C的水浴搖床中繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，最后加入鹽 酸溶液調(diào)節(jié)體系PH = 7后，抽濾、固體產(chǎn)物先用DMF淋洗，再用熱水洗滌直至洗滌液在紫外 光譜檢測(cè)中無吸收峰，篩分得到粒徑分布為150 355 u m,密度為1. 39g/cm3的復(fù)合GMA/ Zr02共聚物微球；8)用制得的復(fù)合GMA/&02共聚物微球裝填擴(kuò)張床柱，裝填高度為10cm，用 0. 01mol/L, pH = 6. 8的磷酸鹽緩沖液在線性流速為330cm/h，擴(kuò)張率為2. 2的條件下，平 衡吸附層析柱lh后，將稀釋后的石榴皮提取物上樣，吸附結(jié)束后，用去離子水洗滌4個(gè)柱 體積，至洗滌液在紫外光譜儀275nm無吸收峰，按照固定床模式用濃度為50% 70%的 乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為8個(gè)柱體積，得到的石榴皮多酚經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為 66. 93%。
權(quán)利要求
一種復(fù)合GMA/ZrO2共聚物微球，其特征在于，所述的共聚物微球?yàn)楹藲?fù)合結(jié)構(gòu)，內(nèi)核的組分為ZrO2，外殼的組分為甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA與二乙烯苯DVB，微球中，ZrO2的質(zhì)量百分含量為0.5～14％，GMA的質(zhì)量百分含量為50～70％，余量為DVB；共聚物微球的粒徑分布范圍為120～400μm。
2.一種復(fù)合GMA/&02共聚物微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)將&02、甲苯與硬脂酸按質(zhì)量比3 1 20 1混合，攪拌升溫至85 95°C反應(yīng) 3 5h，烘干，得到表面改性的&02 ；2)將氯化鈉和明膠加入去離子水中，升溫至55 65°C，加熱攪拌0.5 1. 5h，得到 含有氯化鈉和明膠的分散相水溶液，分散相水溶液中氯化鈉和明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2 10%禾口 0. 5 3% ；3)將步驟1)制得的表面改性的&02與單體甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA、交聯(lián)劑二乙烯 苯DVB、引發(fā)劑過氧化苯甲酰BP0和致孔劑甲苯與正庚烷混合，攪拌得到聚合相溶液，其中， &02的用量為GMA質(zhì)量的1 15%，GMA與DVB的體積比為10 1 1，BP0的用量為GMA 質(zhì)量的0. 5 1. 5%，致孔劑的用量為GMA體積的50 150%，致孔劑中，正庚烷的用量為 甲苯體積的10 75% ；4)將步驟2)制得的分散相溶液與步驟3)制得的聚合相溶液按體積比1.5 5 1 混合，在55 65°C條件下攪拌反應(yīng)0. 5 1. 5h，而后繼續(xù)攪拌升溫至85 95°C反應(yīng)6 10h固化、洗滌、干燥，得到GMA/&02共聚物微球，再將GMA/&02共聚物微球加入到N，N- 二 甲基甲酰胺DMF中溶脹；5)將0-環(huán)糊精0 -⑶溶于DMF中并加入氫化鈉NaH后，常溫下攪拌反應(yīng)至無氫氣放 出為止，得到澄清透明的0 -⑶鈉鹽溶液，其中，DMF的用量為0 -⑶質(zhì)量的2 5倍，NaH 的加入量為3 -CD質(zhì)量的0. 1 0. 5% ；6)將溶脹后的GMA/&02共聚物微球加入步驟5)中制備的⑶鈉鹽溶液中，并加入 碘化鉀KI與四丁基溴化銨Bu4NBr，其中，0 -⑶鈉鹽溶液的用量為GMA/&02共聚物微球質(zhì) 量的5 15倍，KI與Bu4NBr的用量均為3 -⑶鈉摩爾數(shù)的1. 5 3倍，50 80°C加熱攪 拌反應(yīng)10 15h，而后加入質(zhì)量濃度為25 40 %的NaOH溶液，滴加環(huán)氧氯丙烷EPH和去 離子水，50 80°C繼續(xù)加熱攪拌反應(yīng)2 5h，其中，NaOH溶液的加入量為0 -⑶鈉鹽溶液 體積的20 50%，EPH和去離子水的加入量均為NaOH溶液體積的10 30%，最后加入鹽 酸溶液調(diào)節(jié)體系至pH = 6 8后，抽濾、洗滌、烘干，得到復(fù)合GMA/&02共聚物微球。
3.一種復(fù)合GMA/&02共聚物微球的應(yīng)用，其特征在于，所述的復(fù)合GMA/&02共聚物微 球作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)，用于從石榴皮提取物中分離純化石榴皮多酚，具體步驟如下1)用復(fù)合GMA/&02共聚物微球裝填擴(kuò)張床柱，并用濃度為0.01 0. 05mo 1/L，pH為 5 8的磷酸鹽緩沖溶液平衡吸附層析柱1 2h后，將稀釋后的石榴皮提取物上柱；2)吸附結(jié)束后，用去離子水洗滌柱體至洗滌液在紫外檢測(cè)中于275nm處無吸收峰；3)用濃度為40 80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為4 10倍柱體積，分離 提純出石榴皮多酚。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)合GMA/ZrO2共聚物微球及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明微球的粒徑為120～400μm，內(nèi)核組分為ZrO2，外殼組分為GMA與DVB，微球中，ZrO2的質(zhì)量百分含量為0.5～14％，GMA的質(zhì)量百分含量為50～70％，余量為DVB。本發(fā)明通過將含有GMA、DVB、表面改性的ZrO2、BPO、甲苯與正庚烷的聚合相與含有明膠和氯化鈉的分散相水溶液混合，加熱固化成微球后；再以微球?yàn)檩d體，在NaH、KI和Bu4NBr存在的條件下固載β-CD，得到復(fù)合GMA/ZrO2共聚物微球。本發(fā)明微球球形規(guī)則，密度大，耐酸堿和親水性好，可作為擴(kuò)張床吸附基質(zhì)，應(yīng)用于從石榴皮提取物中分離純化石榴皮多酚。
文檔編號(hào)B01D15/02GK101869778SQ20091008288
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者宋航彬, 張劍鋒, 相陽, 袁其朋 申請(qǐng)人:西安瑞仁生物技術(shù)有限公司