專利名稱：殼寡糖親水色譜固定相及其制備方法
專利說明殼寡糖親水色譜固定相及其制備方法 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及液相色譜固定相技術(shù)，具體的說，是一種使用“鏈接化學”(click chemistry)作為鍵合方法鍵合殼寡糖親水色譜固定相的制備方法。
技術(shù)背景
親水作用色譜(英文簡稱HILIC)是近年來發(fā)展起來的用于分離強極性組分的色譜技術(shù)，是一種以極性固定相(如硅膠或衍生硅膠)及含高濃度極性有機溶劑和低濃度水溶液為流動相的色譜模式，它解決了傳統(tǒng)反相色譜疏水性固定相，如C18，C8等對強極性化合物，如寡糖，糖苷，強極性寡肽等保留很弱，甚至無保留的問題。親水作用色譜用于分離極性化合物，如氨基酸，肽和糖等已有文獻報道。親水作用色譜的固定相依然是使用正相固定相，主要是直接使用硅膠、氨基、酰胺基、二醇基、糖類等作為固定相，但是，不同類型的固定相存在著不同的保留機制和分離效能，當然，有些類型的固定相存在一些比較大的缺點，例如，硅膠柱容易發(fā)生不可逆吸附現(xiàn)象，氨基柱會和糖類生成Schiff堿，從而影響分離。目前，專門為親水作用色譜開發(fā)的固定相剛剛起步，商品化的親水作用色譜固定相種類較少，因而需要開發(fā)其他類型的固定相來滿足親水作用色譜的發(fā)展要求。
“鏈接化學”、或為“點擊化學”(click chemistry)是由貝瑞·夏普利斯(K.Barry Sharpless)等提出的，其核心是用少量簡單可靠和高選擇性的化學轉(zhuǎn)變來獲得更廣泛的分子多樣性，它開創(chuàng)了快速、有效、甚至是100％可靠的、高選擇性地制造各類新化合物的合成化學新領(lǐng)域。其中，最為廣泛應(yīng)用的反應(yīng)是Huisgen 1，3-diploar cycloaddition反應(yīng)，它在色譜固定相的合成上發(fā)揮了很重要的作用，其反應(yīng)式如下

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的殼寡糖親水色譜固定相及其制備方法，以滿足在親水作用色譜模式下實現(xiàn)對強極性化合物的分離。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 一種殼寡糖親水色譜固定相，其結(jié)構(gòu)為
其中，n＝1～9， 1，2，3-三唑環(huán)位置不確定。
一種殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征是，使用“鏈接化學”作為鍵合方法鍵合殼寡糖分子，包括以下步驟 (1)硅膠表面引入炔基 ①在有機溶劑中加入硅烷偶聯(lián)劑、丙炔胺，硅烷偶聯(lián)劑、丙炔胺的摩爾比為1～5∶1.2～5，于60～150℃條件下反應(yīng)6～36小時； ②然后加入活化的微球型硅膠，每克微球型硅膠所需的硅烷偶聯(lián)劑為1～10mmol； ③在80～120℃條件下繼續(xù)反應(yīng)12～48小時后，用砂芯漏斗過濾，依次用二氯甲烷、甲醇、丙酮洗滌，得到固體物； ④將步驟(1)③所得的固體物于真空干燥箱中在40～120℃條件下干燥6～12小時，即得末端炔基硅膠； (2)用“鏈接化學”鍵合殼寡糖固定相 ①將步驟(1)制備的炔基硅膠加入體積比為2/1～10/1的水/甲醇混合溶劑中，每克炔基硅膠所需混合溶劑量20～50mL； ②再加入修飾有疊氮基團的殼寡糖及催化劑，修飾有疊氮基團的殼寡糖加入的摩爾劑量為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～15倍，催化劑為二價銅和抗壞血酸鈉，所用摩爾劑量分別為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～10％和2～40％； ③在10～80℃條件下反應(yīng)72～200小時后，用砂芯漏斗過濾，依次用水、重量濃度為2～20％的EDTA二鈉水溶液、水、甲醇、丙酮洗滌，得到固體物； ④將步驟(2)③所得的固體物于真空干燥箱中在40～80℃條件下干燥6～12小時，即得殼寡糖親水色譜固定相。
上述步驟(1)①采用的有機溶劑為N，N--二甲基甲酰胺，每克硅膠所需有機溶劑的量為5～30mL。
上述步驟(1)①采用的硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)為
其反應(yīng)式為
上述步驟(1)②采用的微球型硅膠是為粒徑和孔徑均勻的全多孔硅膠球狀體，其粒徑為5～40μm，孔徑為60～300
上述步驟(2)②采用的修飾有疊氮基團的殼寡糖的結(jié)構(gòu)為
其中，n＝1～9， 疊氮基位置不確定， 步驟(2)的反應(yīng)式為
其中，R的結(jié)構(gòu)是
式中，n＝1～9， 疊氮基位置不確定； 上述步驟(2)②采用的修飾有疊氮基團的殼寡糖的摩爾劑量為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～5倍。
上述步驟(2)②采用的催化劑為二價銅和抗壞血酸鈉，所用劑量分別為修飾有末端炔基的硅膠摩爾劑量的5～10％和10～30％。
本發(fā)明的積極效果是 (1)采用殼寡糖作為極性功能基團，其結(jié)構(gòu)簡單，而且作為極性固定相在親水作用液相色譜模式下可以實現(xiàn)對強極性化合物的高效分離； (2)殼寡糖作為功能基團，其性質(zhì)十分穩(wěn)定，其表面結(jié)構(gòu)不會因為pH的改變而發(fā)生變化，也不容易與溶質(zhì)分子發(fā)生反應(yīng)。
(3)采用“鏈接化學”作為鍵合反應(yīng)方法，可以在溫和的條件下實現(xiàn)高選擇性和高轉(zhuǎn)化率的固載。


附圖1為本發(fā)明殼寡糖親水色譜固定相的制備方法的流程框圖； 附圖2為本發(fā)明實施例制備的殼寡糖固定相用于親水模式下分離核苷的色譜圖； 附圖3為本發(fā)明實施例制備的殼寡糖固定相用于親水模式下分離寡糖的色譜圖； 具體實施方式
本發(fā)明所述的殼寡糖親水色譜固定相可有效地用于親水作用色譜模式下對極性化合物的分離，以下結(jié)合

給出本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明做進一步的說明；提供的實施例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明實施范圍的限定。
實施例包含以下步驟 (1)疊氮磺酰咪唑鹽酸鹽的制備 將50mmol磺酰氯(約4mL)在冰水浴下滴加入50mmol NaN3(約3.2g)的100mL無水MeCN的懸浮液中，混合物在室溫下攪拌過夜； 將100mmol咪唑(約6.8g)在冰水浴下慢慢加入上述體系中，得到的乳濁液在室溫下再攪拌過夜； 在混合物中加入75mL乙酸乙酯稀釋，依次用2×75mL H2O，2×120mL飽和NaHCO3溶液進行萃取，有機相加入無水Na2SO4干燥，抽濾，成鹽將HCl的EtOH溶液(5.4mL乙酰氯在冰水浴下滴加到19mLEtOH中生成)滴加到上述有機相中，析出白色固體，抽濾，用乙酸乙酯洗滌，得到固體疊氮磺酰咪唑鹽酸鹽； (2)疊氮殼寡糖的制備 將1.2mmol疊氮磺酰咪唑鹽酸鹽(約0.25g)加入由0.66g殼寡糖、2mmolK2CO3(0.28g)、10μmol CuSO4·5H2O(2.5mg)和5mL MeOH構(gòu)成的混合物中，在室溫下反應(yīng)17小時(h)，濃縮，除去MeOH，加入少量EtOH，超聲，抽濾，用EtOH洗滌，得到的淡褐色固體為疊氮殼寡糖； (3)炔基硅膠的制備 在250mL三口燒瓶中加入100mL無水N，N-二甲基甲酰胺、35mmol(約8.66mL)3-異氰酸丙基三乙氧基硅烷、42mmol丙炔胺(約2.88mL)，在85℃條件下反應(yīng)12小時(h)，然后加入粒徑為5μm的球形硅膠顆粒10g，在110℃條件下再反應(yīng)31小時(h)，然后依次用300mL二氯甲烷、500mL甲醇、250mL丙酮洗滌，在60℃條件下真空干燥7小時，即得到末端炔基硅膠； (4)利用“鏈接化學”制備殼寡糖親水色譜固定相 取2.5g干燥后的末端炔基硅膠置于反應(yīng)器中，加入60mL水、30mL甲醇、5mmol疊氮殼寡糖(約2.10g)，然后加入0.25mmol硫酸銅和0.75mmol抗壞血酸鈉作為催化劑，室溫下反應(yīng)108小時(h)，依次用500mL水、300mL 10％的EDTA二鈉溶液、300mL水、250mL丙酮洗滌，室溫下真空干燥12小時，即得殼寡糖固定相產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)為
(n＝1～9，1，2，3-三唑環(huán)位置不確定)； (5)裝柱進行色譜評價 將所得的殼寡糖親水色譜固定相填裝于2.1mm×100mm的不銹鋼HPLC色譜柱中，制得的色譜柱用于測試其在親水色譜模式下對強極性化合物的保留和分離混合樣品。
用于分離核苷的條件為乙腈/水作為流動相，乙腈和水的體積比為90∶10，流速0.2mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為254nm，色譜圖如附圖2所示(圖中1為尿嘧啶，2為尿苷，3為腺嘌呤，4為胞嘧啶，5為胞苷，6為鳥苷)；分離結(jié)果顯示，在本發(fā)明所提供的殼寡糖柱上，反相色譜柱死時間流出的強極性化合物尿嘧啶得到了很好的保留，并且其他核苷得到了很好的基線分離，表現(xiàn)出典型的親水作用模式特征和良好的分離選擇性。
用于分離寡糖的條件為乙腈/100mM醋酸胺/水作為流動相，梯度洗脫，0min，乙腈(85)，100mM乙酸銨(10)，水(5)；20min，乙腈(75)，100mM乙酸銨(10)，水(15)，流速0.2mL/min，柱溫為30℃，蒸發(fā)光散射檢測氮氣霧化氣壓力25psi；漂移管溫度70℃，增益100，色譜圖如附圖3所示(圖中1為木糖，2為葡萄糖，3為松二糖，4為海藻糖，5為松三糖，6為棉籽糖)；分離結(jié)果顯示，在本發(fā)明所提供的殼寡糖柱上，幾個單糖和寡糖得到了很好的基線分離，表現(xiàn)出典型的親水作用模式特征和良好的分離選擇性。
權(quán)利要求
1.一種殼寡糖親水色譜固定相，其特征在于，其結(jié)構(gòu)為
其中，n＝1～9，
1，2，3-三唑環(huán)位置不確定。
2.一種如權(quán)利要求1所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，使用“鏈接化學”作為鍵合方法鍵合殼寡糖分子，包括以下步驟
(1)硅膠表面引入炔基
①在有機溶劑中加入硅烷偶聯(lián)劑、丙炔胺，硅烷偶聯(lián)劑、丙炔胺的摩爾比為1～5∶1.2～5，于60～150℃條件下反應(yīng)6～36小時；
②然后加入活化的微球型硅膠，每克微球型硅膠所需的硅烷偶聯(lián)劑為1～10mmol；
③在80～120℃條件下繼續(xù)反應(yīng)12～48小時后，用砂芯漏斗過濾，依次用二氯甲烷、甲醇、丙酮洗滌，得到固體物；
④將步驟(1)③所得的固體物于真空干燥箱中在40～120℃條件下干燥6～12小時，即得末端炔基硅膠；
(2)用“鏈接化學”鍵合殼寡糖固定相
①將步驟(1)制備的炔基硅膠加入體積比為2/1～10/1的水/甲醇混合溶劑中，每克炔基硅膠所需混合溶劑量20～50mL；
②再加入修飾有疊氮基團的殼寡糖及催化劑，修飾有疊氮基團的殼寡糖加入的摩爾劑量為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～15倍，催化劑為二價銅和抗壞血酸鈉，所用摩爾劑量分別為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～10％和2～40％；
③在10～80℃條件下反應(yīng)72～200小時后，用砂芯漏斗過濾，依次用水、重量濃度為2～20％的EDTA二鈉水溶液、水、甲醇、丙酮洗滌，得到固體物；
④將步驟(2)③所得的固體物于真空干燥箱中在40～80℃條件下干燥6～12小時，即得殼寡糖親水色譜固定相。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(1)①采用的有機溶劑為N，N--二甲基甲酰胺，每克硅膠所需有機溶劑的量為5～30mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(1)①采用的硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)為
其反應(yīng)式為
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(1)②采用的微球型硅膠是為粒徑和孔徑均勻的全多孔硅膠球狀體，其粒徑為5～40μm，孔徑為
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(2)②采用的修飾有疊氮基團的殼寡糖的結(jié)構(gòu)為
其中，n＝1～9，
疊氮基位置不確定。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，步驟(2)的反應(yīng)式為
其中，R的結(jié)構(gòu)是
式中，n＝1～9，
疊氮基位置不確定。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(2)②采用的修飾有疊氮基團的殼寡糖的摩爾劑量為硅膠上炔基的摩爾劑量的1～5倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，其特征在于，上述步驟(2)②采用的催化劑為二價銅和抗壞血酸鈉，所用劑量分別為硅膠上炔基的摩爾劑量的5～10％和10～30％。
全文摘要
本發(fā)明殼寡糖親水色譜固定相的制備方法，采用“鏈接化學”作為鍵合反應(yīng)方法鍵合殼寡糖，首先在硅膠表面引入末端炔基，然后以水、甲醇或這些溶劑的混合體為反應(yīng)溶劑，將修飾有疊氮基團的殼寡糖鍵合到硅膠表面，即得殼寡糖親水色譜固定相；采用殼寡糖作為極性功能基團，其結(jié)構(gòu)簡單，而且作為極性固定相在親水作用液相色譜模式下可以實現(xiàn)對強極性化合物的高效分離；殼寡糖作為功能基團，其性質(zhì)十分穩(wěn)定，其表面結(jié)構(gòu)不會因為pH的改變而發(fā)生變化，也不容易與溶質(zhì)分子發(fā)生反應(yīng)；采用“鏈接化學”作為鍵合反應(yīng)方法，可以在溫和的條件下實現(xiàn)高選擇性和高轉(zhuǎn)化率的固載。
文檔編號B01J20/288GK101757897SQ20091019731
公開日2010年6月30日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者梁鑫淼, 黃洪雪, 薛梅云, 褚長虎 申請人:華東理工大學