專利名稱：用于進(jìn)行生物學(xué)檢測的檢測設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)中的檢測技術(shù)，特別是在診斷，基因組的研究和分子生物學(xué)中所應(yīng)用的多重化。本發(fā)明使用了微細(xì)加工技術(shù)和來自半導(dǎo)體技術(shù)的技術(shù)和方法。
背景技術(shù)：
生物學(xué)檢測允許檢測生物樣品中的靶分子。典型地，靶分子的檢測是通過利用以檢測分子(配體)功能化的固體表面(例如，微陣列或孔的底部)或納米載體或微載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行的，所述檢測分子被設(shè)計(jì)為結(jié)合特定的靶。生物學(xué)檢測技術(shù)的一個(gè)挑戰(zhàn)是發(fā)生在檢測過程中的物質(zhì)傳遞的加速。物質(zhì)傳遞的問題在多重檢測中進(jìn)一步加劇，其中由于各探針的相對密度比單一檢測中的低，在單一的生物樣品中同時(shí)尋找多個(gè)靶分子。為了克服物質(zhì)傳遞的限制，描述了不同的裝置，如在微通道中進(jìn)行多重檢測，從而減少靶和探針之間的擴(kuò)散距離。例如，J. K.-K. Ng等人(2007), Anal. Chem Acta 582， PP.四5-303，描述了包含通過生物素-鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合而以寡聚核苷酸功能化的微珠的微流設(shè)備。該微流設(shè)備由具有變化部分的寬的室組成并且具有將微珠限制在單層排布中的壩。順次導(dǎo)入由未功能化的間隔珠隔開的不同微珠組。由文件中的圖fe可見，由于顆粒與間隔組的顆粒相混合，微珠形成了具有不確定邊界的大組。由于所述珠沒有將它們相互區(qū)別開的特征，如尺寸，形狀或編碼，不同組的邊界是未知的，并且只在檢測樣品中分析物的存在的檢測后才被顯露。因此，J. K. -K. Ng等人所描述的裝置不適于多重檢測，因?yàn)椴豢赡芸煽康販y定樣品中數(shù)個(gè)靶的存在與否。例如，當(dāng)樣品中沒有與連續(xù)的組相應(yīng)的數(shù)種分析物時(shí)，在微通道的整個(gè)部分將沒有信號被記錄。因此，將難以確立此部分實(shí)際上相應(yīng)于多少組(因此，對于實(shí)際上缺少多少分析物將沒有指示)。也將難以甚至不可能確立與連續(xù)的組相反應(yīng)的隨后分析物的特性，因?yàn)樵谶@些組的順序中的位置不能被可靠地確立。EP1712282A2,W000/061198A1 和 W004/025560A1 描述了具有置于微通道內(nèi)的微載體元件的裝置，例如它們的運(yùn)動(dòng)在微通道中是受限制的。通過使液體流過進(jìn)行檢測。由于擴(kuò)散距離小以及樣品相對于微載體的運(yùn)動(dòng)將靶分子帶到受體分子的附近，此類裝置對于物質(zhì)傳遞是有效的。此類型裝置也通過減少所需試劑的量降低了花費(fèi)。但是，在EP1712^2A2和W000/061198A1中，微通道中微載體的順序是非常重要的，因?yàn)樗_定了微載體的特性。在W02004025560A1中，微載體被編碼從而使他們在微通道中的順序沒有如EP1712^2A2中一樣關(guān)鍵。仍然，W02004025560A1的公開只描述了微載體在彼此的后面嚴(yán)格排列的構(gòu)型從而滿足所提出的解碼機(jī)制的要求，所述機(jī)制需要微載體編碼的特定布置以允許它們的鑒別。EP1712282A2,W000/061198A1 和 W004/025560A1 描述了在實(shí)踐中不容易制備的裝置，因?yàn)樗鼈冃枰谑芟薜目臻g中非常受控地導(dǎo)入微載體，控制它們的順序或?yàn)榱私獯a的目的而排列它們。為了實(shí)現(xiàn)此種構(gòu)型，需要專門的方法和特定的設(shè)置，包括顯微鏡檢查，微操作(利用顯微控制的力量)和/或微細(xì)加工技術(shù)。
的確，將微載體導(dǎo)入微通道中需要通過涉及對單個(gè)微載體進(jìn)行復(fù)雜微操作的一些方法(如W00061198A1中所描述的)，或者，當(dāng)各微載體的準(zhǔn)確位置不需要被控制時(shí)，通過引導(dǎo)它們從大批進(jìn)入小的微通道中的某種漏斗機(jī)制(如W004/025560A1中所描述的)。在實(shí)踐中漏斗機(jī)制的建立是較簡單的，但是通過在微通道1的入口形成拱形(圖14和1 而對于堵塞是敏感的。除了漏斗方法，W004/025560A1建議了通過三明治法產(chǎn)生檢測棒，其中將珠置于具有槽溝的較低的板上。隨后，將較高的板放在上面并附著于所述較低的板。制備現(xiàn)有技術(shù)中所描述的裝置所需的復(fù)雜水平的一個(gè)實(shí)際后果是它減少了被用于生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員研究所用的靈活構(gòu)型的可能性。例如，將很難允許實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員制備定制的構(gòu)型，所述技術(shù)人員將想要在微載體上使用其自己的生物化學(xué)包被過程(例如，為了測試在開發(fā)中的生物探針)，然后將它們導(dǎo)入所述裝置中進(jìn)行生物學(xué)檢測。因此，本領(lǐng)域?qū)τ谙铝袡z測設(shè)備和方法有需要其改善了基于微載體的生物學(xué)多重檢測中的物質(zhì)傳遞并簡化了用于制備所述裝置、執(zhí)行生物學(xué)檢測和進(jìn)行必要的讀數(shù)的整個(gè)過程。本發(fā)明的公開因此，本發(fā)明的一般性目的是提供下述設(shè)備和方法，特別是用于多重檢測的設(shè)備和方法其允許改善的物質(zhì)傳遞，以及對制備過程和進(jìn)行生物學(xué)多重檢測的簡化。本發(fā)明提供了作為反應(yīng)室的微通道，其同時(shí)包含數(shù)組經(jīng)編碼的微載體(即，具有附著于其表面的配體的微顆粒)，例如所述微載體相對于微通道橫截面的形狀和尺寸允許在微通道的整個(gè)長度上所述微載體中的至少兩個(gè)并排排列而不相互接觸并且當(dāng)在微通道中縱向移動(dòng)時(shí)(例如在填充過程中)不接觸微通道的周邊。優(yōu)選地，可在微通道內(nèi)觀察所述微載體。所述裝置還包含限制所述微載體在所述微通道中縱向運(yùn)動(dòng)而仍然讓液體流過的某些工具。通常包含一個(gè)或多個(gè)靶分子的生物樣品流過受限的或被固定的微載體，從而所述微載體不跟隨生物樣品流。樣品相對于微載體的運(yùn)動(dòng)將靶分子帶到受體分子的附近，增加了結(jié)合的機(jī)會(huì)，并因此減少了進(jìn)行物質(zhì)傳遞所需的孵育時(shí)間。為了獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)且獨(dú)立于其位置而區(qū)分不同的組，編碼微載體，例如所述編碼指示它們的功能。本發(fā)明的重要方面在于微載體相關(guān)于微通道橫截面的相對形狀和尺寸，以促進(jìn)所述裝置的制備。EP1712^2A2，W000/061198A1和W004/025560A1中描述的現(xiàn)存技術(shù)要求嚴(yán)格控制微載體在微流通道中的排布，這是不容易達(dá)到的，因?yàn)榭刂迫绱诵〕叽?例如，在微米范圍內(nèi))的物體是不平常的且需要專門的方法和特定的設(shè)置，包括顯微鏡檢查、微操作 (使用顯微控制的力量)和/或微細(xì)加工技術(shù)。在本發(fā)明中，微載體在微通道內(nèi)部具有高得多的運(yùn)動(dòng)自由。本發(fā)明的微載體的形狀尺寸使得至少兩個(gè)微載體可在作為反應(yīng)室的微通道的整個(gè)長度上(尤其在其入口處)被并排排列而不相互接觸且不接觸微通道的周邊。這意味著，將以不同速度在微通道的縱向方向運(yùn)動(dòng)的微載體將能夠經(jīng)過彼此直至其縱向運(yùn)動(dòng)受到限制的點(diǎn)。這一特征對于促進(jìn)所述裝置的實(shí)際構(gòu)建是關(guān)鍵的，當(dāng)在研究環(huán)境中、就在進(jìn)行檢測之前制備所述裝置時(shí)，這是特別重要的，其允許了在制備微載體組混合物中的靈活性。使用比微載體的尺寸相對寬得多的微通道有下列效果減少在微通道的入口形成將堵塞所述入口的拱形的可能性。這還允許使用擴(kuò)大的進(jìn)口而不是狹窄的漏斗以加載微通道。第二個(gè)優(yōu)勢在于減少阻塞微載體的大部分的機(jī)會(huì)(如果在微通道的內(nèi)部有障礙物的話)。障礙物可以是不需要的元件(例如微通道中的碎片(灰塵)或氣泡)或者可以是促進(jìn)微流通道的微細(xì)加工所必需的內(nèi)置特征(例如當(dāng)使用軟的聚合物(例如PDMS)時(shí)，用于確保微通道的適當(dāng)剛性的柱狀物)。本發(fā)明還提供了用于進(jìn)行基于微載體并適于多重化的檢測的方法，包括下列步驟a)提供包含作為反應(yīng)室的微通道的檢測設(shè)備，并提供至少兩組經(jīng)編碼的微載體， 其中所述微載體的編碼指示功能，并且其中所述微載體相對于微通道橫截面的形狀和尺寸允許在微通道的整個(gè)長度上使所述微載體中的至少兩個(gè)并排排列而不相互接觸且不接觸所述微通道的周邊；b)用所述至少兩組經(jīng)編碼的微載體至少部分地填充所述微通道；c)限制所述微載體在所述微通道中的縱向運(yùn)動(dòng)，而仍然讓液體流過；d)使?jié)撛诘匕粋€(gè)或多個(gè)靶分子的樣品流過包含所述微載體的所述微通道；e)鑒別微載體組；和f)檢測配體和靶分子之間的反應(yīng)并將反應(yīng)的有無與特定的組相關(guān)聯(lián)，以推斷所述樣品中靶分子的有無。在傳統(tǒng)溶液中(例如使用多個(gè)孔)，利用基本的攪動(dòng)技術(shù)改善物質(zhì)傳遞，從而使樣品和微載體元件均被隨機(jī)攪動(dòng)。在微觀上，當(dāng)液流是層式的時(shí)，此技術(shù)僅最低限度地增加了微載體關(guān)于樣品的相對運(yùn)動(dòng)，所述相對運(yùn)動(dòng)是確保有效的物質(zhì)傳遞的關(guān)鍵元素。本發(fā)明將樣品和微載體的運(yùn)動(dòng)分離。此外，細(xì)長的反應(yīng)室設(shè)置和微載體周圍有限的體積確保了樣品接近最大數(shù)目的微載體而通過。本申請中公開的檢測和方法所實(shí)現(xiàn)的優(yōu)勢是通過減少對擴(kuò)散的依賴而加速物質(zhì)傳遞，以使目的分子與潛在的受體相接觸。其它的優(yōu)勢包括所述機(jī)制的簡易性，這依賴于用于改善物質(zhì)傳遞的微通道的特性和幾何排布。所述裝置也允許靈活的液體操作而對于微載體的處理有最小的要求，例如，如果需要其它步驟用于進(jìn)行復(fù)雜的檢測時(shí)。如果需要使液體來回移動(dòng)(例如，如果液體的速度不能被可靠地控制，或者如果樣品被稀釋從而可能需要與微載體接觸而通過數(shù)次以確保適當(dāng)?shù)夭东@目的分子)，那么需要對所述裝置進(jìn)行很小的改造。本發(fā)明適于多重檢測，因?yàn)樗试S將各種功能與各種微載體組相結(jié)合，并在檢測中同時(shí)使用它們，而仍然能夠區(qū)分各種反應(yīng)，條件是所述反應(yīng)產(chǎn)生共定位于微載體中的信號。這是通過利用可鑒別的經(jīng)編碼的微載體工作而進(jìn)行的，因此允許確定它們攜帶何種功能。此外，微流裝置減少了進(jìn)行生物檢測所需樣品的量。其還通過允許其它試劑或洗滌溶液流過微通道而不必在微載體上進(jìn)行任何特別的操作，而促進(jìn)了實(shí)施任何所需的其它檢測步驟。與需要將微載體從反應(yīng)室中收集并移動(dòng)到讀數(shù)設(shè)備的傳統(tǒng)的基于微載體的方法相比，本發(fā)明也簡化了獲得檢測結(jié)果所需的整體操作。的確，在那些微通道至少是部分透明的實(shí)施方式中，可通過光學(xué)手段直接在微通道內(nèi)部觀察微載體，以鑒別所述組并進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)。這一構(gòu)型還使得能夠在反應(yīng)發(fā)生時(shí)通過觀察微載體而可能獲得動(dòng)力學(xué)信息。此外，本發(fā)明還通過促進(jìn)操作和降低向微通道中導(dǎo)入微載體所需的專門技術(shù)水平而簡化了檢測設(shè)備的制備，從而使得能夠使用就在進(jìn)行檢測之前(例如，在研究環(huán)境中)制備的定制的構(gòu)型。本發(fā)明可主要被用于生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)中，特別是在診斷，基因組研究和分子生物學(xué)中。


當(dāng)考慮下面的詳細(xì)描述時(shí)，將會(huì)更好地理解本發(fā)明，并且使得除了上面所列的那些目的之外的目的變得顯然。此類描述引用了附圖，其中圖1描繪了微通道1作為反應(yīng)室(以粗體顯示)的示例性實(shí)施方式，其入口 14與擴(kuò)大的末端6及進(jìn)口 5相連，它的出口 16與終止工具4 (以過濾結(jié)構(gòu)的形式)及出口 15相連。圖1. 1描繪了俯視圖，而圖1. 2顯示了通過圖1. 1的線A-A的剖視圖。圖2描繪了具有入口 14的微通道的示例性實(shí)施方式，所述入口 14具有擴(kuò)大的末端6和兩個(gè)進(jìn)口 5和5’。圖2. 1描繪了具有擴(kuò)大的部分6和兩個(gè)進(jìn)口 5和5’的微通道1 的俯視圖，而圖2. 2顯示了通過圖2. 1的線A-A的剖視圖。圖3描繪了具有入口 14的微通道1的示例性實(shí)施方式，所述入口 14具有擴(kuò)大的末端6和一個(gè)進(jìn)口 5。此圖還顯示了層狀流和孔7中的層式渦旋8。圖3.1顯示了微通道 1的俯視圖，和在微通道1的一個(gè)末端的其擴(kuò)大的部分6。圖3. 2代表通過圖3. 1的線A-A 的剖視圖并顯示了使得進(jìn)入微通道1的進(jìn)口 5和孔7，以及形成渦旋8的液流9。圖4顯示了示例性的實(shí)施方式，其中微載體2具有盤樣形狀(即，具有圓形正面的薄片形式的形狀)并且在具有矩形橫截面的微通道1中。所述微通道1具有兩個(gè)側(cè)壁101， 基底102和蓋子103。微通道1的橫截面使得微載體2形成單層排布并使它們的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)受限。圖4. 1顯示俯視圖，而圖4. 2顯示通過圖4. 1的線A-A的剖面視圖。圖4. 3顯示3-D 的表示形式。在所闡明的情形中，單層排布不是嚴(yán)格地在平面中的(微載體2的垂直位置可稍微變化，如圖4. 2所示)，但微載體2不能在彼此的頂上。微載體2的不同填充方式闡明了不同的組。圖5闡明了使用陣列類型的傳感器10 (例如CCD或C-MOS光電傳感器)來捕獲微載體2在微流通道1內(nèi)的單層排布的廣角影像。圖6顯示了示例性的實(shí)施方式，其中微載體2具有盤樣形狀并且在具有矩形橫截面的微通道1中。它闡明了微載體如何能夠具有相對自由的運(yùn)動(dòng)(在此例中在2D平面內(nèi)) 直到它們到達(dá)其縱向運(yùn)動(dòng)受到限制的點(diǎn)。這允許它們經(jīng)過彼此并減少了在存在障礙物的情況下阻塞大量微載體的風(fēng)險(xiǎn)。圖6. 1顯示了俯視圖，而圖6. 2顯示了通過圖6. 1的線A-A 的剖面視圖。圖6. 3顯示了 3-D表示形式。圖7顯示了微載體2的示例性實(shí)施方式，所述微載體2具有盤樣形狀以及穿過微載體2的穿越孔21圖案形式的編碼。微載體2顯示三角定向標(biāo)記20，其用于確定微載體2 是否是顛倒的并且還作為編碼圖案的起始點(diǎn)。微載體2在周邊具有編碼元件，因而圍繞微載體2的中心留下相當(dāng)部分的表面用于適于生物學(xué)讀數(shù)的專用的均一且平坦的區(qū)域。圖8顯示了兩幅由CXD相機(jī)攝取的圖像，其闡明了簡單的多重檢測中微載體2的生物學(xué)讀數(shù)。將兩組微載體2導(dǎo)入微通道中以DNA探針Pl (5，-CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT-3’ )功能化的第一組微通道11(用1個(gè)孔編碼)，和以另一個(gè)DNA探針P2(5’ -TGG GTA AGT TAG GGC GAT GG-3’)功能化的第二組微通道12 (用3個(gè)孔編碼)。然后涌入含有與探針Pl互補(bǔ)的經(jīng)熒光標(biāo)記的DNA靶Tl (5，Cy5-AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG-3，)的，并且只有以DNA探針Pl功能化的微通道11有反應(yīng)(見圖8. 1中的明視場(白光)與圖8. 2中的熒光之間的差別)。圖9闡明了當(dāng)檢測發(fā)生時(shí)如何隨時(shí)間進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)以提供關(guān)于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的信息。此圖還顯示了所述設(shè)備在物質(zhì)傳遞方面是非常高效的，因?yàn)樗茉趲酌胫袃?nèi)檢測雜交反應(yīng)(在靶濃度為200nM時(shí)進(jìn)行)。此圖像是由CCD相機(jī)在熒光下攝取的。圖10顯示了另一個(gè)示例性實(shí)施方式，其中具有盤樣形狀的經(jīng)編碼的微載體2(例如上面對于圖7所描述的)在具有矩形橫截面的微通道1中。微通道1的橫截面使得微載體2形成單層排布(它們不在彼此的頂上)，并且使其旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)受限，從而它們基本上平置于微通道內(nèi)。圖11闡明了用于多重化的芯片13。所述芯片包含含有數(shù)組功能化微載體2的數(shù)個(gè)微通道1。所述微通道1與進(jìn)口 5及出口 15相連。微載體2是盤形狀的并且是經(jīng)編碼的 (例如上面對圖10所描述的)。圖12闡明了具有薄片形式的微顆粒的各種例子。正面具有盤的形式(左)，正方形的形式(中間)或六邊形的形式(右)。圖13顯示了示例性的實(shí)施方式，其中微載體2具有盤樣形狀并以穿越孔21的圖案和L形的定向標(biāo)記20編碼。圖13. 1顯示微載體的明視場(白光)的圖。圖13. 2顯示了顯示流過樣品9后起反應(yīng)的微載體的熒光圖。兩個(gè)圖像均是在流過樣品9后攝取的。圖14顯示了拱形如何能在引導(dǎo)微載體2進(jìn)入狹窄的微通道1中的漏斗中形成，并從而堵塞微通道1的入口 14。圖15顯示了在漏斗構(gòu)建體中形成的微載體2的拱形的圖，所述拱形堵塞微通道1 的入口。圖16描繪了矩形或“接近矩形”形式的各種非限制性實(shí)例。當(dāng)它們是薄片形式時(shí)， 它們闡明了微通道1或微載體2的優(yōu)選的橫截面。圖17顯示了示例性實(shí)施方式的兩幅圖。利用了 PDMS成模技術(shù)制造并結(jié)合于顯微載玻片(如 Nam-iTrung Nguyen 和 Steve ffereley, ISBN :9781580533430,第 3 章， Fundamentals and Applications of Microfluidics 中所描述的)的芯片 13 包含一個(gè)末端與進(jìn)口 5相連并且另一個(gè)末端與出口 15相連的微通道1。在微通道1的出口建立了由以矩形柱狀物構(gòu)成的過濾結(jié)構(gòu)組成的終止工具4。此外，在微通道1中建立了圓柱形柱狀物 17，以在施用負(fù)壓時(shí)，輔助穩(wěn)定微通道的高度(即，避免它壓縮)。圖18顯示了包含還未被釋放的硅微顆粒的薄片的圖。所述微顆粒具有盤樣形狀， 并由穿越孔21的圖案編碼。微載體具有50微米的直徑并包括L形的定向標(biāo)記20。實(shí)施本發(fā)明的方式在本發(fā)明的范圍中，應(yīng)用了下列定義“多重化”指平行地進(jìn)行許多檢測，典型地在大量的化合物或分子上，具有單獨(dú)辨別各檢測結(jié)果的能力。這些檢測可以，例如是生物和/或化學(xué)性質(zhì)的，并且典型地涉及數(shù)種待檢測的靶分子及作為檢測那些靶分子的試劑的數(shù)種捕獲分子。所述捕獲分子典型地作為配體附著于載體基底上。在多重檢測中平行進(jìn)行的檢測的數(shù)目通常被稱為多重的“水平”， 并且范圍可以從僅僅數(shù)個(gè)0或3個(gè))到成千上萬個(gè)(對于較高水平的多重化而言)。后者通常是如今典型地在微陣列上進(jìn)行的核酸雜交檢測，但是其也可以通過本申請中公開的檢測設(shè)備進(jìn)行。
“單個(gè)檢測”指進(jìn)行單個(gè)檢測，其中只希望通過一種捕獲分子檢測一種靶分子。“反應(yīng)室”指靶分子與捕獲分子或配體之間發(fā)生生物和/或化學(xué)反應(yīng)的空間。“微通道”或“微流通道”指閉合的通道(即細(xì)長的液體通道)，具有微觀尺寸的橫截面(即最大尺寸(橫截面的)典型地為1至500微米，優(yōu)選10至500微米，更優(yōu)選20至 300微米，甚至更優(yōu)選30至300微米。)微通道具有縱向的方向，其不必須是直線并且其相應(yīng)于液體在微通道內(nèi)被導(dǎo)向的方向，即基本上是相應(yīng)于微通道中液體經(jīng)過的速度矢量的矢量和的方向(假設(shè)是層流態(tài))。微通道在一個(gè)末端具有入口 14，并在另一個(gè)末端具有出口 16，它們是微通道中的開口，例如分別讓液體進(jìn)入微通道，離開微通道。微通道的橫截面在其大部分長度中經(jīng)常是恒定的，但此截面可變化并且典型地可至少在接近入口 14或接近出口 16處擴(kuò)大，以便與進(jìn)口 5、與出口 15、與一個(gè)或多個(gè)其它微通道或與另一個(gè)微流組件 (如閥機(jī)制)相連。微通道可延伸從而使縱向上形成的線具有任何形狀或長度，并且可三維地延伸(即由縱向延伸形成的線不停留在平面內(nèi))。當(dāng)稱“橫截面”時(shí)，指與縱向軸垂直的橫截面。術(shù)語“周邊“指微通道的內(nèi)周或橫截面的周邊。“功能化的”指使具有一個(gè)或多個(gè)(但優(yōu)選一個(gè))配體附著于其表面的顆?；蛭㈩w粒，其可作為給定靶分子(分析物)的捕獲分子或受體分子。術(shù)語“分子”將被廣義地理解， 并且完全可包括數(shù)個(gè)分子、顆粒或細(xì)胞。例如，靶“分子”可以是病毒顆粒和/或捕獲“分子”(配體)可以是一組抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)例中，靶“分子”可以是核酸例如，DNA， RNA或ssDNA片段和捕獲“分子”可以是被設(shè)計(jì)為與前者雜交的另一種核酸，例如DNA，RNA 或ssDNA片段。為了特定地捕獲一個(gè)靶分子，也可以需要不同的捕獲分子。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所提及的實(shí)例將分別符合“捕獲分子”或“靶分子”的條件。配體和靶分子可以是天然的，合成的或半合成的。術(shù)語“功能”指與給定的靶分子結(jié)合和/或反應(yīng)的能力，并因而指特異性配體的存在。術(shù)語“配體”，“捕獲分子”和“受體分子”在本申請中同義地使用。同樣的也用于術(shù)語“靶分子”和“分析物”，盡管分析物可包含數(shù)個(gè)靶分子。“微顆?！敝赋叽缥⒂^的任何類型的顆粒，通常具有的最大尺寸為IOOnm至300微米，優(yōu)選Iym至200 μ ?！拔⑤d體”，如本申請中所使用的，是被功能化以分析和/或與樣品中的分析物反應(yīng)的微顆粒。術(shù)語“功能化微載體”在本申請中同時(shí)使用。當(dāng)描述與它們的功能不相關(guān)聯(lián)的方面時(shí)，例如幾何方面或微細(xì)加工方面，“微載體”和“微顆?！痹诒旧暾堉锌杀徽J(rèn)為是等同的?！敖M”或”微載體組”指具有相同功能的一個(gè)或多個(gè)微載體。一組可以只是一個(gè)微載體或多于一個(gè)微載體。一組微載體可以攜帶多于一個(gè)的捕獲分子以便捕獲兩個(gè)或更多的靶分子，但這仍然指一種功能。兩個(gè)可與彼此相區(qū)別的不同微載體組可以具有相同的功能。術(shù)語”生物學(xué)讀數(shù)’指檢測附著于微載體的配體是否與靶分析物結(jié)合或反應(yīng)。生物學(xué)讀數(shù)也可以提供指示已反應(yīng)的靶分析物的量的定量信息。如本申請中所用的，“編碼”是在觀察或感應(yīng)時(shí)可區(qū)分的微顆?；蛭⑤d體的特質(zhì)或特征，并且其被用于鑒別微顆?；蛭⑤d體或用于將微顆粒或微載體與特定的群體(例如，具有給定功能的微載體的群體)相聯(lián)系。微載體上的編碼可獨(dú)立于其位置并獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)而被確定，即它不要求顯露靶分析物的存在。典型地，編碼被表征為觀察時(shí)微顆?；蛭⑤d體的光學(xué)或磁性應(yīng)答。此應(yīng)答可以對于微顆?；蛭⑤d體作為整體而限定(例如，微載體的顏色)，或者可在微顆?；蛭⑤d體中或在微顆?；蛭⑤d體上進(jìn)行空間調(diào)節(jié)以產(chǎn)生有圖案的布局(例如，通過調(diào)節(jié)微載體上的顏色而得到的條形碼)。編碼的實(shí)例包括但不限于顏色，形狀，尺寸，印蓋的或雕刻的圖案，孔的構(gòu)型，全息圖案，磁性特征，化學(xué)組成，光透射或反射特征的修飾，量子點(diǎn)的發(fā)射或附著于表面的顯著可檢測的外來物體(例如，寡聚核苷酸或其它聚合物)。術(shù)語“經(jīng)編碼的微載體”，分別“經(jīng)編碼的微顆粒”在本申請中指具有編碼的微載體，分別地微顆粒。本發(fā)明的微載體是經(jīng)單獨(dú)編碼的，即各微載體帶其自身的編碼，即使數(shù)個(gè)微載體(典型地一個(gè)組的微載體)可以攜帶具有相同值的編碼(即單獨(dú)根據(jù)其編碼，微載體是不可以區(qū)分的)。本發(fā)明的不同組的經(jīng)編碼的微載體可以獨(dú)立于微載體在微通道中的位置且獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)而被區(qū)分和/或鑒別。如在本申請中所使用的，“并排”排布或“并排”放置指將兩個(gè)或更多個(gè)微顆粒的幾何形狀與微通道的幾何形狀相關(guān)聯(lián)的幾何特性。所述一個(gè)或多個(gè)微顆粒被稱為是在微通道中的給定位置“并排”排布的，如果它們(i)的構(gòu)型使得兩個(gè)或更多個(gè)微顆粒適合置于微通道內(nèi)和(ii)在所述給定位置與橫截面相交和(iii)它們沿著縱向投射的表面(在所述給定位置處)不重疊并且被包括在橫截面的表面內(nèi)(在所述給定位置處)。通常，在不在其整個(gè)長度上具有恒定橫截面的微通道中，有可能一個(gè)或多個(gè)微顆?？稍谀承┪恢茫辉谄渌恢?，并排排布(雖然這一通常的規(guī)則不適用于本發(fā)明的微通道1，本發(fā)明的微通道1要求在在其整個(gè)長度上能夠使微載體并排排列)。取決于微顆粒的幾何形狀，有可能僅當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)微顆粒在某些方位時(shí)，它們才能在微通道中的給定位置處并排排列。當(dāng)并排排列時(shí)， 微顆粒可相互接觸或在之間有距離?！氨∑问健痹诒旧暾堉兄肝㈩w粒的特別的形狀，其中高度顯著地小于寬度和長度 (例如，以至少兩倍)，并且所述微顆粒在頂部和底部具有兩個(gè)基本上平行和基本上平坦的表面(正面)(見圖12)。“盤樣”形狀指具有圓形正面的薄片形式。微通道本發(fā)明的微通道1優(yōu)選是直的(即縱向沿直線延伸)，但也可具有蛇形輪廓(即縱向延伸以形成具有與弧形相連的平行軌跡的線)，以限制足跡(footprint)。微通道1優(yōu)選基本上是平面的，但也可三維延伸。微流通道1的長度可取決于其橫截面和所需的足跡而變化，通常為了適合放入典型地包含它的微流芯片13中。典型地，它的范圍將為Imm至500厘米，優(yōu)選地為5mm至200 厘米。微通道的寬度和高度優(yōu)選地是500nm至300微米。例如，具有蛇形輪廓且具有小橫截面(例如，小于100微米)的微通道1可在相對小的足跡(幾平方厘米)中達(dá)到相對長的長度(例如幾百厘米)。例如，在一平方厘米中，可能放入具有50μπι截面的IOOcm長的蛇形微通道1(假定表面的一半被微通道1占據(jù)而另一半是空隙)。在很優(yōu)選的實(shí)施方式中，微通道1基本上是直的且具有2mm至IOmm的長度，200微米至600毫米的寬度和10微米至20微米的高度。本發(fā)明的微通道1具有入口 14和出口 16，分別讓液體9進(jìn)入、離開微通道1。入口 14還被用于將微載體2導(dǎo)入微通道1內(nèi)，并典型地與進(jìn)口孔5相連(優(yōu)選地通過擴(kuò)大的末端6)。本發(fā)明的微通道1優(yōu)選地如下所述在終止工具4處終結(jié)，并且典型地通過將液體 9引入出口 15的另一個(gè)微流通道(不作為反應(yīng)室)被延長。優(yōu)選地，微通道1具有的橫截面是矩形或接近矩形的(見圖16)，梯形的或類似平行四邊形的。微通道典型地具有兩個(gè)側(cè)壁101，基底102和蓋子103。所述側(cè)壁優(yōu)選地、但不必須是直的，并被置于與基底(底面)及蓋子(頂面)分別成接近90度的角度。所述側(cè)壁可被凹陷地或凸起地彎曲，或可以不垂直(例如45度或60度)的角度與基底或蓋子相連。典型地，微通道的高度顯著小于其寬度(例如，以至少兩倍)。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 基底102和/或蓋子103是略微彎曲的，或以溝槽或突起被構(gòu)型，例如為了促進(jìn)液體9的流動(dòng)。本發(fā)明的作為反應(yīng)室1的微通道1如此被設(shè)計(jì)，從而其含有至少兩組微載體2，例如任何兩個(gè)微載體2可并排排列而不相互接觸且在整個(gè)長度上不接觸周邊，特別是在入口 14處。在一個(gè)實(shí)施方式中，微通道1橫截面的至少一維尺寸大于任何兩個(gè)微載體2的最大投射表面的最大延伸之和。例如，在具有矩形或接近矩形的橫截面的微通道1和薄片形式的微載體2中，所述尺寸可以是大于任何兩個(gè)微載體2的寬度之和的微通道1的寬度。因此，微通道1具有的寬度可使得兩個(gè)微顆粒被并排排布而不抑制微顆粒在微通道1的縱向上運(yùn)動(dòng)(例如在填充過程中)。更優(yōu)選地，所述寬度使得微顆粒可經(jīng)過彼此而不相互接觸且不接觸微通道1的周邊，所述接觸由于摩擦也可導(dǎo)致阻塞。在優(yōu)選地實(shí)施方式中，微通道 1的橫截面優(yōu)選在微通道1的整個(gè)長度上是恒定的或是基本上恒定的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微通道1與擴(kuò)大的末端6相連，其中所述橫截面拓寬(典型地在入口 14處)以使微載體的導(dǎo)入容易。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，矩形或基本矩形的微通道的入口 14處的擴(kuò)大的末端 6是通過增加側(cè)壁101與縱軸的距離進(jìn)行的，而微通道的高度(即基底與蓋子間的距離)優(yōu)選地保持基本恒定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微通道1是由下列構(gòu)成的或包含下列硅、SU_8(環(huán)氧基光刻膠)、聚酰亞胺(PI)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、硅酮、或其它熱塑性彈性體(TPE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯(PTFE)、熱塑性彈性體(TPE)、Victrex PEEK 、聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、氟化乙烯-丙烯(FEP)、環(huán)烯烴共聚物(COP或C0C)、或其它熱塑性聚合物、石英、玻璃或可鍍的金屬(例如鎳，銀或金)、最優(yōu)選地是透明聚合物。最優(yōu)選地，所述微通道是由環(huán)烯烴共聚物構(gòu)成的。優(yōu)選地，微通道1在至少一側(cè)是透明的。從而，可通過用于光學(xué)檢測的相應(yīng)工具 (例如顯微鏡)容易地觀察所述微顆粒。這允許容易地鑒別用光學(xué)技術(shù)編碼的微載體2的組(當(dāng)它們被置于微通道1中時(shí))及通過本領(lǐng)域中用于此類測定的基于光學(xué)應(yīng)答的常規(guī)技術(shù)來確定生物學(xué)讀數(shù)。用于提供透明性的合適的材料是例如SU-8，PDMS或硅酮?？墒褂贸Ｒ?guī)的照相平板印刷術(shù)和/或沖壓和/或注射成模技術(shù)來制造微通道1， 文獻(xiàn)中廣泛地描述了所述技術(shù)(例如，F(xiàn)undamentals of microfabrication by Marc J.Madou, I SBN :0849308267,9780849308260, Fundamentals and Applications of Microfluidics by Nam-Trung Nguyen 和 Meve Wereley，ISBN :9781580533430,第 3 章)。 例如，可通過用已知的方法將通道蝕刻到基底中、然后用平板(例如由玻璃構(gòu)成的)或者用也刻蝕到基底中的第二通道來密封而產(chǎn)生微通道1。該微細(xì)加工技術(shù)也可被用于生產(chǎn)微顆粒，例如用于在薄片上產(chǎn)生硅微顆粒(如EP1276555B1中所述)。在被考慮的范圍中，液流是層狀的。為了確保樣品中的目的靶分子在微載體2的最多的附近經(jīng)過，微通道1的設(shè)計(jì)應(yīng)使得微載體2在其周圍打開允許樣品9流過的盡可能小的部分。流速將受例如，圍繞微載體打開的部分、微通道的長度、移動(dòng)液體的力量(例如， 所施加的壓力)和樣品的流體特性(粘度，樣品攜帶的分子的尺寸等)的限制。微載體和微載體組微通道1至少同時(shí)具有兩組微載體2，但也可以包含三，四，五，十或數(shù)百或更多組的微載體。對于更高水平的多重化(例如用于核酸雜交檢測)，微通道可含有成百上千的組。這例如，可利用長且寬的微通道1結(jié)合小的微載體2而實(shí)現(xiàn)。尺寸，形狀，和材料以及微顆粒與微載體之間的區(qū)別在定義部分被概述。本發(fā)明的微顆粒或微載體2可由常規(guī)用于高通量篩選技術(shù)和診斷的任何材料構(gòu)成或者包含任何所述材料。這些材料的非限制性實(shí)例包括乳膠，聚苯乙烯，交聯(lián)右旋糖酐， 聚甲基苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，纖維素，聚丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，氟化乙烯-丙烯，以及微細(xì)加工或微型研磨中通常使用的材料，如玻璃，SiO2，娃，PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)，金，銀，鋁，鋼或其它金屬或環(huán)氧基光刻膠(如SU-8)。微顆粒可以是任何形狀和尺寸的。優(yōu)選地，微載體2是由硅制成的。本發(fā)明的微載體2的編碼使得其功能可通過讀出所述編碼而被確定。微顆粒和微載體2優(yōu)選地具有球形的形狀或薄片的形式，這意味著它們的高度顯著小于(例如，以至少兩倍)它們的寬度和它們的長度，并且它們在頂部和底部具有兩個(gè)基本上平行和基本上平坦的表面(正面)。因此，當(dāng)具有薄片形式的微載體2如上所述被導(dǎo)入具有矩形或接近矩形的截面的微通道1中時(shí)，它們在其任一正面上平坦放置并且它們可通過光學(xué)手段被容易地檢測。圖 13顯示了薄片形狀的微載體2的示例性實(shí)施方式。主要表面可具有任何形狀，非限制性實(shí)例是正方形，矩形，圓形，三角或六邊形(圖12，右側(cè))。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微載體2具有正面為圓形形式的盤樣形狀，并且由穿越孔 21的圖案編碼，其優(yōu)選地還包含不對稱的定向標(biāo)記20(如三角形或L形標(biāo)志)。此種編碼和形狀的組合允許通過圖像解碼技術(shù)容易地鑒別。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微載體2具有磁性特性，所述特性例如適于將它們固定在微通道內(nèi)。各組的微載體2典型地被相同地功能化。所述微載體2完全可具有相對于彼此不同的尺寸和形狀。微載體2被編碼從而使各組可通過可觀察到的至少一個(gè)特質(zhì)或特征(即編碼)而相互區(qū)別。雖然所有的微載體2均被單獨(dú)地編碼，給定組的微載體2優(yōu)選地共享相同的編碼。由于使用了經(jīng)編碼的微載體2，可以任意的順序而不是受控的方式將它們導(dǎo)入。微載體2作為化學(xué)和生物學(xué)檢測的支持物。在這種職能中，微載體2可含有一種或多種附著于其表面的配體，并且可與靶分析物相接觸以確定特定的目的分析物存在于否，或者它們可作為用于在所附著的配體上進(jìn)行的組合化學(xué)反應(yīng)的支持物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，各微載體具有附著于其表面的一種配體。將被理解的是，如本申請中所使用的，術(shù)語“一種配體”不是指數(shù)量上的僅僅一個(gè)分子，而是指一類配體。大范圍的化學(xué)和生物學(xué)官
12能物(fimctiona lities)可作為配體被附著至本發(fā)明的微顆粒，包括抗體及其它蛋白質(zhì)以及核酸，例如DNA，RNA或ssDSNA片段或被設(shè)計(jì)為結(jié)合特定目的分子的適配子。這些官能物包括在高通量篩選技術(shù)和診斷中常規(guī)使用的所有官能物。此外，微載體2可以各種方式被功能化，以允許初始反應(yīng)物的附著。附著于微載體2的配體的靶分析物的實(shí)例包括抗原，抗體，受體，半抗原，酶，蛋白質(zhì)，肽，核酸，藥物，激素，致病原，毒素，細(xì)胞或任何其它目的化學(xué)品或分子。限制微載體的縱向運(yùn)動(dòng)的工具本發(fā)明提供了增加液流相對于微載體2的速度，以便提高液體9中的目的分子3 與附著于微載體2的受體8之間的接觸機(jī)會(huì)的工具。因此，重要的是限制微載體2在縱向的液流方向上的運(yùn)動(dòng)，而仍然讓液體9流過。限制工具的存在提供了基本上靜態(tài)的構(gòu)型用于進(jìn)行檢測和在相同的位置讀數(shù)，這使得除了更快的物質(zhì)傳遞外，能夠進(jìn)行動(dòng)力學(xué)讀數(shù)?？砂l(fā)生微載體2垂直于液流的移動(dòng)并且甚至可對物質(zhì)傳遞的速度有積極的影響(如果微載體 2的移動(dòng)足夠快的話)，因?yàn)樗黾恿瞬东@表面的實(shí)際尺寸(這是可通過，例如輕拍、振動(dòng)或超聲處理而實(shí)現(xiàn)的攪拌形式)。對微載體縱向運(yùn)動(dòng)的限制可以數(shù)種方式進(jìn)行。例如，可在反應(yīng)室1的末端使用讓液體9流過但阻礙微顆粒2通過的至少一種終止工具4。所述終止工具4的非限制性實(shí)例包括柵格，金屬線，濾網(wǎng)，堰構(gòu)建體，一個(gè)或多個(gè)柱狀物，微通道截面的減少，靜電力，特別是利用靜電力保留的一個(gè)或多個(gè)微顆粒，介電泳力，特別是利用介電泳力保留的一個(gè)或多個(gè)微顆粒，磁性顆粒等。基于非剛性微通道1的部分壓縮(即，收縮微通道的幾何結(jié)構(gòu)，例如在由軟的聚合物(如PDMS或石蠟)制成的微通道的情況中)的溶液也可被用作終止工具 4。終止工具4可以是固定的或可移去的?？梢迫サ慕K止工具(例如，磁性顆粒)允許在液流9的方向上容易地移除微顆粒2，用于替換微顆粒或微顆粒分析。固定的終止工具4(如柵格)可通過激光被移開，用于移除微顆粒2 (例如為了分析它們)。備選地或此外，如果微顆粒2具有磁性特性，可通過施用磁場使微載體2被固定。 因此，終止工具4的存在可不是必須的。在備選的實(shí)施方式中，通過利用介電泳力固定微載體2。由于微載體的受限運(yùn)動(dòng)，所述裝置還促進(jìn)了洗滌步驟，涌入其它試劑以及生物學(xué)讀數(shù)(其優(yōu)選在靜態(tài)模式中進(jìn)行)。與微載體相關(guān)的微通道的設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明，微通道1具有的橫截面允許所述微載體中的至少任意2個(gè)在微通道1 的整個(gè)長度上(特別是在入口 14處)并排排列而不相互接觸且不接觸周邊。應(yīng)注意，嚴(yán)格地說，作為反應(yīng)室1的本發(fā)明的微通道1在任何可能在微通道中建立的終止工具(例如，濾器或網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或截面的減少等)處終止。這意味著任何含有終止工具4的微流部分不被認(rèn)為是本發(fā)明的微通道1的部分，并且因此不要求允許兩個(gè)或更多個(gè)微載體2并排排列。為了清楚，當(dāng)微通道在終止工具4后繼續(xù)時(shí)，這部分被認(rèn)為是與本發(fā)明的微通道1 (作為反應(yīng)室)相連的另一個(gè)微通道(不作為反應(yīng)室)，例如為了允許液體通過出口離開(見圖1)。微通道1的橫截面和微載體2的形狀允許至少兩個(gè)微載體并排排列而不相互接觸且不接觸周邊這一事實(shí)并不意味著它們必須不相互接觸或接觸周邊。這只意味著，微通道1 和微載體2各自的幾何形狀不強(qiáng)迫微載體2在它們并排排列時(shí)相互接觸或接觸周邊，雖然當(dāng)它們在微通道1內(nèi)自由移動(dòng)時(shí)或當(dāng)它們在縱向運(yùn)動(dòng)受限后安定下來時(shí)，它們?nèi)钥赡苓@樣做。并排排列而不相互接觸且不接觸微通道1的周邊的能力意味著，如果微載體2在微通道1的縱向上以不同的速度運(yùn)動(dòng)，它們可經(jīng)過彼此而不經(jīng)受微通道1的壁或彼此的摩擦。此構(gòu)型減少了堵塞微通道1的入口 14的機(jī)會(huì)，因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)微載體2可在入口 14處并排排列時(shí)形成拱形要困難得多，并且在允許超過兩個(gè)微載體并排排列的優(yōu)選實(shí)施方式中明顯是更困難的。若微載體2中的一個(gè)被障礙物阻擋，它也允許微載體2經(jīng)過彼此。障礙物可以是會(huì)存在于微通道1中的碎片，例如當(dāng)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中(與受控的工廠環(huán)境相反)、就在進(jìn)行檢測之前進(jìn)行所述方法時(shí)。障礙物也可以是建在微流通道1中的構(gòu)建體(如柱狀物)， 其用于促進(jìn)微通道1的構(gòu)建，或?yàn)榱舜_保其剛性(例如在微通道是利用軟的聚合物(例如 PDMS)構(gòu)建的情況中)。輕拍包含微流通道1的設(shè)備在導(dǎo)入微載體2的過程中也是有幫助的。當(dāng)使用較重的微顆粒(例如硅微顆粒)時(shí)，以低頻率(典型地低于5赫茲)進(jìn)行時(shí)輕拍更有效。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，超過兩個(gè)微載體2可在微通道1中被并排排布以便進(jìn)一步降低對障礙物(例如，灰塵)或拱形形成的敏感性，通常為3(三)至50 (五十)個(gè)微載體，更優(yōu)選地為3(三)至12(十二)個(gè)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微載體2具有的形狀使得當(dāng)它們在微通道1中時(shí)所述微載體之間的接觸面最小，以減少摩擦。典型地，與有棱的表面(例如，立方體或多邊形)相比， 具有彎曲表面的形狀(例如球形或盤樣形狀)是優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微載體2具有盤樣形狀，所述盤樣形狀提供了在圖像中可被容易地鑒別的額外益處。也可考慮呈現(xiàn)出可與其它微載體2接觸的彎曲表面的其它形狀，例如具有卵形、橢圓形、或接近圓形的正面的薄片形式的微載體2。單層排布在非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，所選的微載體2的形狀和微通道1的橫截面使得微載體2形成單層排布并圍繞其打開最小的部分使樣品9流過。如本申請中所用的，“單層排布”是指空間構(gòu)型，其中存在點(diǎn)，從那里可在直線中觀察到所有的微載體2而不隱藏或相互擋住任何對于其鑒別(即用于確定編碼)而言是關(guān)鍵的部分。在微通道1平放(即，具有基本水平延伸的縱向方向)的情況下，這轉(zhuǎn)化為當(dāng)微載體2在微通道1內(nèi)時(shí)，它們不能在彼此的上面或重疊。假如微通道1在至少一側(cè)是透明的，單層排布是非常優(yōu)選的，因?yàn)樗鼘⒋龠M(jìn)通過直接在反應(yīng)室1內(nèi)的簡單的光學(xué)工具進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)和微載體的鑒別。結(jié)合至少兩個(gè)微載體2可并排(如本發(fā)明所提供的)的事實(shí)，此構(gòu)型形成了準(zhǔn)二維的單層排布而仍然使圍繞微通道用于讓樣品9流過的部分最小(見例如圖4)。如圖4. 2 中所闡明的，這不必然涉及在單一的平面內(nèi)嚴(yán)格地排列微載體2。優(yōu)選地，允許多于兩個(gè)微載體2并排排列，典型地為3 (三)至50 (五十)個(gè)微載體2，更優(yōu)選的為3 (三)至12 (十二) 個(gè)。與現(xiàn)有技術(shù)中所見的微載體2彼此相繼的嚴(yán)格排布相比，此排布將消耗更多的樣品液體9，但是將更容易制備。優(yōu)選地，在反應(yīng)在微載體2中發(fā)生的區(qū)域中，微通道1的截面是恒定的，以便促進(jìn)流動(dòng)條件的均一性。微載體的定向和鑒別
當(dāng)利用經(jīng)編碼的微載體2與單層排布相結(jié)合而工作時(shí)，更有利的是選擇微載體2 的形狀、微通道1的形狀和材料以及解碼機(jī)制，使得當(dāng)在微通道1中直接觀察微載體2時(shí)， 不必主動(dòng)操作微載體2以將其適當(dāng)?shù)囟ㄎ缓?或定向，而可讀出編碼。這可以，例如通過利用不需要任何特定的定向或定位的編碼機(jī)制(例如整個(gè)微載體2的尺寸或顏色，所述微載體2可以是例如球形的(因此不需要任何特別的定向))來實(shí)現(xiàn)。備選地，微載體的形狀可使得它們的旋轉(zhuǎn)被動(dòng)地受限，即在微通道1內(nèi)時(shí)，除了來自幾何約束的那些力以外不需要任何外力而被限制，從而任何編碼都被適當(dāng)?shù)爻蔬f給觀察 /感應(yīng)設(shè)備。此概念的示例性實(shí)施方式是設(shè)計(jì)具有在其一面或兩面上存在編碼的薄片形式的微載體2，并將它們帶入具有矩形或接近矩形的橫截面的微通道1內(nèi)，所述微通道1優(yōu)選地至少在基底102或蓋子103上由透明材料(見圖8)制成。微通道1的高度優(yōu)選地小于兩個(gè)微載體的高度，具有的效果是微載體2不能到彼此的上面。如此，微載體形成單層排布， 并且只能是顛倒的，但是總是向被放置用于觀察微通道1的平面的任何感應(yīng)設(shè)備基本上呈現(xiàn)平坦表面中的一個(gè)(如圖5中的)。由于使用了如本發(fā)明所提供的、與微載體2的尺寸相比相對寬的微通道1，當(dāng)通過垂直的進(jìn)口 5將液體9吸入微通道1中時(shí)(如圖2和3中描繪的)，對于微載體2形狀的這種額外限制實(shí)際上沒有使它們的加載困難得多。在圖4至6 中可看到此種微通道1的示例性實(shí)施方式。如果微載體2的面上存在任何編碼，對于所有將正確的面呈現(xiàn)給設(shè)備的微載體 (統(tǒng)計(jì)上是它們的一半)而言，都是可容易地觀察到的。此外，如果編碼存在于兩邊或從兩邊都是可見的，那么所有的微載體2均可被解碼而無需任何將它們定向的其它主動(dòng)操作。此概念的優(yōu)選實(shí)施方式在于利用穿過微載體2的編碼，從而可以從兩邊讀出并解釋所述編碼。應(yīng)注意，如果編碼方案是有圖案的(與整個(gè)面的非定位特征(例如顏色，尺寸等)相反)，可能需要將其與指示定向的標(biāo)記(即，不對稱的標(biāo)記，例如L形標(biāo)記或三角形) 相結(jié)合。圖7顯示了通過利用薄片形式的微載體(圖中的盤樣微載體)上的穿越孔21而產(chǎn)生的此種編碼的示例性實(shí)施方式的圖。所述編碼方案還允許獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)并獨(dú)立于微載體在微通道內(nèi)的位置而鑒別所述微載體。由于微載體2在平面中的方向和位置是不受控制的，檢測和解碼所述薄片形狀的微載體2的優(yōu)選方法是利用陣列型的傳感器(例如，CCD或C-MOS光電傳感器陣列)(例如圖5中所示的)或者構(gòu)建圖像的快速掃描系統(tǒng)來捕獲反應(yīng)室1的一個(gè)或數(shù)個(gè)圖像，然后在所述圖像上進(jìn)行分析操作，從而檢測微載體2的位置并解釋它們的編碼。此分析操作典型地包括形狀識(shí)別算法(例如Hough算法)以檢測微載體2的位置和微載體2的“垂直旋轉(zhuǎn)”，以便獨(dú)立于其方向而解釋它們的編碼。在圖像上進(jìn)行的分析操作典型地也能夠降低或消除反應(yīng)室1中存在碎片或氣泡的影響。帶有顯微鏡的CCD (或C-M0S)相機(jī)攝取的“照片” 可被用于檢測和解碼此種微載體2，并且相同的相機(jī)也可被用于讀出熒光信號用于生物學(xué)讀數(shù)(如圖8中所示)。向微通道中導(dǎo)入微載體本發(fā)明的微通道1具有允許向微通道1內(nèi)導(dǎo)入微載體2的入口 14。用于向微通道 1中導(dǎo)入微顆粒2的經(jīng)典方法是使它們懸浮在緩沖溶液中，所述溶液經(jīng)過與入口 14相連的進(jìn)口 5而流入微通道1中。
所述微通道1優(yōu)選地緊接著其入口 14具有與一個(gè)或多個(gè)垂直的孔7相連的擴(kuò)大的部分6，所述垂直的孔7作為將微顆粒2導(dǎo)入微通道1中的進(jìn)口 5 (見圖2，幻。所述擴(kuò)大的部分6形成了允許將微載體2和液體9從進(jìn)口 5引導(dǎo)到微通道1中的漏斗。如上面所解釋的，本發(fā)明的微通道1具有相對于微載體2的形狀的橫截面，所述橫截面允許在微通道1的整個(gè)長度上(特別是在入口 14處)使至少兩個(gè)微載體2并排排列， 從而減少通過形成拱形堵塞入口 14的機(jī)會(huì)。將懸浮液中的微顆粒2導(dǎo)入微通道1中時(shí)遇到的常見問題是，當(dāng)液體9停止時(shí)(例如，當(dāng)從一種溶液轉(zhuǎn)換成另一種溶液時(shí))，余下的微顆粒2傾向于沉淀在孔7的底部，可能在它們在層流漩渦8中可被捕捉的區(qū)域內(nèi)(見圖3)。這使得難以以受控的方式移動(dòng)它們，并且增加了不同組的微載體2被混合的風(fēng)險(xiǎn)如果微載體2被單獨(dú)編碼，這是無關(guān)緊要的；但如果需要以受控的方式將各個(gè)組的微載體2導(dǎo)入微通道1中(如現(xiàn)有技術(shù)所要求的)，這將是有問題的。典型地，給予微顆粒2時(shí)間使其完全安定下來并位于進(jìn)口 5的底部。然后，在對緩沖溶液的吸取和通過傾斜所述設(shè)備而作用于微顆粒2上的重力的聯(lián)合作用下，將所述微顆粒2移入微通道1中。此方法對于重的微顆粒2 (例如硅微顆粒)是特別有效的。攪拌和搖動(dòng)可進(jìn)一步幫助所述方法。為了克服微顆粒2沉淀在它們不能被移動(dòng)的地方的問題，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，除了孔7以外，存在作為入口 5’的第二個(gè)孔7’用于沖洗流9’。從而，在導(dǎo)入微顆粒2 時(shí)，可實(shí)現(xiàn)令連續(xù)的(或微脈沖的)沖洗流9’流過微通道1以防止微顆粒2的沉淀(見圖 2)。當(dāng)微顆粒2是重的時(shí)(例如由硅制成)，這一般是不需要的，因?yàn)橥ㄟ^傾斜設(shè)備而作用于微顆粒2上的重力足以使它們在所需的方向上移動(dòng)。還建議在導(dǎo)入微顆粒后向微顆粒進(jìn)口 5中沖入干凈的液體9 (即不含懸浮的微顆粒)，以確保孔7中或微通道1的擴(kuò)大的末端6中沒有留下顆粒。這也可與光學(xué)觀察微通道 1的擴(kuò)大的末端6相結(jié)合，以進(jìn)一步增加所述過程的可靠性。在第二方面，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行基于微載體的多重檢測的方法，所述方法包括步驟a)提供包含作為反應(yīng)室的微通道1的檢測設(shè)備并提供至少兩組經(jīng)編碼的微載體 2，其中所述微載體2的編碼指示功能并且其中，相對于所述微通道1的橫截面，所述微載體 2的形狀和尺寸允許在所述微通道1的整個(gè)長度上使所述微載體2的至少任何兩個(gè)并排排列；b)用所述至少兩組經(jīng)編碼的微載體2至少部分地填充所述微通道1 ；c)限制所述微載體2在所述微通道1縱向上的運(yùn)動(dòng)而仍然讓液體9流過；d)使?jié)撛诘匕粋€(gè)或多個(gè)靶分子3的樣品流過包含所述微載體2的所述微通道 1 ；e)鑒別微載體2的組；和f)檢測配體和靶分子之間的反應(yīng)，即進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)，并將反應(yīng)的有無與特定組的特征相關(guān)聯(lián)以推斷樣品中靶分子3的存在與否。這典型地與微載體2的鑒別相關(guān)。優(yōu)選地，微通道1，微載體2和限制工具4如上文所述。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本申請中作為本發(fā)明的第二方面而公開的進(jìn)行多重化檢測的方法的步驟(a)至(C)實(shí)際上形成了本發(fā)明第一方面的多重檢測設(shè)備。因此，對于本發(fā)明的這兩個(gè)方面中每一個(gè)的描述可在另一個(gè)方面的情境中被理解。為了多重化的目的，優(yōu)選地，以不同組的微載體2加載微通道1，各組具有不同的功能。在樣品流過之前，所有的組存在于反應(yīng)室中并且它們同時(shí)進(jìn)行檢測。由于使用了多于一組的功能化微載體2并且微載體的位置不需要被控制，各種組的微載體2彼此間需要是可區(qū)分的，即當(dāng)微載體2在反應(yīng)室1中時(shí)，必須有獨(dú)立于它們在微通道1中的位置而確定其功能的方式。這是通過利用經(jīng)編碼的微載體2進(jìn)行的，其中所述編碼指示功能。上文中概述了編碼的實(shí)例。對于多重化技術(shù)而言，也希望甚至在沒有由分析物產(chǎn)生的信號時(shí)，微載體也能被區(qū)分和/或鑒別，即獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)(即，該技術(shù)必須不依賴分析物的存在來揭示微載體屬于哪組)；因?yàn)樵谟行?shí)施方式中，當(dāng)沒有相應(yīng)的靶時(shí)，所述組可能不被顯露，從而使得質(zhì)量控制是困難的并且也顯著限制了可以使用的不同組的數(shù)目(即多重化的水平)， 因?yàn)檫@樣就需要依賴其中反應(yīng)對于各個(gè)組必須是可分辨的方法(在熒光讀數(shù)的情形中，這典型地是通過利用不同的熒光團(tuán)進(jìn)行的，但是多重化的水平就受到了它們的光譜特征的限制，并且在實(shí)踐中，這轉(zhuǎn)化為典型的最多5或6個(gè)可同時(shí)使用的不同微載體組)。這可通過利用物理編碼技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。例如，可用在觀察時(shí)有顯著區(qū)別的特質(zhì)(例如指示功能的編碼或特質(zhì))對所述微載體進(jìn)行單獨(dú)編碼或另外地生產(chǎn)。在第一方面的描述中上文所概述的編碼實(shí)例的優(yōu)選實(shí)施方式中，本方法的微載體 2具有盤樣形狀，并甚至更優(yōu)選地，它們具有包含穿越孔21、優(yōu)選地還包括定向標(biāo)記20的編碼。因此，微通道1優(yōu)選地具有帶有矩形橫截面的平坦形狀，而微載體2在微通道1中被排布為單層(如圖6中的)。步驟(b)可如下實(shí)現(xiàn)通過使包含懸浮的微載體2的液體9流過與微流通道1的入口 14相連的進(jìn)口 5，優(yōu)選地流過擴(kuò)大的部分6。如上文所解釋的，通過下列事實(shí)促進(jìn)了這一步驟的實(shí)際實(shí)施微通道1的橫截面使得至少兩個(gè)微載體可在整個(gè)長度的微通道1中并排排列。步驟(b)也可伴以輕拍包含微通道的設(shè)備。這將促進(jìn)下列事實(shí)當(dāng)出現(xiàn)微載體被障礙物阻塞的情況時(shí)，微載體可經(jīng)過彼此，如所述裝置的幾何學(xué)所允許的。對于步驟(b)，優(yōu)選允許多于嚴(yán)格地兩個(gè)微載體并排排布而不接觸微通道的壁。典型地，允許3(三)至50 (五十)個(gè)微載體并排將促進(jìn)所述裝置的制備，因?yàn)檫@允許了降低堵塞微通道入口的風(fēng)險(xiǎn)并且還處理了可能在微通道中的障礙物或碎片。通過使用上文關(guān)于限制性工具的描述中所概述的限制性工具來實(shí)施步驟(C)。微載體2的運(yùn)動(dòng)在縱向方向受限，或者被固定在微通道1內(nèi)，而仍然讓液流通過。在步驟(d)中，可能包含目的分子的樣品流過微通道1，并因而進(jìn)入且與微載體2 近距離接觸。這可通過使用數(shù)種技術(shù)來進(jìn)行，所述技術(shù)包括壓力，電勢(電滲流)，毛細(xì)作用，重力或離心力。在優(yōu)選地實(shí)施方式中，微通道1在一個(gè)末端與一個(gè)或多個(gè)進(jìn)口 5相連 (如上文所解釋的)且在另一個(gè)末端與一個(gè)或多個(gè)出口相連，這允許通過在所述一個(gè)或多個(gè)進(jìn)口和所述一個(gè)或多個(gè)出口之間施以壓力差而移動(dòng)液體，從而產(chǎn)生壓力驅(qū)動(dòng)流(PDF)?？赏ㄟ^使用泵或氣動(dòng)機(jī)制向所述一個(gè)或多個(gè)進(jìn)口和/或出口施以正壓和/或負(fù)壓(抽吸)。 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過向與微通道相連的進(jìn)口施用正壓，和/或向與微通道相連的出口施用負(fù)壓(抽吸)而移動(dòng)液體9。液體9可以連續(xù)的方式或以停止-流動(dòng)的方式(例如，微通道中一系列移動(dòng)的液體9和靜態(tài)的液體9)流動(dòng)。
可基于靶分子3的擴(kuò)散速度和用靶分子3的受體10包被的微載體2的濃度優(yōu)化樣品9應(yīng)當(dāng)流動(dòng)的速度和因此目的分子在微載體2附近經(jīng)過的時(shí)間。因?yàn)槲⑤d體2在反應(yīng)室中的縱向運(yùn)動(dòng)受限，如果需要，進(jìn)行其它的檢測步驟是容易的。這可通過順次或同時(shí)流過不同的液體9來簡單地進(jìn)行(例如進(jìn)行清洗或加入新的試劑)而無需對微載體2進(jìn)行任何特別的操作。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品9在微通道1中來回地流過。優(yōu)選地，優(yōu)化此運(yùn)動(dòng)，使其在相應(yīng)于具有相同靶分子3的配體10的兩個(gè)微載體2之間的平均距離的距離中發(fā)生。其中樣品9來回移動(dòng)的實(shí)施方式可如下實(shí)現(xiàn)通過使用基于作用于微顆粒2上的力(例如磁力)的終止工具4或通過使用靠近微通道1的入口 14的“可活化”終止工具4 (例如壓縮微通道1的一部分)以允許在活化終止工具4之前導(dǎo)入微載體2。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過提供從出口到進(jìn)口的液體連接和驅(qū)動(dòng)液體的工具(例如蠕動(dòng)泵)而使樣品9在整個(gè)微通道1中再循環(huán)。樣品9的再循環(huán)或來回移動(dòng)在下列情形中是有用的難以控制樣品9的速度和/ 或在非常稀釋的樣品9的情況中。鑒別步驟(e)可以在樣品流過(步驟d)之前、之中或之后進(jìn)行。它也可以與反應(yīng)的檢測(步驟f)同時(shí)、或在其之后進(jìn)行，特別是當(dāng)微載體2可獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)而被鑒別時(shí)，例如通過結(jié)合用于兩個(gè)目的方法，例如通過對鑒別組和檢測反應(yīng)均使用相似的光學(xué)方法(例如圖像捕獲)和分析。如在上面幾段中已經(jīng)描述過的，通過使用經(jīng)編碼的微載體2 來實(shí)現(xiàn)鑒別。雖然它們在微通道1中的位置是不受控的，但當(dāng)本發(fā)明的不同微載體2組在微通道1中時(shí)，可基于內(nèi)在特征來鑒別和/或區(qū)分它們，所述內(nèi)在特征無需通過靶分子的存在來顯露，即獨(dú)立于檢測的表現(xiàn)且獨(dú)立于它們在微通道1中的位置，例如通過孔形式的編碼或通過微載體的形狀?？稍跇悠妨鲃?dòng)的過程(步驟d)中進(jìn)行檢測步驟(f)從而得到檢測進(jìn)行時(shí)關(guān)于反應(yīng)進(jìn)展的動(dòng)力學(xué)信息，或者可在步驟(d)之后進(jìn)行檢測步驟(f)用于終端讀數(shù)。也可能在樣品流過(步驟d)之前進(jìn)行對各組的鑒別。檢測步驟可例如涉及觀察微載體(例如，光學(xué)檢測)或感應(yīng)微載體(例如，磁檢測)，其逐一進(jìn)行或?qū)?shù)個(gè)同時(shí)進(jìn)行(例如通過廣角觀察技術(shù))。本申請中公開的方法的微載體2優(yōu)選是上文所述的微載體2。除了進(jìn)行檢測，還進(jìn)行了生物學(xué)讀數(shù)以確定哪些微載體2進(jìn)行了反應(yīng)并任選地， 確定反應(yīng)到何種程度(見步驟f)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微通道1的設(shè)計(jì)通過讓可觀察的信號在含有微載體2的部分上穿過至少一側(cè)而允許直接在微通道1內(nèi)觀察微載體2。在非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，微通道1在至少一側(cè)和在一部分是透明的以允許光學(xué)觀察。備選地或此外，微通道1對于磁場或電磁輻射也可以是可透過的，并允許對微載體的磁感應(yīng)或電磁感應(yīng)以鑒別各組和/或進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)(例如，利用磁標(biāo)簽)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微載體2具有單層排布并且微通道1至少在一側(cè)是透明的， 允許單獨(dú)地簡單直接觀察所有的微載體2。如果微載體不是單層排布，可以使用更復(fù)雜的共聚集光學(xué)技術(shù)，條件是微載體是(半)透明的。當(dāng)結(jié)合發(fā)生時(shí)(例如通過發(fā)光計(jì)量的應(yīng)答或磁應(yīng)答，或其它類型的電磁發(fā)散)，典型地通過產(chǎn)生可觀察的信號(優(yōu)選光學(xué)可觀察信號)來進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)，這典型地是利用互補(bǔ)的標(biāo)記分子進(jìn)行的。反應(yīng)可由色度應(yīng)答、化學(xué)發(fā)光度量應(yīng)答、量子點(diǎn)發(fā)射應(yīng)答和/或熒光度量應(yīng)答來指示。生物學(xué)讀數(shù)還可通過測量反應(yīng)產(chǎn)生的信號的強(qiáng)度給出定量信息(即關(guān)于樣品中存在的分析物的量的信息)。由于反應(yīng)室中使用了數(shù)組微載體，有必要使信號產(chǎn)生機(jī)制在微載體中共定位且不在大量溶液中被釋放。典型地，反應(yīng)通過使用附著至配體和靶分子(如果靶分子存在于樣品中)形成的復(fù)合物的互補(bǔ)分子而顯露。備選地，我們可以有包含附著于微載體表面的熒光團(tuán)和粹光劑的復(fù)合物，以及被設(shè)計(jì)為減切所述粹光劑而留下熒光團(tuán)被束縛于所述表面的反應(yīng)，從而在微載體的表面上產(chǎn)生信號。生物學(xué)讀數(shù)還可涉及本領(lǐng)域已知的無標(biāo)記檢測技術(shù)，例如表面等離子體共振(SPR)或電子方法(例如，傳導(dǎo)率變化)。如圖5所示，優(yōu)選的方法包括制備其中微載體2是單層排布的裝置；以及放置傳感器(優(yōu)選地為光學(xué)傳感器)以直接在反應(yīng)發(fā)生的區(qū)域中(即在反應(yīng)室1內(nèi))觀察微載體 2，優(yōu)選地不移動(dòng)微載體2。所述傳感器可以是一次觀察/感應(yīng)多個(gè)微載體2的廣角傳感器 (例如，與必需的光學(xué)工具(如透鏡和物鏡)相結(jié)合以形成類似顯微鏡的裝置的CCD或CMOS 光電傳感器陣列)，或一次觀察/感應(yīng)一個(gè)微載體的窄視場傳感器(例如，光電二極管，光電倍增管，共聚焦掃描儀，或磁性傳感器)。對于光學(xué)傳感器，微通道1需要至少在從中可觀察到微載體的一側(cè)是透明的。優(yōu)選地，廣角傳感器用于“捕獲”反應(yīng)室1中微載體2的圖像或一系列圖像并通過圖像加工顯露反應(yīng)?？蓪⒋思夹g(shù)與編碼的檢測相結(jié)合以鑒別微載體組， 條件是編碼機(jī)制是基于可用相似的光學(xué)(例如，通過使用基于穿越孔的編碼機(jī)制)來檢測的光學(xué)對比。也可使用窄視場傳感器，但需要被移動(dòng)以經(jīng)過所有的微載體2并產(chǎn)生可被分析以顯露反應(yīng)的信號。由于微載體2的位置在微通道1中是相對自由的，可以下列方式使用窄視場傳感器其中其通過掃描反應(yīng)室1而構(gòu)建圖像。備選地，可使用數(shù)個(gè)窄視場傳感器來同時(shí)觀察微通道1的數(shù)個(gè)區(qū)域。還可能將使用廣角傳感器來鑒別微載體2與使用窄視場傳感器來檢測反應(yīng)結(jié)合在一起。在直接在反應(yīng)室1中觀察微載體2的實(shí)施方式中，不需要移動(dòng)終止工具4，并且不需要為了檢測目的釋放微載體2 ；但是，微通道1優(yōu)選地在至少一側(cè)和/或在至少一個(gè)部分是透明的，允許光學(xué)觀察微載體2。此實(shí)施方式也允許對反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)讀數(shù)。的確，可能在檢測進(jìn)行時(shí)觀察生物學(xué)指示并因而得到關(guān)于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的及時(shí)信息(見圖9)。除光學(xué)傳感器外，也可使用其它類型的傳感器(例如磁性傳感器或光譜測定傳感器)，如果檢測被設(shè)計(jì)為當(dāng)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，改變微載體2的磁性特征或發(fā)射光譜的話。這可以例如，通過以與使用熒光標(biāo)簽相同的方式使用附著于互補(bǔ)抗體的“磁性標(biāo)簽”來實(shí)現(xiàn)。另一個(gè)備選方案包括在檢測結(jié)束時(shí)釋放或移動(dòng)微載體2經(jīng)過微通道1的另一個(gè)部分(觀察部分或窗)，且當(dāng)它們經(jīng)過時(shí)讀取生物學(xué)信號(與熒光活化細(xì)胞分選[FACS]中所進(jìn)行的相似)；或者備選地，通過出口孔取出微載體2并將它們置于另一個(gè)用于觀察的設(shè)備中，例如在置于熒光顯微鏡中的顯微鏡載片中。此方法只允許結(jié)束時(shí)的生物學(xué)讀數(shù)但不允許動(dòng)力學(xué)讀數(shù)。此處再一次地，可使用廣角傳感器(例如CCD或C-MOS光電傳感器陣列) 或窄視場傳感器(例如光電倍增管)。這也可與檢測編碼相結(jié)合以鑒別微載體2的組。為了所述的目的，如上文所解釋的，必須例如通過去除終止工具4或通過去除磁場，而去除對縱向運(yùn)動(dòng)的限制。在步驟(f)中，對生物學(xué)讀數(shù)的觀察是與如步驟(e)中所觀察到的微載體2的特征相關(guān)聯(lián)的。兩個(gè)觀察的這種關(guān)聯(lián)(即，對特征的觀察和對生物學(xué)信號的觀察)可以例如，通過將兩個(gè)觀察合并成一個(gè)(即，使用相同的信號或相同的光學(xué)成像)，或通過利用微載體的位置來使兩個(gè)觀察相關(guān)聯(lián)(即，通過使用相應(yīng)于微載體2所存在的相同空間位置的兩個(gè)信號或光學(xué)圖像)而進(jìn)行。微載體2的靜態(tài)排布促進(jìn)了此種關(guān)聯(lián)，因?yàn)閮蓚€(gè)觀察可以在時(shí)間上被分開，例如，當(dāng)鑒別步驟(e)在樣品流過(步驟d)之前進(jìn)行時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 鑒別步驟(e)與生物學(xué)讀數(shù)步驟(f)基本上同時(shí)進(jìn)行，以確保微載體2的任何偶然的移動(dòng)不阻止將微載體2的特征與它們的生物學(xué)信號相關(guān)聯(lián)。這可以例如，通過在樣品流過(步驟d)之后或在流動(dòng)過程中，同時(shí)地或在很短的時(shí)間段內(nèi)用CCD或C-MOS相機(jī)攝取兩幅圖像來實(shí)現(xiàn)。第一幅圖像，典型地是明視場圖像，是用于鑒別微載體2的；而第二幅圖像，典型地是熒光圖像，是用于進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)的。備選地，所述鑒別和生物學(xué)讀數(shù)可基于唯一的觀察 (例如，相同的圖像)。后者可用于其中微載體2在觀察區(qū)域中被釋放并且當(dāng)它們通過時(shí)被觀察的實(shí)施方式中。S^l在另一方面，本發(fā)明提供了用于多重化的芯片13。所述芯片13包含本發(fā)明的第一方面所述的檢測設(shè)備。圖11中顯示了示例性的芯片13。所述芯片13可例如用于診斷目的。在非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，可觀察微載體2而無需從微通道1中釋放微載體2。實(shí)施例1利用PDMS成模技術(shù)制造含有與進(jìn)口孔及與出口孔相連的微通道，且包含過濾結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定化中央柱狀物(見圖17)的裝置，并使其與玻璃顯微鏡載片結(jié)合(如 Fundamentals and Applications of Microfluidics by Nam-Trung Nguyen 禾口 Steve Wereley，ISBN :9781580533430,第 3 章中所述)。生產(chǎn)了周圍帶有穿越孔圖案(作為編碼)的盤狀硅微載體。這是在清潔室環(huán)境中、使用基于薄片的微細(xì)加工技術(shù)進(jìn)行的，所述微細(xì)加工技術(shù)允許生產(chǎn)數(shù)百萬直徑為50微米且厚度為10微米的微載體。所述方法按照下列步驟進(jìn)行1)提供SOI(絕緣體上的硅)薄片(直徑4英寸，380μπι厚的基底薄片，Ιμπι厚的 BOX，IOym的設(shè)備層)；2)通過使用傳統(tǒng)的照相平板印刷技術(shù)(旋涂光敏保護(hù)性抗蝕劑，UV光照穿過掩蔽物，顯影，貫穿蝕刻設(shè)備層的硅，最后剝?nèi)タ刮g劑)刻畫微載體的形狀及其編碼(見圖18)；3)通過蝕刻掉所述薄片的BOX層，制備微載體的提離(lift-off)；4)通過微載體頂部的PECVD (等離子體化學(xué)氣相淀積)沉積厚度約IlOnm的氧化層。此層對于確保硅顆粒上的適當(dāng)熒光信號是必需的(Bras，Μ.，等人，Optimisation of a silicon/silicon dioxide substrate for a fluorescence DNA microarray。 Biosensors&bioelectronics, 2004. 20(4) :p. 797-806 ；Voile, J. N.,等人，Enhanced sensitivity detection of protein immobilization by fluorescent interference on oxidized silicon。Biosensors and Bioelectronics,2003. 19(5) :p. 457-464)；5)通過在超聲處理下，將所述薄片浸入液體溶液(例如丙酮)中，而從基底中釋放微載體。重復(fù)這一過程以產(chǎn)生兩組具有數(shù)個(gè)不同編碼的微載體。然后，通過與Iml丙酮中的10% v/v(3-氨丙基)三乙氧基硅烷反應(yīng)(室溫，伴有攪拌，反應(yīng)1小時(shí))，在表面上以伯胺將約300,000的各個(gè)編碼的微載體功能化。將這些微載體沉淀并重懸于Iml IOmM的硼酸鹽緩沖液(150mM NaCl pH8. 2，含有0. 1 %的Tween-20) (BBST)中。通過在BBST中加入800 μ L的10% ν/ν戊二醛而活化微載體表面上的氨基基團(tuán)。在此溶液中，在室溫下攪拌所述微載體1小時(shí)。在活化步驟之后，用Iml的BBST清洗所述微載體3次。之后，通過加入BBST中的500ηΜ經(jīng)氨基修飾的(5，-或3，-)寡聚核苷酸(Pl或 Ρ2)的溶液而用生物學(xué)探針 Pl (5，-CAA CCC CAG CTA ATATTA ΤΤ-3，)禾口 P2(5，-TGG GTA AGT TAG GGC GAT GG_3’ )分別包被兩組微載體。然后，在此溶液中、在室溫下攪拌所述微載體1小時(shí)。在用BBST如上所述進(jìn)行洗滌步驟后，通過與BBST中的35mM甘氨酸在室溫下反應(yīng)15分鐘而封閉未反應(yīng)的官能團(tuán)。用BBST清洗所述微載體2次，然后儲(chǔ)存于同樣的緩沖液中。通過將如上制備的、來自各組的10 μ L的微載體懸浮液完全混合而制備兩組微載體的總混合懸浮液。然后，通過將所述總混合懸浮液移液加入進(jìn)口并通過在出口中施加負(fù)壓以將微載體的總混合懸浮液吸入微通道中，而將所述兩組功能化微載體的混合物加載到微通道中。PDMS微通道之前已用乙醇預(yù)處理過以改進(jìn)親水性行為。通過提供用Cy5熒光團(tuán)在5’末端標(biāo)記過的200nM寡聚核苷酸Tl的溶液，在 5xSSPE中(含有125mM的磷酸鹽緩沖液，745mM NaCl，5mMjEDTA，ρΗ7· 4)制備與Pl互補(bǔ)的革巴 Tl (5，Cy5-AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG—3，)的樣品溶液。在從進(jìn)口孔去除任何過量的溶液后，將此樣品加入進(jìn)口孔，并在室溫下沖過所述通道5分鐘。在沖入靶序列Tl后，從進(jìn)口孔去除過量的溶液，并通過在室溫下沖入 hSSC(15mM檸檬酸鈉，150mM NaCl, pH7)而清洗所述微通道1分鐘。在帶有Cy5濾境組的熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 135)上通過玻璃層觀察所述兩組微載體上的熒光信號。圖 8顯示了如冷卻的C⑶相機(jī)(Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG相機(jī))所捕獲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然顯示并描述了目前優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方式和實(shí)施例，需明確理解的是，本發(fā)明不受限于此而可在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)另外多樣地被體現(xiàn)和實(shí)施。
2權(quán)利要求
1.包含反應(yīng)室和至少兩組單獨(dú)編碼的微載體O)的檢測設(shè)備其中所述反應(yīng)室是微通道(1)；并且其中所述微載體( 具有的形狀相對于微通道(1)的橫截面允許在微通道(1)的整個(gè)長度上使所述微載體( 中的至少任意兩個(gè)并排排布而不相互接觸且不接觸微通道(1)的周邊；并且其中所述設(shè)備(1)包含工具以限制微載體( 在微通道(1)的縱向上的運(yùn)動(dòng)，而仍然讓液體流過；和其中所述微載體的編碼指示功能。
2.權(quán)利要求1檢測設(shè)備，其中所述微通道(1)在至少一側(cè)和/或至少一部分上是透明的，允許對所述微載體O)的光學(xué)觀察。
3.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微通道(1)與至少一個(gè)擴(kuò)大的末端(6)相連并且包含進(jìn)口(5)。
4.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微通道(1)的橫截面是矩形的或接近矩形的。
5.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有的形狀相對于微通道(1) 的橫截面允許在微通道(1)的整個(gè)長度上使所述微載體( 中的至少任意三個(gè)并排排列而不相互接觸且不接觸微通道(1)的周邊。
6.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體(2)被限制為微通道⑴內(nèi)的單層構(gòu)型。
7.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有球形形狀。
8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有薄片的形式。
9.權(quán)利要求8的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有盤樣形狀。
10.權(quán)利要求8至9中任一項(xiàng)的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有指示顛倒方向的標(biāo)記。
11.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有穿越孔的構(gòu)型形式的編碼。
12.權(quán)利要求9的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 具有穿越孔的構(gòu)型形式的編碼， 所述編碼位于外環(huán)，占據(jù)小于一半的盤直徑。
13.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微通道⑴由下列構(gòu)成或包含下列娃， PDMS, PMMA，聚四氟乙烯，TPE, SU-8，Victrex PEEK ，聚碳酸酯，PVC, PP, PE, PS, FEP，COP， C0C，鎳，銀，金，石英或玻璃。
14.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體O)由下列構(gòu)成或包含下列乳膠，聚苯乙烯，交聯(lián)右旋糖酐，甲基苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，纖維素，聚丙烯酰胺，二甲基丙烯酰胺，玻璃，SiO2，硅，PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)，金，銀，鋁，鋼或其它金屬或SU-8。
15.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微通道(1)具有蛇形輪廓。
16.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述限制微載體( 的運(yùn)動(dòng)的工具(4)是堰構(gòu)建體，一個(gè)或多個(gè)柱狀物，微通道橫截面的減少，柵格，濾網(wǎng)，利用介電泳力保留的一個(gè)或多個(gè)微顆粒，或保留在磁場中的一個(gè)或多個(gè)磁性微顆粒。
17.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微載體( 通過磁場，或利用介電泳力被固定。
18.前述任一權(quán)利要求的檢測設(shè)備，其中所述微通道(1)內(nèi)微載體( 的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)在至少一個(gè)方向上受限。
19.權(quán)利要求18的檢測設(shè)備，其中所述微載體O)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)被微載體( 相對于微通道(1)的橫截面的形狀所限。
20.進(jìn)行基于微載體的多重檢測的方法，包括步驟a)提供包含作為反應(yīng)室的微通道(1)的檢測設(shè)備，并提供至少兩組單獨(dú)編碼的微載體 O)，其中所述微載體O)的編碼指示功能，并且其中所述微載體(2)相對于微通道(1)的橫截面的形狀和尺寸允許在微通道(1)的整個(gè)長度上使所述微載體( 中的至少任意兩個(gè)并排排列；b)用所述至少兩組經(jīng)編碼的微載體( 至少部分地填充所述微通道(1)；c)限制所述微載體( 在所述微通道(1)中的縱向運(yùn)動(dòng)，而仍然讓液體流過；d)使樣品(9)流過包含所述微載體O)的所述微通道(1)；e)鑒別微載體(2)的組；和f)進(jìn)行生物學(xué)讀數(shù)，與微載體O)的特征相關(guān)聯(lián)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在步驟(c)之后獲得的檢測設(shè)備是權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的檢測設(shè)備。
22.權(quán)利要求20至21的方法，其中步驟(e)是通過直接在反應(yīng)室(1)中觀察微載體 (2)而進(jìn)行的。
23.權(quán)利要求20至22的方法，其中步驟(f)與步驟(d)同時(shí)進(jìn)行，并隨時(shí)間提供結(jié)果。
24.權(quán)利要求20至22的方法，其中所述微通道(1)在至少一側(cè)及在至少一個(gè)部分是透明的，且步驟(f)是通過光學(xué)工具進(jìn)行的。
25.權(quán)利要求對的方法，其中所述生物學(xué)讀數(shù)是利用與光學(xué)工具結(jié)合的光學(xué)傳感器陣列進(jìn)行的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述傳感器是CCD或C-MOS光電傳感器。
27.權(quán)利要求20至沈的方法，其中所述微載體( 相對于微通道(1)的橫截面的形狀限制它們的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述微載體( 具有薄片的形式，并且所述微通道(1)的橫截面是矩形的。
29.權(quán)利要求20至觀的方法，其中所述微載體( 相對于微通道(1)的橫截面的形狀和尺寸允許在微通道(1)的整個(gè)長度上使所述微載體O)中的至少任意三個(gè)并排排列。
30.權(quán)利要求20至四的方法，其中步驟(e)在步驟(d)之前進(jìn)行。
31.權(quán)利要求20至30的方法，其中步驟(e)與步驟(f)同時(shí)進(jìn)行。
32.權(quán)利要求20至31中任一項(xiàng)的方法，其中通過分析利用傳感器陣列捕獲的圖像進(jìn)行對微載體O)的組的鑒別。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述傳感器是CCD或C-MOS光電傳感器。
34.用于多重檢測的芯片，其包含至少一個(gè)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的檢測設(shè)備。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括反應(yīng)室和數(shù)組經(jīng)編碼的微載體2的多重檢測設(shè)備，其中所述反應(yīng)室是微通道1，和其中所述微載體2的縱向運(yùn)動(dòng)是受限制的，其中微載體2具有的形狀與微通道1的幾何形狀相關(guān)從而至少兩個(gè)能夠并排位于微通道1中而相互不接觸也不接觸微通道1的周邊，并且優(yōu)選地在反應(yīng)室中是可觀察至的。此外，本發(fā)明提供了進(jìn)行基于微載體的多重檢測的方法，所述方法改善了物質(zhì)傳遞，簡化了檢測的準(zhǔn)備和實(shí)施，并促進(jìn)了生物學(xué)反應(yīng)的讀出和微載體2的鑒別。
文檔編號B01J19/00GK102264474SQ200980152018
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者D·納德爾, J·吉爾, N·德米埃爾, P·雷諾 申請人:比奧卡爾齊什股份有限公司