專利名稱：溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高分子材料制備技術(shù)及其在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說涉 及一種新型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。
背景技術(shù)：
分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technology)是指制備具有特異性識別 作用的客體目標(biāo)分子的技術(shù)，通常被描述為制造識別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術(shù)?；?原理為提供合適的反應(yīng)條件，使模板分子與功能單體相互作用形成超分子復(fù)合物，復(fù)合物 在交聯(lián)劑及引發(fā)劑的作用下形成聚合物，然后在一定條件下除去模板分子，得到帶有與模 板分子空間結(jié)構(gòu)互補的識別位點的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, ΜΙΡ) ο由于MIPs具有構(gòu)效預(yù)定性(structur印redetermination)、特異識別性(specific recognition)和廣泛實用性(extensive practicability)的優(yōu)點，它在色譜中對映體和 異構(gòu)體的分離、固相萃取、化學(xué)仿生傳感器、模擬酶催化、臨床藥物分析、膜分離技術(shù)等領(lǐng)域 展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。近年來，分子印跡技術(shù)逐步拓展到蛋白質(zhì)的分離、富集、純化、鑒定等與蛋白質(zhì)組 學(xué)(proteomics)相關(guān)的生命科學(xué)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)為復(fù)雜生物大分子排列，擁有能控制性和特 異性地與目標(biāo)分子作用并鍵合的位點，蛋白質(zhì)(或主體)和配體(或客體)之間的位點互補 產(chǎn)生作用力時發(fā)生鍵合。蛋白質(zhì)-客體間的相互作用，能夠用概念簡單的“鎖和鑰匙”假設(shè) 來描述，這種假設(shè)最貼切實用，也恰好是分子印跡的基本原理，即模板蛋白周圍預(yù)組裝識別 位點，這個過程是分子印跡的基本過程。在近年蛋白質(zhì)組學(xué)中，以分子印跡作為研究方法已 獲得越來越多的關(guān)注，也取得了 一些進展，分子印跡技術(shù)著力于純化、分離和富集蛋白。目 前已有的蛋白質(zhì)印跡聚合物的方法多限于包埋法Pang、表面印跡法Mosbach和抗原決定 基法Rachkov。而傳統(tǒng)的小分子印跡整體柱的制備技術(shù)并不適合于生物大分子，有關(guān)于蛋白 質(zhì)分子印跡整體柱的方法研究鮮有報道。由于蛋白質(zhì)固有的特性(體積龐大、構(gòu)想靈活、結(jié) 構(gòu)復(fù)雜以及水溶性)，蛋白質(zhì)印跡的困難集中在如何保持印跡蛋白質(zhì)構(gòu)象的完整性，提高蛋 白質(zhì)印跡聚合物的選擇性。智能高分子水凝膠是一類對外界刺激能產(chǎn)生敏感響應(yīng)的高分子水凝膠，具有良好 的生物兼容性和智能響應(yīng)性。根據(jù)對外界刺激的響應(yīng)情況，智能高分子水凝膠分為溫度敏 感型水凝膠、PH值敏感型水凝膠、光敏感型水凝膠、壓力敏感型水凝膠、生物分子敏感型水 凝膠以及電場敏感型水凝膠等。其中溫度敏感型水凝膠的溫度響應(yīng)機理是指當(dāng)大分子鏈上 同時具有親水性的基團和疏水性的基團時，線型高分子在水溶液中會隨著溶液溫度的變化 而發(fā)生分子鏈構(gòu)象的變化，由伸展的無規(guī)線團(coil)狀轉(zhuǎn)變?yōu)轵榍?globular)狀，這種 構(gòu)象的變化一般認(rèn)為是親水作用和疏水作用相互競爭的結(jié)果。溫敏型分子印跡聚合物可利 用溫敏高分子的溫度體積相變行為，即在不同溫度下分別發(fā)生收縮和溶脹，使得高分子側(cè) 鏈上帶有的可與模板分子形成多接觸點吸附的功能單體間的距離和相對位置改變，從而使 印跡空腔結(jié)合模板分子的親和力發(fā)生改變。溫敏型聚合物在蛋白質(zhì)印跡方面很有前景，是一種溫和高效的分子印跡材料的制備方法。迄今溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法 及應(yīng)用方面的研究在國內(nèi)外尚未見有關(guān)論文或?qū)＠麍蟮?，在理論上和方法上均屬于?chuàng)新性 研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高選擇性及生物兼容性好的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱 的制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，該方法包括如下步驟(a)將兩種硅烷化試劑加入到有機溶劑中，混合均勻；(b)在(a)中加入硝酸作為催化劑，混合均勻；(c)將(b)液體灌注到毛細(xì)管柱或高效液相色譜柱中，模具兩端密封，在 400C -50°C垂直放置12-36小時；(d)反應(yīng)結(jié)束后，將毛細(xì)管柱或高效液相色譜柱分別接入到注射泵或高效液相色 譜體系，用甲醇沖洗柱體，制得毛細(xì)管硅膠整體柱骨架或高效液相色譜硅膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯(lián)劑溶于三羥甲基氨基甲烷_鹽酸Tris-HCl緩沖溶液中；(f)在(e)通入氮氣除氧后加入模板分子；(g)隨后在(f)中加入引發(fā)劑和加速劑，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩沖溶液利用色譜泵淋洗(d)中已制備好的硅膠骨架， 然后整體柱骨架進行聚合反應(yīng)；(i)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用氯化鈉溶液洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然后用三羥甲 基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩沖溶液沖洗整體柱至色譜基線平衡，就得到溫敏型蛋白質(zhì)分 子印跡整體柱。步驟(a)中所述的硅烷化試劑是甲基三甲氧基硅烷，Y -甲基丙烯酰氧丙基三甲 氧基硅烷，四乙氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，或氨丙基三甲氧基硅烷；兩種硅烷化試劑之 和與有機溶劑的體積比2 1至4 1，兩種硅烷化試劑的體積比是1 1-9 1;所述的 有機溶劑為甲醇或乙醇。步驟(b)中所述的催化劑硝酸的濃度為0. 8mol/L-l. 2mol/L ；硅烷化試劑與催化 劑的物質(zhì)的量之比為4 1。步驟(e)所述的功能單體為N-異丙基丙烯酰胺NIPAAm、丙烯酰胺AAm或甲基丙烯 酸MAA ；所述的交聯(lián)劑為N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA ；緩沖溶液中功能單體的重量濃度為 8. 00-10. 57%，交聯(lián)劑的重量濃度0. 20-1. 60%。步驟⑴所述的模板分子為溶菌酶lysozyme ；模板分子于緩沖溶液中的重量濃度 為2. 30-5. 00%，并在0-5°C下緩慢振蕩4小時。步驟(g)所述的引發(fā)劑為過硫酸銨APS，加速劑為N，N，N'，N'-四甲基 乙二胺TEMED ；緩沖溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0. 10-0. 20%，加速劑的重量濃度為 0. 025-0. 25%o步驟(h)所述的整體柱骨架放于25_38°C環(huán)境中聚合5_12小時。步驟(i)所述的氯化鈉溶液的重量濃度為0.012-0. 029%;三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩沖溶液的pH為7. 00-8. 00_。一種上述方法制備的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。 上述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的應(yīng)用，用于選擇性分離模板蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點為(1)利用溫和的一步法制備硅膠整體柱骨架，避免了傳統(tǒng)溶膠-凝膠(sol-gel)法 制備硅膠基質(zhì)的整體柱材料時需經(jīng)過水解縮聚、陳化、干燥、老化和表面再修飾等一系列復(fù) 雜的制備步驟；(2)利用溫敏型水凝膠針對溶菌酶制備特異性識別的溫敏型蛋白質(zhì)印跡整 體柱，在整體柱骨架上留有與溶菌酶分子體積大小、結(jié)構(gòu)、極性相匹配的孔穴；(3)該整體 柱具有溫度敏感性，可以通過調(diào)節(jié)分離時的溫度選擇最佳色譜分離條件；(3)去除蛋清中 溶菌酶時，只有溶菌酶能夠進入孔穴，而其它的雜質(zhì)分子不能進入孔穴，使得材料主要吸附 溶菌酶，而對于其它蛋白吸附很少；(4)其用于蛋清中的溶菌酶的去除中可以提高去除的 選擇性，減少低豐度蛋白的損失；(5)與現(xiàn)有的去除溶菌酶方法比較，本發(fā)明材料生產(chǎn)成本 低、操作過程簡便、容易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。


圖1合成的硅膠骨架的掃描電鏡圖。圖2溫敏型溶菌酶印跡整體柱對溶菌酶的識別效果。以溶菌酶作為模板分子制備 的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱在最佳液相色譜模式下，對溶菌酶(1)和細(xì)胞色素C(2)混 合物中溶菌酶的選擇性分離。
具體實施方式實施例1一種蛋白質(zhì)印跡材料，可按如下步驟制備(a)將1. 2ml硅烷化試劑加入到甲醇中，混合均勻，硅烷化試劑與甲醇的體積比是 3 1，兩種硅烷化試劑甲基三甲氧基硅烷和Y-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的體積比 是7 1 ；(b)在(a)中加入濃度為1. 2mol/L的催化劑，混合均勻，其中，硅烷化試劑與催化 劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到高效液相色譜不銹鋼管柱中，模具兩端密封，在45°C溫度下 垂直放置20小時；(d)反應(yīng)結(jié)束后，將不銹鋼管柱接入到高效液相色譜體系，用甲醇沖洗柱體，制得 硅膠整體柱骨架；圖1為實施例1的不銹鋼管柱中制備的硅膠骨架橫截面的掃描電鏡圖。 得到的整體柱結(jié)構(gòu)均勻，通透性良好，(e)將功能單體與交聯(lián)劑溶于IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩沖溶液中，緩沖溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0013g)，AAm (25. Omg)和 MAA (25. OyL),交聯(lián)劑 MBAA 的加入量為(21. Omg)；(f)在(e)通入氮氣除氧后加入模板分子溶菌酶(500mg)，并在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨后在(f)中加入引發(fā)劑APS (20. Omg)和加速劑TEMED (170 μ L)，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩沖溶液利用色譜泵淋洗(d)中已制備好的硅膠骨架， 然后將整體柱骨架放于30°C環(huán)境中聚合10小時；非印跡整體柱的制備，除了不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液沖洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。圖2是實施例1的以溶菌酶作為模板分子制備的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱在 最佳液相色譜模式下，對溶菌酶和細(xì)胞色素C混合物中溶菌酶的選擇性分離。從圖中可以 看出該印跡整體柱對模板蛋白質(zhì)表現(xiàn)出較強的保留。這說明本發(fā)明方法制備的分子印跡整 體柱具有良好的蛋白質(zhì)印跡效果。實施例2一種蛋白質(zhì)印跡材料，可按如下步驟制備(a)將1. 2ml硅烷化試劑加入到乙醇中，混合均勻，硅烷化試劑與甲醇的體積比是
2 1，兩種硅烷化試劑甲基三乙氧基硅烷和Y-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的體積比 是9 1 ；(b)在(a)中加入濃度為1. Omol/L的催化劑，混合均勻，其中，硅烷化試劑與催化 劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到毛細(xì)管柱中，模具兩端密封，在47°C溫度下垂直放置30小 時；(d)反應(yīng)結(jié)束后，用甲醇沖洗柱體，制得硅膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯(lián)劑溶于IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩沖溶液中，緩沖溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0290g)，AAm (15. Omg)和 MAA (5. OyL),交聯(lián)劑MBAA的加入量為(15. 7mg)；(f)在(e)通入氮氣除氧后加入模板分子溶菌酶(370mg)，并在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨后在(f)中加入引發(fā)劑APS (15. Omg)和加速劑TEMED (75 μ L)，立即渦旋混 合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩沖溶液利用色譜泵淋洗(d)中已制備好的硅膠旨架， 然后將整體柱骨架放于27°C環(huán)境中聚合12小時；非印跡整體柱的制備，除了不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液沖洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。實施例3一種蛋白質(zhì)印跡材料，可按如下步驟制備(a)將1. 2ml硅烷化試劑加入到乙醇中，混合均勻，硅烷化試劑與甲醇的體積比是
3 1，兩種硅烷化試劑四乙氧基硅烷和氨丙基三甲氧基硅烷的體積比是5 1 ；(b)在(a)中加入濃度為0. 8mol/L的催化劑，混合均勻，其中，硅烷化試劑與催化劑的用量比為41；(c)將(b)液體灌注到毛細(xì)管柱中，模具兩端密封，在50°C溫度下垂直放置12小 時；(d)反應(yīng)結(jié)束后，用甲醇沖洗柱體，制得硅膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯(lián)劑溶于IOmMWpH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)緩沖溶液中，緩沖溶液中功能單體為NIPAAm (1. 0513g)，AAm (20. Omg)和 MAA (10. OyL),交聯(lián)劑 MBAA 的加入量為(18. 9mg)；(f)在(e)通入氮氣除氧后加入模板分子溶菌酶(400mg)，并在0_5°C下緩慢振蕩 4小時；(g)隨后在(f)中加入引發(fā)劑APS (10. Omg)和加速劑TEMED (200 μ L)，立即渦旋混 合均勻；(h)保持(g)在0_5°C，將緩沖溶液利用色譜泵淋洗(d)中已制備好的硅膠骨架， 然后將整體柱骨架放于32°C環(huán)境中聚合8小時；非印跡整體柱的制備，除了不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步驟同上。(i)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用0. 5M的氯化鈉洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7. 10的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液沖洗整體柱至色譜基線平衡，就得到 溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。
權(quán)利要求
一種溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征是，該方法包括如下步驟(a)將兩種硅烷化試劑加入到有機溶劑中，混合均勻；(b)在(a)中加入硝酸作為催化劑，混合均勻；(c)將(b)液體灌注到毛細(xì)管柱或高效液相色譜柱中，模具兩端密封，在40℃-50℃垂直放置12-36小時；(d)反應(yīng)結(jié)束后，將毛細(xì)管柱或高效液相色譜柱分別接入到注射泵或高效液相色譜體系，用甲醇沖洗柱體，制得毛細(xì)管硅膠整體柱骨架或高效液相色譜硅膠整體柱骨架；(e)將功能單體與交聯(lián)劑溶于三羥甲基氨基甲烷烷-鹽酸Tris-HCl緩沖溶液中；(f)在(e)通入氮氣除氧后加入模板分子；(g)隨后在(f)中加入引發(fā)劑和加速劑，立即渦旋混合均勻；(h)保持(g)在0-5℃，將緩沖溶液利用色譜泵淋洗(d)中已制備好的硅膠骨架，然后整體柱骨架進行聚合反應(yīng)；(i)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用氯化鈉溶液洗脫整體柱骨架上的模板蛋白，然后用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl緩沖溶液沖洗整體柱至色譜基線平衡，就得到溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，步 驟(a)中所述的硅烷化試劑是甲基三甲氧基硅烷，Y-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，四 乙氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，或氨丙基三甲氧基硅烷；兩種硅烷化試劑之和與有機溶劑 的體積比2 1至4 1，兩種硅烷化試劑的體積比是1 1-9 1;所述的有機溶劑為甲 醇或乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，步 驟(b)中所述的催化劑硝酸的濃度為0. 8mol/L-l. 2mol/L ；硅烷化試劑與催化劑的物質(zhì)的 量之比為4 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于， 步驟(e)所述的功能單體為N-異丙基丙烯酰胺OTPAAm、丙烯酰胺AAm或甲基丙烯酸 MAA ；所述的交聯(lián)劑為N，N-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA ；緩沖溶液中功能單體的重量濃度為 8. 00-10. 57%，交聯(lián)劑的重量濃度0. 20-1. 60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于， 步驟⑴所述的模板分子為溶菌酶Iysozyme ；模板分子于緩沖溶液中的重量濃度為 2. 30-5. 00%，并在0-5°C下緩慢振蕩4小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，步 驟(g)所述的引發(fā)劑為過硫酸銨APS，加速劑為N，N，N'，，N'-四甲基乙 二胺TEMEDjlW 溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0. 10-0. 20%，加速劑的重量濃度為0. 025-0. 25%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，步 驟(h)所述的整體柱骨架放于25-38°C環(huán)境中聚合5-12小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，步 驟(i)所述的氯化鈉溶液的重量濃度為0. 012-0. 029%;三羥甲基氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl 緩沖溶液的PH為7. 00-8. 00。
9.一種權(quán)利要求1-8中任一項方法制備的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。
10. 一種權(quán)利要求9所述的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的應(yīng)用，用于選擇性分離模 板蛋白質(zhì)。
全文摘要
溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于高分子材料制備技術(shù)及其在蛋白質(zhì)分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說涉及一種新型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。采用簡便溫和的方法合成無機硅膠整體柱骨架，繼而以蛋白質(zhì)為模板，通過溫敏型功能單體和交聯(lián)劑在無機硅膠骨架表面接枝蛋白質(zhì)印跡材料從而得到溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。獲得的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱具有較強的模板蛋白識別能力。本發(fā)明制備的溫敏型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱，將分子印跡的專一識別特性和整體柱的在線分離的特性相結(jié)合，操作簡單、條件溫和、成本低廉，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種高豐度蛋白質(zhì)去除的新方法。
文檔編號B01J20/30GK101816927SQ20101016031
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者何錫文, 張玉奎, 李文友, 秦磊 申請人:南開大學(xué)