專利名稱：甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固相萃取柱的制備方法，具體地講，涉及一種甲基睪酮分子印跡 固相萃取柱的制備方法。
背景技術(shù)：
甲基睪酮是一種人工合成的代謝類固醇，作為一種促生長劑，上個世紀(jì)一直廣泛 應(yīng)用于畜牧業(yè)與水產(chǎn)中。但是由于甲基睪酮代謝緩慢，蓄積性強(qiáng)，通過食物鏈進(jìn)入人體，會 產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，諸如肝中毒，胎體中毒、致癌等。歐盟早在1988年就開始禁止使用類 固醇激素諸如甲基睪酮來飼養(yǎng)家畜。而在我國，從1999年起也已經(jīng)法令禁止使用甲基睪酮 作為促生長劑。但是到目前為止，仍有少數(shù)企業(yè)在違規(guī)使用。要徹底避免這種情況的發(fā)生， 除了從源頭上控制獸藥的生產(chǎn)和使用之外，及時準(zhǔn)確地檢測畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留也是關(guān)鍵 環(huán)節(jié)，但如何有效富集樣品中的痕量獸藥殘留一直以來都是研究熱點。分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technology)的迅速發(fā)展始于上世紀(jì)90 年代，用于制備具有高親和性和選擇性的可以識別和結(jié)合目標(biāo)分子的特定受體，即分子印 跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)。由于孔穴對模板分子的記憶功能， MIPs對模板分子的親和力大大增強(qiáng)，表現(xiàn)出分子識別的能力。MIPs依靠形狀、大小和化學(xué) 功能基的分布對模板分子進(jìn)行識別，類似于生物體系中酶對底物、抗體對抗原、受體對激素 的作用，具有專一選擇性。而且分子印跡聚合物具有制備簡單、成本低廉、使用壽命長等優(yōu) 點，且比天然的生物分子具有更高的穩(wěn)定性、更良好的機(jī)械性能和高度的交聯(lián)性。更重要的 是，對于那些天然受體不存在或難以得到的目標(biāo)分子，用這種方法都可以量身定做。到目前 為止，有機(jī)小分子包括藥物分子、殺蟲劑、氨基酸、肽、核苷酸堿基、留族化合物及糖等的印 跡已經(jīng)取得成功；金屬和其他離子也可用作模板以使功能基具有特定的排布；而體積較大 的分子如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等的印跡也已經(jīng)有報道?？梢詰?yīng)用到分子印跡技術(shù)中的目標(biāo)分子非 常多，這也是其發(fā)展如此迅速的原因之一。分子印跡聚合物以其優(yōu)越的分子識別性能被廣 泛應(yīng)用于分離領(lǐng)域，包括高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電色譜(CEC)以及生物傳感器、模擬 抗體、模擬酶等方面，其識別過程具有預(yù)定性、特異性和實用性這三大特點。傳統(tǒng)的樣品前處理過程通常都使用常規(guī)的固相萃取柱如C18、C8、弗羅里硅土、硅 膠等來對樣品中殘留目標(biāo)物進(jìn)行富集，這類固相萃取柱的優(yōu)點是通用性好，適合各種不同 的樣品基質(zhì)，但是缺乏特異性，有可能導(dǎo)致回收率低。而按照機(jī)理，分子印跡聚合物作為固 相萃取劑的優(yōu)點為提取快速有效，優(yōu)良的選擇性和親和力，穩(wěn)定性高，成本低，能夠降低檢 測限，并使基質(zhì)影響降至最低。因此可以廣泛應(yīng)用于制藥、食品、環(huán)境等多種行業(yè)中。目前 關(guān)于甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法尚未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，該方法工藝 簡單，具有與甲基睪酮分子印跡聚合物本身匹配的特殊性，所制得的固相萃取柱對甲基睪酮具有很高的回收率，并且可以明顯降低基質(zhì)效應(yīng)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法以單位重量份、單位體積份為例， 將甲基睪酮分子印跡聚合物100-500mg與5-10ml純有機(jī)溶劑混合，振蕩10-20min后超 聲10-20min，直至混合均勻，移入聚丙烯等材質(zhì)的固相萃取空柱中，兩端分別用濾膜墊片堵 住，裝填均勻后用20-30ml酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用10-20ml純有機(jī)溶劑沖洗，以除 去酸性物質(zhì)，最后用惰性氣體吹掃除去殘余有機(jī)溶劑，所述惰性氣體可以是N2或Ar ；最后 干燥即得，優(yōu)選為真空干燥。所述甲基睪酮分子印跡聚合物優(yōu)選為粉末狀。所述純有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮等中的一種或幾種。所述酸性有機(jī)溶劑可以是甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一種或幾種與甲醇的混合溶 液；甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一種或幾種與甲醇的體積比約為1 5-1 20。甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的評價通過實際樣品的檢測來對甲基睪酮分子印 跡固相萃取柱的性能進(jìn)行評價。首先采用不同比例的甲醇-水溶液及甲醇-乙酸溶液對固 相萃取柱進(jìn)行清洗，對淋洗和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。之后，分別用制備的甲基睪酮分子印跡固 相萃取柱和普通的SPE柱富集自然水進(jìn)行比較。結(jié)果表明，分子印跡固相萃取柱使用15次以后，甲基睪酮的回收率略有下降，但 都在90. 0%以上?？梢姡苑肿佑≯E聚合物作為填料制成的MIP-SPE具有較好的穩(wěn)定性和 耐用性能，多次使用后其識別能力仍沒有降低。本發(fā)明具有下述優(yōu)點制備方法簡單，首次以甲基睪酮分子印跡聚合物作為固定 相，具有與其本身匹配的特殊性，所制的固相萃取柱對甲基睪酮具有很高的回收率，并且可 以降低基質(zhì)效應(yīng)。


圖1為甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的洗脫液HPLC譜圖；圖2為普通C18固相萃取柱的洗脫液HPLC譜圖。
具體實施例方式通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法將粉末狀的甲基睪酮分子印跡聚 合物IOOmg與IOml純甲醇混合，振蕩IOmin后超聲20min，混合均勻，移入聚丙烯固相萃取 空柱中，兩端分別用濾膜墊片堵住，裝填均勻后用20ml體積比為1 9的乙酸與甲醇的混 合溶液上柱清洗，然后用IOml純甲醇沖洗，并用N2吹掃除去甲醇，真空干燥即得。對該固相萃取柱進(jìn)行評價用5ml甲醇對甲基睪酮分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活 化，之后將IOOOml河水過濾后上樣，流速1. Oml/min。用5ml甲醇與水(體積比為1 10) 的混合溶液淋洗，再用IOml甲醇與乙酸(體積比為1 9)的混合溶液進(jìn)行洗脫。洗脫液 用氮氣吹干后，加Iml甲醇溶解，用HPLC進(jìn)行分析。同時用C18固相萃取柱對整個過程進(jìn) 行重復(fù)以作比較。
如圖1和圖2所示，用甲基睪酮分子印跡聚合物作固相萃取填料，與普通C18固相 萃取柱相比，可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)，并且提高回收率。另外，分子印跡固相萃取柱使用 15次以后，甲基睪酮的回收率約為96. 5%。實施例2一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法將粉末狀的甲基睪酮分子印跡聚 合物500mg與20ml純乙醇混合，振蕩20min后超聲lOmin，混合均勻，移入聚丙烯固相萃取 空柱中，裝填均勻后用15ml體積比為1 5的三氟乙酸與甲醇的混合溶液多次上柱清洗， 然后用20ml純乙醇沖洗，并用Ar吹掃除去乙醇，干燥即得。分子印跡固相萃取柱使用15次以后，甲基睪酮的回收率約為92. 7%。實施例3一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法將粉末狀的甲基睪酮分子印跡聚 合物300mg與15ml純乙腈混合，振蕩15min后超聲15min，混合均勻，移入聚丙烯固相萃取 空柱中，裝填均勻后用50ml體積比為1 20的甲酸與甲醇的混合溶液多次上柱清洗，然后 用15ml純乙腈沖洗，并用N2吹掃除去乙腈，真空干燥即得。分子印跡固相萃取柱使用15次以后，甲基睪酮的回收率約為93. 6%。實施例4一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法將粉末狀的甲基睪酮分子印跡聚 合物250mg與IOml純丙酮混合，振蕩15min后超聲15min，混合均勻，移入聚丙烯固相萃取 空柱中，裝填均勻后用25ml體積比為1 10的乙酸與甲醇的混合溶液多次上柱清洗，然后 用15ml純丙酮沖洗，并用N2吹掃除去丙酮，真空干燥即得。分子印跡固相萃取柱使用15次以后，甲基睪酮的回收率約為93. 9%。
權(quán)利要求
甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于，以單位重量份、單位體積份為例，將甲基睪酮分子印跡聚合物100 500mg與5 10ml純有機(jī)溶劑混合均勻，移入固相萃取空柱中，裝填均勻后用酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用純有機(jī)溶劑沖洗，最后用惰性氣體吹掃，干燥即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 甲基睪酮分子印跡聚合物為粉末狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 甲基睪酮分子印跡聚合物與純有機(jī)溶劑混合方法為振蕩10-20min后超聲10-20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 純有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 酸性有機(jī)溶劑為甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一種或幾種與甲醇的混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一種或幾種與甲醇的體積比為1 5-1 20。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 惰性氣體為N2或Ar。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于所述 干燥為真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相萃取柱的制備方法，具體地講涉及一種甲基睪酮分子印跡固相萃取柱的制備方法。所述制備方法為，以單位重量份、單位體積份為例，將甲基睪酮分子印跡聚合物100-500mg與5-10ml純有機(jī)溶劑混合均勻，移入固相萃取空柱中，裝填均勻后用酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用純有機(jī)溶劑沖洗，并用惰性氣體吹掃除去殘余有機(jī)溶劑，干燥即得。本發(fā)明制備方法簡單，具有與甲基睪酮分子印跡聚合物本身匹配的特殊性，所制的固相萃取柱對甲基睪酮具有很高的回收率，并且可以明顯降低基質(zhì)效應(yīng)。
文檔編號B01D15/08GK101972634SQ20101027961
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者儲曉剛, 楊敏莉, 沈蕊蓮, 王大寧 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院