專利名稱：能夠降解二噁烷的黃色桿菌d7及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能夠降解二噁烷的新菌株一黃色桿菌D7及其應(yīng)用。 背景技術(shù)：
二噁烷(l，4-DioXane)亦稱1，4-二氧六環(huán)、雙乙酐，是一種具有乙醚味的可燃性液體，毒性較大，被美國環(huán)保署列為B2級(可能的)人類致癌物。二噁烷作為一種重要的有機(jī)化工溶劑，在醫(yī)藥、化妝品、香料等特殊精細(xì)化學(xué)品制造以及科學(xué)研究中作為溶劑、反應(yīng)介質(zhì)、萃取劑使用。另外，許多表面活性劑也含有二噁烷，這些表面活性劑常被用于各種消費(fèi)產(chǎn)品，如各種家用洗滌劑。二噁烷溶解能力強(qiáng)，而且相關(guān)研究表明，二噁烷是一種細(xì)胞色素酶P450的抑制劑，可通過呼吸道、消化道、皮膚進(jìn)入機(jī)體。低濃度時對皮膚和粘膜有麻醉和刺激作用；并且會在體內(nèi)蓄積。如接觸大量蒸氣將引起眼和上呼吸道刺激，且伴有頭暈、 頭痛、嗜睡、惡心、嘔吐等癥狀。另外，二噁烷可致肝、皮膚損害，甚至發(fā)生尿毒癥。二噁烷的廣泛應(yīng)用使其對地下水及大氣的污染日益嚴(yán)重，因此急需尋求一種有效的方法對其進(jìn)行去除。二噁烷是含有兩個相對稱醚鍵的環(huán)狀有機(jī)化合物，這種化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有高水溶性和高耐生物降解性，因而二噁烷曾一度被認(rèn)為“不可生物降解”。隨著 Dmitreko等于1987年從反應(yīng)器中分離到了能利用二噁烷的混合菌株ArthrcAacter sp.、 Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，越來越多的研究者開始了生物法處理二噁烷的研究。 1993年，Sock等在連續(xù)流附著式反應(yīng)器中，培養(yǎng)出以二噁烷為唯一碳源和能源的混合菌群。Roy研究表明，經(jīng)過32天的適應(yīng)期，活性污泥填充反應(yīng)器可完全降解150mg/L的二噁烷，但高濃度的二噁烷不能被完全降解，可能是由于有毒副產(chǎn)物的抑制作用。另外一些研究者已經(jīng)證明了純菌可以降解二噁烷。Bernhardt和Diekman等學(xué)者分離的Rhodococcus sp.可礦化高濃度(880mg/L)的二噁烷，但能否持續(xù)生長卻不得而知。同時，他提出了二噁烷的生物降解途徑可能是先經(jīng)過羥基化，而后再開環(huán)。1993年，Burtack和Perry分離出了具有降解二噁烷的MyccAacterium vaccae,但該菌株降解二噁烷的能力是有限的，且不能持續(xù)生長。1994 年，Parales 分離的 Nocardioform actinomycetes CB1190 可以二噁燒為唯一碳源和能源物質(zhì)，并持續(xù)生長，最終將其礦化，其降解速率是0. 3;3mg/(mg蛋白· min)。 Nakamiya等分離出的真菌Cordyaps sinensis也能以二噁烷為唯一碳源和能源生長。目前國內(nèi)對二噁烷的研究較少。浙江大學(xué)陳紅研究了厭氧條件下，鐵還原菌-Fe (III)-腐殖酸生物/非生物協(xié)同作用和在腐殖酸還原菌生物/非生物協(xié)同作用兩個體系下的二噁烷降解情況。研究表明，鐵還原菌-Fe(II)-腐殖酸生物非生物協(xié)同作用， 40天二噁烷去除率達(dá)到了 90. 47%，加入不同量的氧化鐵對二噁烷降解影響不大，但是增加溶解態(tài)狗(III)加入量卻對二噁烷的氧化降解效率有一定提高。而腐殖酸還原菌-腐殖酸-Fe (III)生物/非生物協(xié)同作用，40天內(nèi)二噁烷基本降解完全。迄今尚未有黃色桿菌降解二噁烷的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一株能夠降解二噁烷的新菌株——黃色桿菌D7及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是能夠降解二噁烷的黃色桿菌(Xanthobacter sp. )D7，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏編號CCTCC NO :M 2010225。本發(fā)明所提供的二噁烷降解菌D7來源于浙江某化工廠污水處理池的活性污泥， 經(jīng)人工馴化、富集、分離得到。該菌是一株革蘭氏陰性菌，菌落特征如下菌體呈短桿狀，大小為(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，無芽孢；菌落呈小圓狀、黃色、形態(tài)飽滿、光滑濕潤，易挑起，菌苔沿劃線生長；氧化酶、檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、V. P.反應(yīng)、M.R.反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，革蘭氏染色陰性。本發(fā)明還涉及所述的黃色桿菌D7在微生物降解二噁烷中的應(yīng)用?？砂凑毡绢I(lǐng)域常規(guī)方法，將黃色桿菌D7接種至含二噁烷的廢水中，或者將含二噁烷的廢氣通入黃色桿菌 D7菌液中，對廢水或廢氣進(jìn)行處理。優(yōu)選的，所述降解在pH 4. 0 10、25°C 40°C下進(jìn)行。Xanthobacter sp. D7能利用二噁烷作為唯一碳源和能源生長繁殖，將二噁烷礦化成(X)2和H20。在純培養(yǎng)條件下，該菌在48h內(nèi)能將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中100mg/L的二噁烷完全降解。所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基(BSM)每IOOOmL 含有Νει2ΗΡ04 · 12Η20 0· 1 6. Og/L、KH2PO4 0· 1 4. Og/L、(NH4)2SO4 0· 1 3. 0g/L、MgSO4 · 7Η20 0. 05 0. 6g/L、CaCl2 · 2H20 0. 01 0. lg/L，微量元素母液0. 5 5mL，二噁烷0. 01 5mM，pH 4. 0 10. 0。微量元素母液濃度組成=FeSO4 · 7H20 1. 0g/L、CuSO4 · 5Η200· 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、 ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶劑為水。所述黃色桿菌D7降解二噁烷不需要經(jīng)過誘導(dǎo)階段，即可穩(wěn)定有效地降解二噁烷。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一株二噁烷的高效降解菌，該菌株為好氧非發(fā)酵型革蘭氏染色陰性菌，能夠以二噁烷為唯一碳源與能源生長同時高效降解該底物；并且該菌株不需要經(jīng)過誘導(dǎo)階段，可穩(wěn)定的降解底物二噁烷。本發(fā)明為生物法凈化含二噁烷廢水及廢氣的工程應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1為黃色桿菌D7的透射電鏡照片；圖2上為黃色桿菌D7的菌體生長、二噁烷降解和有機(jī)碳含量曲線圖；圖3為不同pH下黃色桿菌D7對二噁烷降解率的影響；圖4為不同溫度下，黃色桿菌D7菌體生長和二噁烷濃度的變化情況；圖5為黃色桿菌D7經(jīng)過不同培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接入含二噁烷的新鮮BSM培養(yǎng)基中，菌體對二噁烷的降解情況；-■ -R2A/BSM表示在R2A溶液中預(yù)培養(yǎng)菌體接種至新鮮BSM 中的二噁烷降解情況；-· "BSM/BSM表示在BSM培養(yǎng)基上培養(yǎng)后收集菌體接種至新鮮BSM 中的二噁烷降解情況。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 Xanthobacter sp. D7 的分離與鑒定(1)樣品采集及馴化現(xiàn)場采集浙江某化工廠污水處理池的活性污泥，以二噁烷為唯一碳源和能源，進(jìn)行馴化、富集。數(shù)月后，將活性污泥接種到含50mL BSM培養(yǎng)基的250mL密封鹽水瓶中，以二噁烷作為唯一碳源和能源，繼續(xù)培養(yǎng)、富集。實(shí)驗(yàn)需恒溫(30士 1°C)，并保持在好氧條件下進(jìn)行。BSM 按如下組成配制:4. 5g Na2HPO4 · 12Η20、1· Og KH2PO4U. 5g NH4CUO. 2g MgSO4 · 7H20、0. 023g CaCl2, ImL 微量元素母液，水補(bǔ)足至 1000mL。微量元素母液濃度組成=FeSO4· 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 ·4Η20 0. lOg/L, ZnSO4 · 7H20 0. lOg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶劑為水。(2)菌株分離與鑒定將在鹽水瓶中經(jīng)過多次傳代富集的混合菌液，進(jìn)行稀釋涂布，依據(jù)菌體群落的差異性，挑取單菌落。對單菌落進(jìn)行多次劃線分離后，再接至以二噁烷為唯一碳源和能源的 BSM中，測試降解活性。選擇具有二噁烷降解能力的純菌，進(jìn)一步分離純化，獲得有二噁烷降解活性的菌株D7。菌株D7細(xì)胞呈短桿狀，大小為(0. 5 0. 7) μ mX (0. g 1· 0) μ m，無芽孢；菌落
呈小圓狀、黃色、形態(tài)飽滿、光滑濕潤，易挑起，菌苔沿劃線生長。D7的生理生化特征為好氧，氧化酶反應(yīng)為陽性，檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、 V. P.反應(yīng)、M.R.反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，革蘭氏染色陰性。上述特征與文獻(xiàn)(《常見細(xì)菌鑒定手冊》)編錄的黃色桿菌的生理生化性狀相吻合。該菌株經(jīng)16S rDNA同源性分析，結(jié)合以上生理生化的菌學(xué)特征，將其鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp.)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2010225。實(shí)施例2 :Xanthobacter sp. D7 (CCTCC NO :M 2010225)降解二噁燒的性能種子液制備D7接種于R2A斜面中培養(yǎng)3天，再從斜面接種至含100mg/L 二噁烷的BSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，1200rpm/min離心5min，棄去上清液，用生理鹽水潤洗菌體2次， 配成菌懸液，即為實(shí)驗(yàn)的種子液。以二噁烷作為Xanthobacter sp. D7的唯一碳源，從種子液中接菌體至50mL BSM 培養(yǎng)基，使初始菌體濃度(以O(shè)D計(jì))為0. 01 ；加入二噁烷使初始二噁烷濃度為100mg/L。 放入溫度為30°C、轉(zhuǎn)數(shù)為160r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔一段時間取一次樣，結(jié)果見圖2。隨著時間的延長，菌體濃度逐漸增大，至4 時，菌體濃度達(dá)到0. 178 (以O(shè)D計(jì))。本實(shí)施例說明降解菌Xanthobacter sp. D7可利用二噁烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長繁殖，并且具有穩(wěn)定高效降解二噁烷的能力。用lmol/L NaOH或 HCl 溶液調(diào)節(jié) BSM 培養(yǎng)基為不同 pH值(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、 6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0)，在初始二噁烷濃度為100mg/L的條件下，接入種子液，使各平行樣中的初始菌體濃度(以O(shè)D計(jì))為0.01。將樣品于3(TC、160r/min恒溫?fù)u床里振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)40h后取樣，測菌體及反應(yīng)液中殘余二噁烷的濃度。實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)計(jì) 3個平行樣和一個空白對照(下同)，結(jié)果見圖3?？梢?，在pH4. 0 10. 0，微生物均能降解二噁烷并伴隨細(xì)胞濃度的增加；隨著pH 從4. 0增大到10. 0，菌體濃度及二噁烷降解率均先增大后減小，Xanthobacter sp. D7降解二噁烷的較適宜的PH值為7. 0。本研究表明菌株D7在pH4. 0 10. 0均能不同程度地降解二噁烷，為其在不同PH環(huán)境的應(yīng)用提供了保證。在初始二噁烷濃度為100mg/L的BSM培養(yǎng)基中，接入種子液，使各平行樣中的初始菌體濃度為0. 01 (以O(shè)D計(jì))。將各個樣品分別置于溫度為25°C、30°C、37°C、40°C搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)數(shù)均為160r/min)，定時取樣，測菌體及反應(yīng)液中殘余二噁烷的濃度。 由圖4可知，在25°C 40°C溫度范圍內(nèi)，Xanthobacter sp. D7均能生長，但溫度在37°C以上時，D7的生長明顯較低溫的緩慢。當(dāng)溫度為37°C，細(xì)胞生長速率最快，3 即達(dá)穩(wěn)定期， 菌體濃度(以O(shè)D計(jì))達(dá)0. 180，體系中的二噁烷被完全降解，去除率達(dá)到100%。隨著溫度的進(jìn)一步下降，菌株的生長和降解能力開始下降。將Xanthobacter sp. D7分別接種于R2A液體培養(yǎng)基和BSM培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后收集菌體制成懸濁液作為種子液。于50mL BSM培養(yǎng)基中加入100mg/L底物二噁烷，分別接入Xanthobacter sp. D7種子液使初始濃度達(dá)到0. 4 (以O(shè)D計(jì))，于30°C、160r/min的搖床中進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，在高濃度菌液下，經(jīng)過R2A液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的 Xanthobacter sp. D7較BSM培養(yǎng)基稍慢，但在降解底物二噁烷的初期沒有明顯的停滯期。 可初步判定Xanthobacter sp. D7不需要經(jīng)過誘導(dǎo)階段，即可達(dá)到降解二噁烷的目的。該研究有利于進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)，使其應(yīng)用于生物法凈化含二噁烷廢水及廢氣的工程。實(shí)施例3 =Xanthobacter sp. D7凈化二噁烷廢水在生物滴濾塔中接種Xanthobacter sp. D7菌液連續(xù)處理濃度為100mg/m3的二噁烷廢氣。經(jīng)過25天的掛膜啟動后，生物滴濾塔二噁烷廢氣的凈化效率達(dá)93%以上，此后系統(tǒng)能一直穩(wěn)定運(yùn)行。
權(quán)利要求
1.能夠降解二噁烷的黃色桿菌(Xanthobactersp.)D7，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏編號CCTCC NO: M 2010225。
2.如權(quán)利要求1所述的黃色桿菌D7，其特征在于所述黃色桿菌D7菌落特征如下菌體呈短桿狀，大小為(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，無芽孢；菌落呈小圓狀、黃色、形態(tài)飽滿、光滑濕潤，易挑起，菌苔沿劃線生長；氧化酶、檸檬酸鹽為陽性；接觸酶、V. P.反應(yīng)、 M.R.反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性，革蘭氏染色陰性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的黃色桿菌D7在微生物降解二噁烷中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在pH4. 0 10、251 401下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株可降解二噁烷的新菌株一黃色桿菌D7及其在微生物分解處理二噁烷的應(yīng)用。黃色桿菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年9月9日，保藏編號CCTCC NOM 2010225。本發(fā)明提供的二噁烷降解菌為好氧非發(fā)酵型革蘭氏染色陰性菌，能利用二噁烷作為唯一碳源與能源繁殖并將該底物礦化成CO2和H2O；在純培養(yǎng)條件下，該菌于pH4.0～10、25℃～40℃范圍內(nèi)均能將二噁烷降解；該菌株有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可用于污染環(huán)境的生物修復(fù)，為生物法凈化含二噁烷廢水及廢氣的工程應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號B01D53/84GK102168038SQ20101057207
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者朱潤曄, 金小君, 陳東之, 陳建孟 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)