專利名稱：用于除去蛋白質(zhì)聚集體的具有磺酸基團的膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及用于從蛋白質(zhì)溶液中除去生物物質(zhì)的介質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明涉及用聚合的交聯(lián)涂層組合物飽和的帶負(fù)電荷的濾膜以及制備和使用所述濾膜的方法。
背景技術(shù)：
在衍生自完整有機體或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物來源的基于蛋白質(zhì)的治療性生物分子的生產(chǎn)過程中除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒是經(jīng)常遇到的分離任務(wù)。例如，衍生自血漿的蛋白質(zhì)溶液例如免疫球蛋白(IgG)和其他蛋白質(zhì)(天然的或重組的)例如單克隆抗體 (mAb)、肽、糖和/或核酸通常包含堵塞并且污染病毒截留濾器等的蛋白質(zhì)聚集體，其包含蛋白質(zhì)三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物。通過過濾從蛋白質(zhì)溶液除去病毒顆粒的常見問題是使用相對低容量的超濾濾器， 這顯著增加成本并且減慢過濾操作。由于病毒顆粒的尺寸僅比蛋白質(zhì)分子的尺寸大約3-5 倍，即約25nm對約5-lOnm，所以不得不仔細(xì)選擇濾器的孔徑使其處于這些個體的尺寸之間，通常約20nm。因此，約大于三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)聚集體以及變性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等不能通過典型的病毒截留濾器，引起孔阻塞并且顯著降低濾器的容量 (通量)。即使在0. 01-0. 的低濃度下這些不需要的和不期望的組分也會快速堵塞病毒截留濾器。但是，由于不斷增加的溶液效價，蛋白質(zhì)聚集仍然是基于蛋白質(zhì)的治療性生物分子的生物加工生產(chǎn)中日益嚴(yán)峻的問題。蛋白質(zhì)聚集體在純化過程的不同階段形成，并且為了維持病毒截留濾器足夠的通量，需要在蛋白質(zhì)聚集體到達(dá)病毒截留濾器之前將其除去。 從蛋白質(zhì)溶液選擇性除去約大于三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)聚集體的可選擇方法包括使用昂貴的凝膠色譜或者分子排阻色譜。選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體的最方便的方式是使蛋白質(zhì)和/或其他生物分子的溶液在到達(dá)位于下游的病毒顆粒超濾截留濾器之前通過上游的過濾介質(zhì)，由此在上游選擇性截留蛋白質(zhì)聚集體，允許蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)單體流過病毒截留濾器。從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的一種方法包括兩步超濾法，在各步驟中使用超濾膜。參見例如Antoniou的第6，365，395號美國專利，其中在第一過濾步驟中在上游從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體，在第二過濾步驟中，在下游從不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液除去病毒顆粒。Siwak等人的第7，118，675號美國專利教導(dǎo)了用于從蛋白質(zhì)流除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的另一種兩步過濾法，其中首先將蛋白質(zhì)流通過一層或多層吸附性深層濾器、 帶電荷的或表面改性的多孔膜或者小的色譜介質(zhì)床過濾，以產(chǎn)生不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)流。之后是使回收的溶液經(jīng)過超濾膜以除去病毒顆粒的第二步驟?？捎糜陬A(yù)處理蛋白質(zhì)流的一種方法采用使用與無機助濾劑組合的纖維素介質(zhì)的深層過濾。例如，可商購自Millipore Corporation的Viresolve Prefilter當(dāng)被用于在病毒過濾前預(yù)處理蛋白質(zhì)流時可增加細(xì)小病毒濾器的通量。但是，該預(yù)濾器表現(xiàn)出對苛性堿處理的抗性不足以及相對較高的有機可提取物。由于經(jīng)常需要使用苛性堿溶液清潔或消毒病毒濾器，因此當(dāng)將病毒濾器與預(yù)濾器組合時如果可以通過相同的處理將二者串聯(lián)消毒則該消毒方法將變得顯著地更有效和經(jīng)濟。因此，期望提供能夠抵抗暴露于苛性堿水溶液 (例如0. IN NaOH 1小時)而不損失預(yù)過濾性質(zhì)的用于蛋白質(zhì)溶液的預(yù)處理介質(zhì)。另外，通常在蛋白質(zhì)純化過程后期進(jìn)行病毒過濾，此時需要將進(jìn)入流體流的有機可提取物的量最小化?；诶w維素和助濾劑的深層濾器已顯示出與膜相比顯著更高水平的可提取物，并因此就生物分子等的后期純化而言可能具有潛在問題。因此，期望提供過濾介質(zhì)以及使用和制備所述過濾介質(zhì)的方法和裝置，用于通過上游的預(yù)過濾方法從包含蛋白質(zhì)和/或生物分子的溶液中除去蛋白質(zhì)聚集體和其他堵塞性和結(jié)垢性組分，所述預(yù)過濾方法避免下游過濾介質(zhì)(例如與下游的從包含蛋白質(zhì)和/或生物分子的溶液超濾除去病毒顆粒聯(lián)合使用的那些下游過濾介質(zhì))的過早堵塞。通過本文提供的本發(fā)明的描述，本發(fā)明的這些優(yōu)點以及另外的發(fā)明特征將是顯而易見的。

發(fā)明內(nèi)容
對應(yīng)于上述與在衍生自完整有機體或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物來源的生物分子和基于蛋白質(zhì)的治療性生物分子的生產(chǎn)中除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒相關(guān)的需要，本發(fā)明在某些實施方案中教導(dǎo)了具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔過濾介質(zhì)，其具有苛性堿穩(wěn)定性 (即可以抵抗被堿性溶液的降解)并且適合用于在超濾除去病毒顆粒的上游從蛋白質(zhì)溶液選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體。本發(fā)明在某些實施方案中教導(dǎo)了在進(jìn)行下游的蛋白質(zhì)流的病毒過濾或其他生物加工步驟之前在上游從蛋白質(zhì)流除去蛋白質(zhì)聚集體。在上游除去蛋白質(zhì)聚集體可減少否則會出現(xiàn)在下游病毒濾器的污染和堵塞，由此增加它們的通量和流量。在某些實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了用于從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體的一次性的帶負(fù)電荷的微孔介質(zhì)，由此省去了與在使用間隔清潔和儲存過濾介質(zhì)相關(guān)的費用，還省去了與根據(jù)政府管理機構(gòu)的要求驗證此類清潔操作相關(guān)的費用和時間。在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)，其包括微孔基質(zhì)和交聯(lián)的涂層組合物，所述交聯(lián)的涂層組合物通過暴露于電子束并且在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下在該基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面上原位聚合。所述交聯(lián)的涂層組合物優(yōu)選由帶負(fù)電荷的自由基可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑形成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)，其包括微孔基質(zhì)和交聯(lián)的涂層組合物，所述交聯(lián)的涂層組合物由具有包含帶負(fù)電荷的懸垂的磺酸的基團及其鹽的可聚合的多官能丙烯酰氨基烷基單體和多官能丙烯酰氨基交聯(lián)劑形成，在所述基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面原位聚合。盡管聚合優(yōu)選地在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下通過將單體/交聯(lián)劑/介質(zhì)系統(tǒng)暴露于電離輻射例如電子束而引發(fā)， 但是也可使用適合的化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑以引發(fā)聚合。在另一個實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)，其包括微孔基質(zhì)和由反應(yīng)物溶液形成的交聯(lián)的涂層組合物，所述反應(yīng)物溶液包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPQ單體及其鹽的可聚合的單體和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(MBAm)交聯(lián)劑， 在所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上原位聚合。所得聚合的交聯(lián)的涂層組合物僅包含酰胺-酰胺交聯(lián)鍵。在另一個實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜，其包括微孔基質(zhì)和AMPS及其鹽的交聯(lián)的聚合涂層組合物，其中所述交聯(lián)的涂層組合物在所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上原位聚合。在另一個實施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了微孔膜，其具有覆蓋所述微孔基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面的聚合的交聯(lián)的涂層組合物，還包含補加的改性單體，其優(yōu)選地以少于帶負(fù)電荷的包含磺酸的基團單體或交聯(lián)劑的量存在。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)涂覆的微孔膜，適合用于預(yù)過濾裝置中，用于從終端常規(guī)過濾(NFF)法中的蛋白質(zhì)溶液選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體。將蛋白質(zhì)溶液通過包括一層或多層本文教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜的過濾介質(zhì)預(yù)過濾，以回收幾乎不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了制備具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)的方法，其中所述微孔基質(zhì)用交聯(lián)的涂層組合物涂覆，與交聯(lián)的涂層組合物接觸，或用交聯(lián)的涂層組合物飽和，所述交聯(lián)的涂層組合物包含帶負(fù)電荷的包含磺酸基團的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑以及任選存在的化學(xué)自由基引發(fā)劑，沉積在所述微孔基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了制備具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)的方法，其中在微孔基質(zhì)的全部外表面和內(nèi)表面上用聚合的交聯(lián)的涂層組合物涂覆，所述交聯(lián)的涂層組合物包含可聚合的AMPS及其鹽的單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑例如 MBAm，使得所述交聯(lián)的涂層組合物在所述微孔基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面上原位聚合。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用聚合的交聯(lián)的涂層組合物涂覆的微孔基質(zhì)的制備方法，其包括以下步驟a)提供微孔基質(zhì)；b)任選地用潤濕液洗滌所述微孔基質(zhì)從而將基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面潤濕；c)任選地用第二種潤濕液洗滌所述微孔基質(zhì)的潤濕表面以置換第一種潤濕液，使所述基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面被第二種液體潤濕；d)使所述基質(zhì)與反應(yīng)物溶液接觸，所述反應(yīng)物溶液包含帶負(fù)電荷的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體、 丙烯酰氨基交聯(lián)劑例如MBAm和任選存在的自由基聚合引發(fā)劑；e)使帶負(fù)電荷的交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基單體涂層組合物沉積在所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上；f)從反應(yīng)物溶液中取出用交聯(lián)的涂層組合物飽和的經(jīng)涂覆的基質(zhì)；g)使交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基涂層組合物聚合，在所述基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面上形成聚合的交聯(lián)的涂層組合物；h)在水和/或有機溶劑中清洗所述經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)，以除去任何未反應(yīng)的物質(zhì)和寡聚體物質(zhì)；以及i) 干燥所述經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過兩步過濾法從蛋白質(zhì)溶液中選擇性分離蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒，其包括首先在常規(guī)過濾模式下將蛋白質(zhì)溶液通過具有一層或多層本文所教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜的預(yù)過濾裝置過濾，然后回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液。第二個過濾步驟包括在NFF模式或切向流過濾(TFF)模式下將回收的蛋白質(zhì)溶液通過一個或多個超濾病毒去除膜過濾，以截留病毒顆粒并且允許不含病毒顆粒的蛋白質(zhì)溶液從其通過。
在其他實施方案中，本發(fā)明提供了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜，其適合用于使用終端NFF法的預(yù)過濾裝置中，用于從蛋白質(zhì)的水溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體和其他結(jié)垢性和堵塞性組分。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了使用預(yù)過濾裝置的預(yù)過濾法，所述預(yù)過濾裝置包括一個或多個本文教導(dǎo)的一次性的經(jīng)涂覆的微孔膜，用于通過使用NFF法從生物溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在除去病毒顆粒之前從含有生物分子的水溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體的方法，包括在NFF操作模式下將含有生物分子的水溶液通過一個或多個本文教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜過濾，和回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體的含有生物分子的溶液。本發(fā)明的另一個目的是提供在下游除去病毒顆粒之前從包含生物分子的水溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體、變性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等的方法，包括在NFF操作模式下將生物分子水溶液通過一個或多個本文教導(dǎo)的預(yù)過濾經(jīng)涂覆的微孔膜過濾，和回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體、變性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等的生物分子水溶液。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在NFF操作模式中使用一個或多個本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜從蛋白質(zhì)溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體的方法。在其他實施方案中，本發(fā)明提供在NFF模式中使用一個或多個本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜從蛋白質(zhì)溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體，之后通過一個或多個超濾病毒去除膜以NFF或TFF模式除去病毒顆粒的方法。本發(fā)明還提供處理包含帶正電荷的生物分子的生物流體的方法，其包括使所述生物流體與本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜接觸。本發(fā)明還提供包括一種或多種本文教導(dǎo)的具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的基質(zhì)的濾器裝置、色譜裝置和/或膜組件。本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點將列于下文的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本發(fā)明進(jìn)行多種修改和更改。應(yīng)理解前文的一般性描述和下文對權(quán)利要求的詳細(xì)描述以及附圖僅為示例性和闡釋性的，其旨在提供本發(fā)明教導(dǎo)的各種實施方案的闡釋。本文所述的具體實施方案僅以舉例說明的方式提供并且不以任何形式具有限制性。


圖1是闡明本發(fā)明方法的第一個實施方案的流程圖。圖2是闡明本發(fā)明方法的另一個實施方案的流程圖。圖3用圖示說明了根據(jù)另一個實施方案的預(yù)濾器/濾器組合的通過量性能測量， 在30psig操作壓力下，在一系列不同電導(dǎo)率和pH溶液條件范圍內(nèi)使用熱休克SeraCare IgG (等電點約6-9)測試液進(jìn)行；圖4說明了在通過量測量期間根據(jù)另一個實施方案的結(jié)合至膜預(yù)濾器的蛋白質(zhì)物質(zhì)的SDS-PAGE分析，用IM NaCl溶液洗脫。圖5說明了在通過量測量期間根據(jù)另一個實施方案的結(jié)合至膜預(yù)濾器的蛋白質(zhì)物質(zhì)的SDS-PAGE分析，用去離子水洗脫。
圖6圖示了用SEC定量的洗脫的蛋白的分子量，其中在水洗脫樣品中未檢測到蛋白質(zhì)，而在鹽洗脫物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量的高分子量(HMW)種類，其中進(jìn)料溶液中HMW種類的量低于檢測水平，而根據(jù)另一實施方案，23%的HMW種類從預(yù)濾器膜洗脫，表明聚集體的優(yōu)先結(jié)
I=I O圖7圖示說明了病毒去除的分離的(decoupled)預(yù)過濾模式；以及圖8圖示說明了病毒去除的加入-經(jīng)過(spike-across)(聯(lián)合)預(yù)過濾模式。
具體實施例方式在進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明之前將定義大量的術(shù)語。這些術(shù)語的使用不限制本發(fā)明的范圍，僅用于輔助對本發(fā)明的描述。除非另外指明，否則對于本說明書和所附的權(quán)利要求，表示成分的數(shù)量、物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)或比例、反應(yīng)條件的所有數(shù)字和在說明書和權(quán)利要求中使用的其他數(shù)值應(yīng)理解為在所有條件下均由術(shù)語“約，，來修飾。因此，除非有相反的說明，否則下文說明書和所附權(quán)利要求中列出的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可以根據(jù)本發(fā)明待獲得的期望性質(zhì)而變化。最低限度地，并且不意圖將同等專利的教導(dǎo)的應(yīng)用限制于權(quán)利要求的范圍，各數(shù)值參數(shù)至少應(yīng)根據(jù)所報告的有效數(shù)字的數(shù)并且通過采用常規(guī)的舍入技術(shù)來解釋。盡管限定本發(fā)明的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但是具體實施例中列出的數(shù)值盡可能準(zhǔn)確地報告。然而，任何數(shù)值不可避免地包含必然由它們各自的測量中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差而引起的誤差。此外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為包括該范圍內(nèi)包含的所有子范圍。例如，范圍“1-10”包括最小值1和最大值10之間(包括它們在內(nèi))的任意和所有子范圍，即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值的任意和所有子范圍，例如 5. 5-10。除非上下文明確表明其他含義，否則在本文中使用的單數(shù)形式“一”、包括復(fù)數(shù)個所指物。本文中使用的“AMPS”指2-丙烯酰氨基_2_甲基丙烷磺酸及其鹽。本文中使用的術(shù)語“生物分子”或“生物學(xué)分子”旨在表示為生命體的一部分的任何有機分子或其類似物。因此，生物分子包括但不限于氨基酸的聚合物例如肽和蛋白質(zhì) (包括抗體和酶)和核苷酸的聚合物例如DNA或RNA分子以及DNA和RNA探針。碳水化合物和脂質(zhì)也包括于生物分子的定義內(nèi)。意圖將前文所述每一種分子的合成生產(chǎn)的類似物包括于術(shù)語“生物分子”的定義內(nèi)。本文中與本發(fā)明的膜基質(zhì)和方法一起使用的術(shù)語“清潔膜”表示生產(chǎn)時具有以下特征的膜或膜基質(zhì)a.通過本文所述的NVR提取檢測測定，每平方厘米膜少于約50微克可提取物，優(yōu)選地，每平方厘米膜少于約25微克可提取物；或者b.通過本文所述的TOC可提取物檢測測定，每平方厘米膜少于約25微克可提取物。本文使用的用于本發(fā)明的經(jīng)涂覆的微孔膜的術(shù)語“苛性堿抗性，，或“苛性堿穩(wěn)定性”表示在環(huán)境溫度下暴露于0. INaOH兩小時后滲透性或吸附特性無可測量的變化的膜。
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本文使用的術(shù)語“交聯(lián)的聚合物”表示由兩種或多種單體形成的聚合物，所述單體具有兩個或多個可參與聚合反應(yīng)或者能夠交聯(lián)分離的聚合物鏈的反應(yīng)位點。本文使用的“MBAm”指N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。本文使用的“NFF”指常規(guī)過濾。本文使用的術(shù)語“聚合物”旨在包括由一種或多種可聚合單體形成的聚合組合物。本文使用的術(shù)語“多官能單體”指具有多于一個不飽和官能基團的單體。本文使用的術(shù)語“反應(yīng)物溶液”指至少包含具有一個或多個帶負(fù)電荷的包含磺酸的基團及其鹽的多官能可聚合的單體和多官能丙烯酰氨基交聯(lián)劑的溶液。反應(yīng)物溶液的優(yōu)選實施方案的實例是包含AMPS及其鹽的可聚合單體和MBAm交聯(lián)劑的水溶液。本文使用的用于本發(fā)明的膜和方法的表面涂層的術(shù)語“表面”指微孔介質(zhì)或膜的全部表區(qū)域，包括微孔介質(zhì)或膜的外部表面或外表面和內(nèi)部表面或內(nèi)表面。術(shù)語“外部表面”或“外表面”指看得見的表面，例如膜的平面或者微孔表面。術(shù)語“內(nèi)部表面”或“內(nèi)表面”旨在表示微孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部表面，即微孔介質(zhì)或膜的間隙區(qū)域。本文使用的“TFF”指切向流過濾。微孔基質(zhì)就本發(fā)明而言，將超濾基質(zhì)定義為相對于基于hternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)," Terminology for membranes and membrane processes", Pure App 1. Chem.出版，1996，68，1479的如下定義的基質(zhì)膜微濾壓力驅(qū)動的基于膜的分離方法，其中排阻大于0. 1 μ m的顆粒和溶解的大分子；和超濾壓力驅(qū)動的基于膜的分離方法，排阻小于0. 1 μ m并且大于約2nm的顆粒和溶解的大分子。當(dāng)與膜、基質(zhì)、濾器或介質(zhì)一起使用時，本文所使用的術(shù)語“微濾”或“微孔”可為若干種形式中的任何一種，包括但不限于薄板、管和中空纖維。當(dāng)與膜、基質(zhì)、濾器或介質(zhì)一起使用時，本文所使用的術(shù)語“超濾”可為若干種形式中的任何一種，包括但不限于薄板、管和中空纖維。根據(jù)跨越膜厚度的孔徑或者對于中空纖維而言跨越纖維的微孔壁的孔徑的均一性，將可用于本發(fā)明的實施的多孔膜分為對稱的或不對稱的。本文使用的術(shù)語“對稱膜”指具有基本均一的跨越膜橫截面的孔徑的膜。術(shù)語“非對稱膜”指跨越膜橫截面的平均孔徑不恒定的膜。例如，在非對稱膜中，孔徑可隨著穿過膜橫截面的位置平穩(wěn)地或不連續(xù)地地變化。 應(yīng)理解“非對稱膜”的定義內(nèi)包括一個外表面上的孔徑與相對的外表面上的孔徑的比例基本大于1的膜。本文教導(dǎo)的用于本發(fā)明中的代表性膜包括由帶負(fù)電荷的微孔膜或基質(zhì)形成并且具有諸如Moya的第5，629，084號美國專利和Meuck的第4，618，533號美國專利中教導(dǎo)的表面化學(xué)(例如親水性或疏水性)的那些。由多種物質(zhì)制備而成的多種微孔基質(zhì)可用于本發(fā)明的實施中。此類微孔基質(zhì)的實例包括多糖、無紡布、陶瓷、金屬、棉、纖維素包括纖維素 / 二氧化硅混合物以及纖維素衍生物例如醋酸纖維素、基于聚合物的玻璃纖維、以及它們的組合。
在本文教導(dǎo)的優(yōu)選的實施方案中用于接受交聯(lián)的涂層組合物的微孔基質(zhì)為基于微孔聚合物的膜?？捎糜谏a(chǎn)可用于本發(fā)明的微孔基質(zhì)和膜的代表性聚合物包括但不限于取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亞胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基親水聚合物、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、共聚物或苯乙烯和二乙烯基苯、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、全氟化熱塑性聚合物、聚烯烴、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、以及它們的組
I=I O可用于本發(fā)明的微孔基質(zhì)還可由色譜介質(zhì)制成，包括分子排阻介質(zhì)、離子交換介質(zhì)以及疏水或親水介質(zhì)。在特別優(yōu)選的實施方案中，微孔膜基質(zhì)為聚醚砜膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確認(rèn)可用于形成適于本發(fā)明的微孔基質(zhì)的其他聚合物。在所述微孔膜基質(zhì)為親水性的實施方案中，用于基質(zhì)的優(yōu)選的物質(zhì)包括聚酰胺、醋酸纖維素和纖維素。聚合的交聯(lián)的涂層組合物聚合的交聯(lián)的涂層組合物由反應(yīng)物溶液形成，所述反應(yīng)物溶液至少具有一個或多個包含帶負(fù)電荷的含有懸垂的磺酸的基團和/或其鹽的可聚合多官能丙烯酰氨基烷基單體和多官能丙烯酰氨基交聯(lián)劑。在優(yōu)選的實施方案中，反應(yīng)物溶液是包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)及其鹽的可聚合的單體和多官能丙烯酰氨基交聯(lián)劑例如N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(MBAm)的水溶液，其中所得聚合的交聯(lián)的涂層組合物僅包含酰胺-酰胺交聯(lián)鍵。反應(yīng)物溶液優(yōu)選地包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPQ及其鹽的可聚合的單體和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(MBAm)交聯(lián)劑的水溶液。一般而言，以反應(yīng)物溶液的重量計，AMPS單體以約1重量％ -約20重量％，優(yōu)選約3重量％ -約6重量％的濃度存在于反應(yīng)物溶液中。以AMPS單體的重量計，MBAm交聯(lián)劑優(yōu)選以約5重量％ -約100重量％的濃度存在于反應(yīng)物溶液中。交聯(lián)的涂層組合物在不存在任何化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下，通過暴露于電子束輻射而在微孔基質(zhì)的表面以及內(nèi)部孔壁原位聚合。優(yōu)選地，聚合的交聯(lián)的涂層組合物覆蓋微孔基質(zhì)的全部外表面和內(nèi)表面。交聯(lián)的涂層組合物還可包含補加的改性單體，其優(yōu)選以小于具有含有帶負(fù)電荷的懸垂磺酸的基團的多官能丙烯酰氨基烷基單體或多官能丙烯酰氨基交聯(lián)劑的量存在。制備帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的多孔基質(zhì)的方法將反應(yīng)物溶液施用至微孔基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面，使得基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面被反應(yīng)物溶液飽和。以直接涂覆的形式實現(xiàn)反應(yīng)物溶液至微孔基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上的期望的沉積，并且不需要或使用中間結(jié)合化學(xué)組分或部分例如氨基酸等。優(yōu)選使用容易被聚合溶液潤濕的微孔基質(zhì)。這將與使用有機溶劑預(yù)潤濕不能潤濕的基質(zhì)和進(jìn)行溶劑交換相關(guān)的時間和費用最小化。但是，當(dāng)使用不能潤濕的微孔基質(zhì)時，為了用聚合的交聯(lián)的/接枝的聚合物組合物基本飽和全部內(nèi)表面和外表面，形成經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)的第一步優(yōu)選包括用溶劑組合物洗滌基質(zhì)，所述溶劑組合物為例如不會膨脹或溶解微孔基質(zhì)并且潤濕微孔基質(zhì)的外表面以及孔的內(nèi)壁的水和有機溶劑的混合物。
用于該目的的適合的水-有機溶劑組合物包括甲醇/水、乙醇/水、丙酮/水、四氫呋喃/水等。該潤濕步驟的目的為確保隨后與微孔基質(zhì)接觸的可聚合的AMPS單體及其鹽和MBAm交聯(lián)劑將微孔基質(zhì)的全部內(nèi)表面和外表面潤濕。如下文所述，當(dāng)試劑浴自身能夠潤濕微孔基質(zhì)的全部表面時可省去該初步潤濕步驟。當(dāng)試劑浴包含高濃度的(例如15重量％或更高)有機反應(yīng)物時可以實現(xiàn)這一點。將微孔基質(zhì)潤濕后，使在溶劑中的包含自由基可聚合的AMPS單體及其鹽和MBAm 交聯(lián)劑的試劑浴與微孔基質(zhì)接觸，由此飽和基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面。用于試劑浴的具體溶劑取決于用于形成微孔基質(zhì)的具體聚合物或物質(zhì)。必要的是AMPS單體和MBAm交聯(lián)劑溶解于所述溶劑中，所述溶劑不會腐蝕微孔基質(zhì)并且所述基質(zhì)不會不利地影響聚合反應(yīng)。代表性的適合的溶劑包括水或有機溶劑例如醇、酯、丙酮或它們的相容性含水混合物。將微孔基質(zhì)浸漬于反應(yīng)物溶液中使得內(nèi)表面和外表面完全被反應(yīng)物溶液飽和后， 從溶液中取出微孔基質(zhì)以在溶液外部進(jìn)行聚合反應(yīng)從而不浪費可聚合的AMPS單體。因此， 可分批地或連續(xù)地進(jìn)行該反應(yīng)。當(dāng)以連續(xù)方法操作時，用反應(yīng)物溶液飽和微孔基質(zhì)薄板，然后將其轉(zhuǎn)移至反應(yīng)區(qū)，在反應(yīng)區(qū)中將其暴露于電子束能量以進(jìn)行聚合反應(yīng)。可在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下通過使用電離輻射引發(fā)聚合，或者， 可使用自由基化學(xué)引發(fā)劑代替電離輻射。當(dāng)使用自由基引發(fā)劑時，在潤濕微孔基質(zhì)前將其加入聚合溶液，通常以0. 01-1% 的量加入。根據(jù)自由基引發(fā)劑的化學(xué)性質(zhì)，可通過加熱或UV輻射引發(fā)聚合。UV活化的引發(fā)劑(即光引發(fā)劑)的實例為144-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙烷-1-酮 (^i UMm^ Irgacure 2959 1 g Ciba Specialty Chemicals，Basel，Switzerland)。當(dāng)不使用化學(xué)自由基聚合引發(fā)劑聚合反應(yīng)物溶液時，為了實現(xiàn)AMPS單體的聚合， 所述原位發(fā)生的聚合依賴于以至少約0. IM拉德至約6M拉德的劑量將飽和基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面的反應(yīng)物溶液暴露于電子束輻射，得到全部內(nèi)表面和外表面被聚合的交聯(lián)的涂層組合物涂覆的微孔基質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)可實現(xiàn)用交聯(lián)的聚合物完全涂覆微孔基質(zhì)，而不需要化學(xué)自由基聚合引發(fā)劑。當(dāng)通過電子束遞送了期望劑量的輻射后，在水和/或甲醇中清洗經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)，以除去未反應(yīng)的物質(zhì)和寡聚體物質(zhì)。然后將經(jīng)涂覆的基質(zhì)干燥并并測試再潤濕、流動和其他性質(zhì)。以下實施例舉例說明本發(fā)明并且不意圖限制本發(fā)明。在以下實施例中適用膜通過量，以每單位膜面積體積表示，其是在通量降低(對于恒壓模式)或壓力增加(對于恒流模式)超過某一實際閾值之前可以通過所述膜過濾的溶液的體積。在以下實施例中，數(shù)值V75是當(dāng)以30psi恒壓進(jìn)行試驗時當(dāng)起始通量減少75%時預(yù)濾器和病毒截留濾器的組合的通過量。流動時間流動時間是涂層厚度對基質(zhì)孔徑的作用的量度。如果涂層很薄，則基質(zhì)孔徑的變化小并且流動時間的變化小。如果涂層厚度大，則基質(zhì)孔徑的變化和流動時間的變化大。在改性之前和之后測量基質(zhì)的流動時間，以測定已出現(xiàn)的孔堵塞的程度。計算被改性基質(zhì)所保留的原始流量的百分?jǐn)?shù)。一般而言，原始流量截留越大，基質(zhì)越合意。
在特定的和可重現(xiàn)的條件下測量流動時間。本文中使用的用于測定流動時間的標(biāo)準(zhǔn)方法為測量在27. 5英寸汞柱真空下500ml水流過玻璃濾器支持物中的47mm基質(zhì)圓盤所需的以秒計算的時間。根據(jù)G. R. Bolton 等人，Biotechnol. Appl. Biochem. 0006) 43，55-63 記載的步驟生成包含聚集體的蛋白質(zhì)溶液。將50nM醋酸鹽緩沖液(pH 5. O, IOOmM NaCl)中的0. lg/1 人 IgG(HS-475 ；SeraCare Life Sciences, Oceanside, CA, U. S. Α.)溶液在 60°C下加熱 Ih 以將蛋白質(zhì)變性并且形成聚集體。以9體積％將該溶液加(spike)回未變性的IgG中。在整個實施例中將該溶液用于測量膜通過量。經(jīng)涂覆的基質(zhì)被水自發(fā)潤濕的能力是經(jīng)涂覆的基質(zhì)的重要性質(zhì)。通過將經(jīng)涂覆的基質(zhì)置于水上并且測量經(jīng)涂覆的基質(zhì)被潤濕透的以秒計算的時間來測定再潤濕時間。這通過經(jīng)涂覆的基質(zhì)在濕潤時變得較深而用肉眼進(jìn)行觀察。涂覆基質(zhì)的通用步驟以下步驟描述了通過電子束輻射處理經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)以產(chǎn)生具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)的通用方法。在甲醇中將基質(zhì)潤濕，在水中洗滌并且在可聚合的AMPS單體/MAaii交聯(lián)劑反應(yīng)物水溶液中浸漬若干分鐘以確保完全交換。如果可聚合的AMPS單體/MABm交聯(lián)劑反應(yīng)水溶液能夠直接潤濕基質(zhì)，則預(yù)潤濕交換步驟不是必要的。用于引發(fā)基質(zhì)表面上的AMPS單體的聚合的電子束技術(shù)包括例如Meuck的第 4，944，879號美國專利中記載的方法，將其公開內(nèi)容援引加入本文。例如，Meuck教導(dǎo)了使網(wǎng)或者單個樣品通過由電子束處理器生成的電子簾。處理器遞送約IOOkV至約200kV的期望劑量。移動的網(wǎng)或樣品以適合在所述簾下產(chǎn)生期望的暴露時間的速度輸送。暴露時間與劑量的組合決定了劑量率。典型的暴露時間為約0.5秒至約10秒。劑量率一般為約 0. OlkGy (千戈瑞)至約6kGy (即0. 1至約6M拉德)。通過電子束遞送期望劑量的輻射后，在水和/或甲醇中洗滌經(jīng)處理的微孔基質(zhì)， 以除去未反應(yīng)的物質(zhì)和寡聚體物質(zhì)。然后將基質(zhì)干燥并測試再潤濕、流動和其他性質(zhì)。以下步驟描述了通過使用光引發(fā)劑處理經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)以產(chǎn)生具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)的方法。將基質(zhì)在甲醇中潤濕，在水中洗滌并且在包含自由基光引發(fā)劑的可聚合的AMPS單體/MABm交聯(lián)劑反應(yīng)水溶液中浸漬若干分鐘以確保完全交換。如果可聚合的AMPS單體/MABm交聯(lián)劑反應(yīng)水溶液能夠直接潤濕基質(zhì)，則預(yù)潤濕交換步驟不是必需的。用于在基質(zhì)表面上引發(fā)AMPS單體聚合的光引發(fā)劑包括例如J.-p. Fouassier， Photoinitiation, Photopolymeriζation, and Photocuring :Carl Hanser Verlag, Munich, Germany, 1995，第20-93頁和第21頁的表3_1中記載的那些。通過將用AMPS/交聯(lián)劑/光引發(fā)劑溶液飽和的多孔基質(zhì)暴露于劑量足以引起光引發(fā)劑降解和自由基生成的紫外線、可見光或紅外線輻射而實現(xiàn)AMPS聚合。紫外線輻射的適合的來源可以包括由Fusion UV Systems, Inc. (Gaithersburg, MD)生產(chǎn)的在具有兩個UV 光源(一個在頂部且一個在底部)的UV輸送機。當(dāng)通過光源遞送了期望劑量的輻射之后，在水和/或甲醇中洗滌經(jīng)處理的微孔基質(zhì)以除去未反應(yīng)的物質(zhì)和寡聚體物質(zhì)。然后將基質(zhì)干燥并測試再潤濕、流動和其他性質(zhì)。使用帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的多孔基質(zhì)
在一個實施方案中，本發(fā)明提供從包含蛋白質(zhì)和/或生物分子的溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體(包括但不限于蛋白質(zhì)三聚體和更大的蛋白質(zhì)聚合物)以及其他堵塞性和結(jié)垢性不期望的組分的方法。在本發(fā)明的另一個實施方案中，首先用截留介質(zhì)過濾蛋白質(zhì)溶液以選擇性地截留包含蛋白質(zhì)三聚體和更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)聚集體并同時允許蛋白質(zhì)單體從其通過。使用具有一層或更多層吸附性膜的裝置進(jìn)行該過濾步驟。當(dāng)使用這些物質(zhì)時，實現(xiàn)了基本完全的蛋白質(zhì)聚集體去除同時允許回收大于約85%的蛋白質(zhì)單體，優(yōu)選大于約90% 的蛋白質(zhì)單體，最優(yōu)選大于約98%的蛋白質(zhì)單體。圖1描繪了采用恒壓過濾模式的本發(fā)明方法10的優(yōu)選實施方案之一。蛋白質(zhì)溶液12被加壓貯器14截留并且經(jīng)管道18通過容器內(nèi)的壓力被泵入過濾介質(zhì)單元16。使該溶液經(jīng)歷常規(guī)過濾模式，聚集體被介質(zhì)截留并且不含聚集體的溶液以濾液的形式從第一步驟10排出。使該濾液經(jīng)管道20用于進(jìn)一步的下游加工例如第二過濾步驟22 (下文中詳細(xì)闡述)，然后到達(dá)出口管道對。通過以該方式操作，蛋白質(zhì)聚集體被介質(zhì)單元16截留，同時蛋白質(zhì)單體通過介質(zhì)16。或者，可使用泵以產(chǎn)生該系統(tǒng)的恒壓，但這不是優(yōu)選的，因為需要通過閥門或者泵速將泵輸出小心地控制于恒壓并且需要反饋系統(tǒng)以確保該壓力保持恒定。本發(fā)明的另一個實施方案示于圖2中，其中使用了恒流操作模式。在該系統(tǒng)中使用位于貯器觀(通常是不加壓的，與圖1中的實施方案的貯器14相比較)和第一過濾步驟 30之間的泵沈以保持恒流。將蛋白質(zhì)溶液31經(jīng)管道32泵送至泵入口 34，然后經(jīng)管道36 泵送至第一過濾步驟30。使蛋白質(zhì)溶液31經(jīng)歷常規(guī)過濾模式，聚集體被第一步驟30的濾器截留，其中不含聚集體的溶液以濾液的形式從第一步驟30排出。使該濾液通過管道38 用于進(jìn)一步的下游加工例如第二過濾步驟40 (下文中詳細(xì)闡述)，然后到達(dá)出口管道42。如果期望，可在第一過濾步驟30的出口(未顯示)增加再循環(huán)回路(未顯示)，并且將濾液經(jīng)過過濾步驟30再循環(huán)一次或更多次，以進(jìn)一步降低濾液中的聚集體水平。使用閥門(未顯示)是控制再循環(huán)回路和下游管道之間的流動的最簡單的方法。但是，另外的再循環(huán)次數(shù)一般是不需要的并且不必要地增加了生產(chǎn)時間和成本。已發(fā)現(xiàn)一次再循環(huán)通常是足夠的。在第二過濾步驟中(22或40)，在除去聚集體之后進(jìn)行病毒去除過濾。通過常規(guī)濾器(NFF)或者例如2000年11月3日提交的并且全文援引加入本文的第6，365，395號美國專利記載的切向流過濾(TFF)濾器從不含聚集體的溶液中除去病毒。對于除去蛋白質(zhì)聚集體，首先將蛋白質(zhì)溶液通過本文教導(dǎo)的具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)預(yù)濾器預(yù)過濾。優(yōu)選使用終端NFF模式進(jìn)行預(yù)過濾。終端過濾指其中被過濾的全部流體流都經(jīng)過濾器而無再循環(huán)或滯留物流的過濾。任何不能通過濾器的物質(zhì)或者保留在濾器的上表面或者保留在濾器內(nèi)。當(dāng)在第一步驟中使用本文教導(dǎo)的用于除去蛋白質(zhì)聚集體的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)預(yù)濾器在上游過濾蛋白質(zhì)溶液時，可在下游的第二步驟中使用病毒顆粒截留濾器。在一個實施方案中，所述蛋白質(zhì)聚集體去除濾器可在使用后丟棄。當(dāng)使用第二過濾步驟以選擇性地截留病毒顆粒時(例如Antoniou的第6，365，395 號美國專利所記載，其全文援引加入本文)可通過TFF或者通過終端NFF用一個或多個超濾膜實現(xiàn)過濾，其中通過該兩步過濾法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)溶液是不包含聚集體并且不包含病毒的蛋白質(zhì)。所述一個或多個超濾膜截留病毒顆粒同時允許蛋白質(zhì)單體從其通過。在TFF病毒過濾步驟之后，可任選地用水或含水緩沖液洗滌所述超濾膜，以回收被該膜截留的任何蛋白質(zhì)。當(dāng)首先用本文教導(dǎo)的具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的膜預(yù)過濾包含蛋白質(zhì)三聚體和更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)溶液時，蛋白質(zhì)聚集體被選擇性地截留，同時允許蛋白質(zhì)單體從其通過。使用具有一層或多層帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜的預(yù)濾器實現(xiàn)該預(yù)過濾步驟，其中實現(xiàn)了從蛋白質(zhì)溶液基本完全除去蛋白質(zhì)聚集體同時允許回收大于約85%的蛋白質(zhì)單體，優(yōu)選大于約90%的蛋白質(zhì)單體，并且更優(yōu)選大于98%的蛋白質(zhì)單體。使用在預(yù)過濾步驟中使用的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜以從生物分子溶液中除去堵塞性組分與目前使用的常規(guī)蛋白質(zhì)和病毒顆粒分離方法相比具有實質(zhì)性優(yōu)點。由于以 NFF模式操作第一步驟(除去堵塞性組分)的過濾裝置，因此其是一次性的并且不對驗證步驟等進(jìn)行清潔方法。此外，常規(guī)操作模式的購買和操作較低廉，因為與TFF超濾型系統(tǒng)相比建立此類系統(tǒng)需要較少的資金。另外，由于在除去病毒顆粒的第二過濾步驟中使用的膜不會被蛋白質(zhì)聚集體結(jié)垢或堵塞，因此延長了其使用壽命。本文教導(dǎo)的本發(fā)明提供的另一優(yōu)點包括在第一預(yù)過濾步驟中使用的經(jīng)涂覆的微孔膜不必需是超濾膜。總之，可以看出用NFF聚集體去除步驟獲得的通過量和通量的提高。Vmax比不使用NFF聚集體去除步驟獲得的Vmax高至少900%。本發(fā)明提供在進(jìn)行下游病毒過濾或其他加工步驟之前在上游從蛋白質(zhì)流和/或溶液除去蛋白質(zhì)聚集體的簡單方法。該預(yù)過濾步驟減少了否則會出現(xiàn)在下游病毒截留濾器等的結(jié)垢和堵塞。此外，其在不需要TFF的條件下進(jìn)行，TFF的購買和運行均更昂貴并且需要在使用間隔進(jìn)行清洗。本發(fā)明允許丟棄聚集體濾器，使得能夠省去在使用間隔清洗和儲存膜的費用以及向管理機構(gòu)例如FDA驗證在如此進(jìn)行中所使用的操作的費用和時間。當(dāng)從基本不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液除去病毒顆粒時，將來自蛋白質(zhì)聚集體去除步驟的濾液引入第二過濾步驟。該第二過濾步驟采用能夠以TFF模式或NFF模式運行的一個或多個病毒截留濾(通常為超濾)膜。在任一模式中，過濾于在膜表面上截留病毒顆粒(通常具有20-100納米(nm)直徑)同時允許蛋白質(zhì)單體和一部分蛋白質(zhì)二聚體通過所述膜的條件下進(jìn)行。用于第二步病毒顆粒去除步驟中的代表性的適合的超濾病毒截留膜包括由再生纖維素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亞胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(PVDF)等形成的那些， 并且包括可獲自 Millipore Corporation of Billerica, MA, USA 的 VIRESOLVE NFP、 VIRES0LVE Pro和RETR0P0RE 膜。可將這些膜以濾柱NFF形式例如VIRESOLVE NFP病毒濾器，或者以TFF盒例如同樣可獲自Millipore Corporation of Billerica，MA，USA的 PELLIC0N .盒形式提供。用于本發(fā)明方法中的病毒濾器的特征為在20-100nm的病毒顆粒直徑的感興趣的尺寸范圍內(nèi)對病毒顆粒和其他顆粒的對數(shù)截留值(LRV ；篩分系數(shù)的負(fù)對數(shù))隨顆粒的直徑單調(diào)增加。按照經(jīng)驗，LRV隨顆粒投射面積(顆粒直徑的平方)的大小連續(xù)增加。
當(dāng)從蛋白質(zhì)溶液除去小尺寸病毒顆粒時，獲得至少約3的令人滿意的LRV。但是分子量篩截降低，由此減少了蛋白質(zhì)回收。因此，優(yōu)選可得到令人滿意的LRV和蛋白質(zhì)回收的膜。用于本發(fā)明方法中的膜能夠產(chǎn)生對病毒顆粒為3的LRV并且當(dāng)病毒顆粒大小為 IO-IOOnm直徑時可增加至高達(dá)約8或者更高。接著可將不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)流通過一個或多個超濾膜過濾，從而以至少 3LRV的截留水平截留病毒顆粒，并且允許不含病毒顆粒且不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液從其通過。本發(fā)明還提供包括一個或多個本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的基質(zhì)的裝置， 例如過濾裝置、色譜裝置、大分子轉(zhuǎn)移裝置、流量分布器裝置和/或膜組件。所述裝置可為任何適合的形式，例如，所述裝置可包括濾器元件，其包括基本為平面或褶皺形式的本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的基質(zhì)。在另一個實施方案中，所述濾器元件可具有中空的基本為圓柱狀的形式。如果期望，所述裝置可包括與上游和/或下游的支持物或引流層組合的本文教導(dǎo)的預(yù)濾器微孔經(jīng)涂覆的膜。所述裝置可包括多個膜例例如用于提供多層濾器元件，或疊加以提供膜組件，例如用于膜色譜法中的膜組件。可以通過包括殼體和端蓋構(gòu)建濾柱以提供流體密封以及至少一個入口和至少一個出口。所述裝置可被構(gòu)建成以錯流或切向流(TFF) 模式以及終端模式(NFF)操作。因此，待處理的包含蛋白質(zhì)的溶液或流體可例如切向地通過膜表面或者垂直地通過膜表面。在另一個實施方案中，本文教導(dǎo)的微孔經(jīng)涂覆的膜可單獨使用或成組使用，使得包含蛋白質(zhì)的溶液平行或串流接觸一個或多個預(yù)濾器元件。例如，本文教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜可成組使用，例如密封在相同殼體內(nèi)的疊加的多層(通常為3-8層)。參見，例如， Boeddinghaus等人的第2，788，901號美國專利和Ostreicher的第5，085，784號美國專利。顯示于圖1的本發(fā)明的一個實施方案描繪了第一方法步驟10，其中采用恒壓過濾模式。蛋白質(zhì)溶液12被加壓貯器14截留并且經(jīng)管道18通過容器內(nèi)的壓力被泵入過濾介質(zhì)單元16。使蛋白質(zhì)溶液12經(jīng)歷常規(guī)過濾模式，蛋白質(zhì)聚集體被包含在過濾介質(zhì)單元16 內(nèi)的本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的介質(zhì)預(yù)濾器截留，不含蛋白質(zhì)聚集體的溶液以濾液的形式從第一步驟10排出。接著使該濾液經(jīng)管道20用于進(jìn)一步的下游加工例如第二過濾方法步驟22 (如上文所述)，并且其中濾液經(jīng)出口管道M離開方法步驟22。通過以該方式操作，蛋白質(zhì)聚集體被具有本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的介質(zhì)預(yù)濾器的介質(zhì)單元 16截留，同時蛋白質(zhì)單體等通過介質(zhì)單元16，由此得到不含蛋白質(zhì)聚集體的溶液?；蛘撸墒褂帽靡援a(chǎn)生該系統(tǒng)的恒壓，但這不是優(yōu)選的，因為需要通過閥門或者泵速將泵輸出小心地控制于恒壓并且需要反饋系統(tǒng)以確保將該壓力保持恒定。本發(fā)明的另一個實施方案顯示于圖2中，其描繪了第一方法步驟30，其中使用了恒流操作模式。在該系統(tǒng)中，泵^^立于貯器觀(通常是不加壓的，與顯示于圖1中的實施方案的加壓貯器14相比較)和過濾介質(zhì)單元35之間，用于維持恒流。經(jīng)管道32將蛋白質(zhì)溶液31泵送至泵入口 34，并且經(jīng)管道36泵送至過濾介質(zhì)單元35。同樣，用于第一步驟30 中的預(yù)濾器為本文教導(dǎo)的并且也在圖1中使用的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的介質(zhì)。使蛋白質(zhì)溶液31經(jīng)歷常規(guī)過濾模式，其中蛋白質(zhì)聚集體被過濾介質(zhì)單元35內(nèi)的預(yù)濾器截留，不含蛋白質(zhì)聚集體的溶液以的形式濾液排出并且使其通過管道38用于進(jìn)一步的下游加工，例如第二過濾方法步驟40 (如上文所述)，然后到達(dá)出口管道42。通過以該方式操作，蛋白質(zhì)聚集體被具有本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng)涂覆的介質(zhì)預(yù)濾器的介質(zhì)單元35截留，同時蛋白質(zhì)單體等通過介質(zhì)單元35，從而得到不含蛋白質(zhì)聚集體的溶液。再循環(huán)回路(未顯示)可位于第一過濾步驟(10、30)的出口處(未顯示)并且如果需要，將經(jīng)過第一過濾步驟的濾液再循環(huán)一次或更多次，以進(jìn)一步降低濾液中的聚集體水平。使用閥門(未顯示)是控制再循環(huán)回路和下游管道之間的流動的最簡單的方法。已發(fā)現(xiàn)一次再循環(huán)是足夠的。另外的再循環(huán)次數(shù)一般不是必需的并且不必要地增加了生產(chǎn)時間和成本。以下實施例舉例說明本發(fā)明并且為本發(fā)明的示例性說明，但是不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。據(jù)推測本發(fā)明的膜預(yù)濾器主要通過在其帶負(fù)電荷的表面上帶正電荷的蛋白質(zhì)聚集體的離子結(jié)合而運行?；趯λ鲱A(yù)濾器如何運行的機制的這一理解，可適當(dāng)?shù)卮_定運行條件、選擇驗證策略以及解決可能的故障?？赏ㄟ^在一系列溶液條件下分析預(yù)濾器的性能而研究預(yù)濾器運行的機制。例如， 改變測試溶液的電導(dǎo)率和PH并且測量預(yù)濾器/濾器組合的通過量。在30psig操作壓力下將熱休克 kraCare IgG(等電點或“pi” 為約 6-9) (SeraCare Life Sciences, Inc., Milford,MA,USA)用于測試溶液中。如圖3所示，預(yù)濾器在低于聚集體等電點的pH范圍內(nèi)以及約2-16mS/cm的電導(dǎo)率范圍內(nèi)最有效。隨著pH接近pl，聚集體上的凈正電荷減少，且整體電荷相互作用隨電導(dǎo)率增加而減弱。預(yù)濾器在高PH和高電導(dǎo)率下的相對較差的性能似乎驗證了離子相互作用是從抗體流中除去聚集體的主要原因。除去(洗脫)在通過量檢測期間結(jié)合至膜預(yù)濾器的蛋白質(zhì)物質(zhì)并且通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和分子排阻色譜(SEC)進(jìn)行分析。研究了兩種洗脫條件用IM NaCl溶液(顯示于圖4中)和去離子水(顯示于圖5中)洗脫。從SDS-PAGE 數(shù)據(jù)可以看出，在圖5的去離子水中未觀察到蛋白質(zhì)洗脫，而在圖4的IM鹽洗出液中存在強的抗體和聚集體條帶。如圖6所示用SEC定量洗脫蛋白質(zhì)的分子量。盡管未在水洗脫樣品中檢測到蛋白質(zhì)，但是在鹽洗脫物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量的高分子量(HMW)種類，示于圖6中。進(jìn)料溶液中HMW種類的量低于檢測水平，但是從預(yù)濾器膜洗脫了大量的(23%)HMW種類，表明聚集體的優(yōu)先結(jié)合，同樣示于圖6中。這進(jìn)一步驗證了聚集體至膜表面的離子結(jié)合是預(yù)濾器運行的主要機制這一假設(shè)。實施例實施例1制備包含4.5重量％ 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸鈉鹽(AMPS-Na)和0. 9 % N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的水溶液。將具有0.22um孔徑級別的親水性聚醚砜膜(可以 Millipore Express SHF的形式商購獲得)切割成14cm乘14cm的方塊并且在該溶液中浸漬30秒以確保完全潤濕。吸掉多余的溶液并且在惰性環(huán)境下將該膜暴露于2M拉德的電子束輻射。接著用去離子水清洗膜并且在空氣中干燥。將三層該膜密封在通氣的聚丙烯裝置內(nèi)，膜過濾面積為3. 1cm2。將支持物與包含兩層VireS0lve Pr0細(xì)小病毒去除膜的相似裝置串聯(lián)。首先用醋酸鹽緩沖液檢測該裝置組合的滲透性，然后用如上文所述制備的包含聚集體的多克隆抗體溶液檢測通過量。表1示出了該濾器組合的組合通過量。
實施例2遵循實施例1列出的步驟，但是用4. 0重量％ 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸 (AMPS)代替 AMPS-Na。實施例3制備包含4. 5重量％ 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸鈉鹽(AMPS-Na)和0. 9% N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的水溶液。將具有0. 22um孔徑級別的疏水性聚醚砜膜(Millipore Express SHF的未親水化前體)切割成14cm乘14cm的方塊并且在異丙醇中浸漬1分鐘， 轉(zhuǎn)移至去離子水中5分鐘，然后在單體溶液中浸漬3分鐘。去掉多余的溶液并且在惰性環(huán)境下將該膜暴露于2M拉德的電子束輻射。接著用去離子水清洗膜并且在空氣中干燥。遵循實施例1中列出的檢測步驟。實施例4遵循實施例1中列出的步驟，使用可以商品名Micropes獲自Polypore Inc.，s unit Membrana GMBH, Wuppertal，Germany的具有0. 8um孔徑級別的親水性聚醚砜膜。實施例5制備包含4.5重量％ 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸鈉鹽(AMPS-Na)、0. 9 % N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和0.2% UV引發(fā)劑144-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙燒-1-酮(可以商品名 Irgacure 2959 獲自 Ciba Specialty Chemicals,Basel, Switzerland)的水溶液。將具有0. 65um孔徑級別的疏水性聚偏二氟乙烯膜切割成14cm乘 14cm的方塊并且在異丙醇中浸漬1分鐘，轉(zhuǎn)移至去離子水中5分鐘，然后在單體溶液內(nèi)浸漬 3分鐘。去掉多余的溶液并且在惰性環(huán)境下將該膜暴露于紫外線輻射。接著用去離子水清洗膜并且在空氣中干燥。遵循實施例1中列出的檢測步驟。實施例6制備包含4.5重量％ 2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸鈉鹽(AMPS-Na)、0. 9 % N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和0.2% UV引發(fā)劑144-(2-羥基乙氧基)苯基]-2-羥基-2-甲基-1-丙燒-1-酮(可以商品名 Irgacure 2959 獲自 Ciba Specialty Chemicals,Basel, Switzerland)的水溶液。將具有0. 65um孔徑級別的親水性超高分子量聚乙烯膜切割成 14cm乘14cm的方塊并且在該溶液中浸漬30秒以確保完全潤濕。去掉多余的溶液并且在惰性環(huán)境下將該膜暴露于紫外線輻射。接著用去離子水清洗膜并且在空氣中干燥。遵循實施例1中列出的檢測步驟。實施例7制備如實施例1所述的改性膜。制造包含1、2、3和6層該膜的模制聚丙烯裝置并且如實施例1所述進(jìn)行檢測。實施例8遵循實施例1的步驟，將AMPS-Na濃度從2 %變化至6 %。實施例9將在實施例1中制備的膜暴露于、輻射兩次，每次各30kGy，總劑量為60kGy。如實施例1所述在暴露前和暴露后檢測聚集體去除效率。實施例10在25psi恒壓下用0. 5N氫氧化鈉溶液將實施例1中制備的膜沖洗1小時，然后于30psi下用去離子水沖洗60min，并且如實施例1所述檢測聚集體去除效率。比較例1除了不使用預(yù)過濾步驟以外，如實施例1中所述進(jìn)行通過量檢測。將來自 Millipore Corporation的兩層Viresolve Pro細(xì)小病毒去除膜密封在通氣的聚丙烯裝置內(nèi)。首先用醋酸鹽緩沖液檢測該裝置組合的滲透性，然后用如上文所述制備的包含聚集體的多克隆抗體溶液檢測通過量。表1示出了該濾器組合的組合通過量。比較例2使用來自Millipore Corporation的Viresolve. 預(yù)濾器從蛋白質(zhì)流除去蛋白質(zhì)聚集體。將具有5cm2過濾面積的商購裝置與包含VireS0lve ftx)的裝置串聯(lián)并且如上文所述進(jìn)行檢測。表權(quán)利要求
1.帶負(fù)電荷的過濾介質(zhì)，其包括用帶負(fù)電荷的聚合的交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基涂層涂覆的多孔基質(zhì)，所述涂層通過暴露于電子束并且在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下在所述基質(zhì)表面原位聚合，其中所述涂層由具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑形成。
2.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其中所述帶負(fù)電荷的懸垂基團是磺酸。
3.如權(quán)利要求1的介質(zhì)，其中所述涂層僅包含酰胺-酰胺交聯(lián)鍵。
4.如權(quán)利要求3所述的介質(zhì)，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
5.如權(quán)利要求4所述的介質(zhì)，其中所述涂層由反應(yīng)物水溶液形成，所述反應(yīng)物溶液包含以所述反應(yīng)物溶液的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽的重量計約5-約100重量％的N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
6.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其中所述多孔基質(zhì)包括選自以下組中的物質(zhì)取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亞胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化熱塑性聚合物、聚烯烴、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纖維素、纖維素衍生物、玻璃纖維、棉、陶瓷、金屬、無紡布以及它們的組合。
7.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其中所述多孔基質(zhì)包括微孔膜。
8.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其中所述多孔基質(zhì)包括一個或多個褶皺的微孔膜。
9.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其具有中空圓柱狀形式。
10.如權(quán)利要求1所述的介質(zhì)，其中在用帶負(fù)電荷的聚合的交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基涂層涂覆所述基質(zhì)前，用潤濕液洗滌所述多孔基質(zhì)以將所述基質(zhì)潤濕。
11.制備帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的過濾介質(zhì)的方法，其包括以下步驟a)提供具有內(nèi)表面和外表面的多孔基質(zhì)；b)提供反應(yīng)物溶液，所述反應(yīng)物溶液包含具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑；c)使所述多孔基質(zhì)與所述反應(yīng)物溶液接觸；d)在所述多孔基質(zhì)上由所述反應(yīng)物溶液形成帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層組合物；e)在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下，通過暴露于電子束使所述帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層組合物在所述多孔基質(zhì)上原位聚合；以及f)在所述多孔基質(zhì)上形成聚合的帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其在步驟(a)和(b)之間還包括用潤濕液洗滌所述多孔基質(zhì)以將所述基質(zhì)潤濕的步驟(al)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其在步驟(al)和(b)之間還包括用第二種潤濕液洗滌所述潤濕的多孔基質(zhì)以置換所述第一種潤濕液從而用所述第二種液體潤濕所述多孔基質(zhì)的另外的洗滌步驟。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(c)包括將所述多孔基質(zhì)浸漬于反應(yīng)物溶液浴中，將所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面飽和，從所述反應(yīng)物溶液浴取出經(jīng)涂覆的基質(zhì)，并且從所述經(jīng)涂覆的基質(zhì)除去任何多余的反應(yīng)物溶液。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中暴露于所述電子束提供約0.1至約6M拉德的輻射劑量，持續(xù)至少約0.1秒。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述聚合的交聯(lián)的涂層僅包含酰胺-酰胺交聯(lián)鍵。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述帶負(fù)電荷的懸垂基團為磺酸。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述涂層由反應(yīng)物水溶液形成，所述反應(yīng)物水溶液包含以所述反應(yīng)物溶液的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽的重量計約5-約100重量％的N，N’_亞甲基雙丙烯酰胺。
20.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述多孔基質(zhì)包括選自以下組中的物質(zhì)取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亞胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化熱塑性聚合物、聚烯烴、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纖維素、纖維素衍生物、玻璃纖維、棉、陶瓷、金屬、無紡布以及它們的組合。
21.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述多孔基質(zhì)包括微孔膜。
22.帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的多孔膜，其包括具有內(nèi)表面和外表面的多孔膜，以及帶負(fù)電荷的聚合的交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基涂層，所述涂層僅具有酰胺-酰胺交聯(lián)鍵且在所述多孔膜的內(nèi)表面和外表面上原位聚合，其中所述涂層由具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑形成。
23.如權(quán)利要求22所述的膜，其中所述帶負(fù)電荷的懸垂基團包括磺酸。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
25.如權(quán)利要求M所述的膜，其中所述涂層由反應(yīng)物水溶液形成，所述反應(yīng)物水溶液包含以所述反應(yīng)物水溶液的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸及其鹽和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽的重量計約5-約100重量％的N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
26.如權(quán)利要求22所述的膜，其中所述多孔膜包括選自以下組中的物質(zhì)取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亞胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化熱塑性聚合物、聚烯烴、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纖維素、纖維素衍生物、玻璃纖維、 棉、陶瓷、金屬、無紡布以及它們的組合。
27.如權(quán)利要求22所述的膜，其中所述涂層是通過將所述涂層暴露于電子束進(jìn)行聚合，所述電子束提供約0. 1至約6M拉德的輻射劑量，持續(xù)至少約0. 1秒。
28.如權(quán)利要求27所述的膜，其中所述涂層在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下聚合。
29.如權(quán)利要求22所述的膜，其中所述涂層是使用化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑進(jìn)行聚合。
30.制備帶負(fù)電荷的聚合的交聯(lián)的經(jīng)涂覆的多孔介質(zhì)的方法，其包括以下步驟a)提供具有內(nèi)表面和外表面的多孔基質(zhì)；b)提供反應(yīng)物溶液，所述反應(yīng)物溶液包含具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑；c)使所述多孔基質(zhì)與所述反應(yīng)物溶液接觸；d)在所述多孔基質(zhì)上由所述反應(yīng)物溶液形成僅具有酰胺-酰胺交聯(lián)鍵的帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層組合物；e)使所述帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層組合物在多孔基質(zhì)上原位聚合；以及f)在所述多孔基質(zhì)上形成聚合的帶負(fù)電荷的交聯(lián)的涂層。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其在步驟(a)和(b)之間還包括用潤濕液洗滌所述多孔基質(zhì)以將所述基質(zhì)潤濕的步驟(al)。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其在步驟(al)和(b)之間還包括用第二種潤濕液洗滌所述潤濕的多孔基質(zhì)以置換所述第一種潤濕液從而用所述第二種液體潤濕所述多孔基質(zhì)的另外的洗滌步驟。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中步驟(c)包括將所述多孔基質(zhì)浸漬于反應(yīng)物溶液浴中，將所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面飽和，從所述反應(yīng)物溶液浴取出所述經(jīng)涂覆的基質(zhì)并且從所述經(jīng)涂覆的基質(zhì)除去任何多余的反應(yīng)物溶液。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中通過將所述涂層暴露于電子束使所述涂層聚合， 所述電子束提供約0. 1至約6M拉德的輻射劑量，持續(xù)至少約0. 1秒。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中使用化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑使所述涂層聚合。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述涂層由反應(yīng)物水溶液形成，所述反應(yīng)物水溶液包含以所述反應(yīng)物水溶液的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽的重量計約5-約100重量％的N， N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
38.流體處理裝置，其包括殼體，其包括至少一個入口、至少一個出口并且限定所述入口和出口之間的流體流徑， 置于所述入口和出口之間并且跨越所述流體流徑的是若干個帶負(fù)電荷的微孔膜，各膜包括微孔基質(zhì)和帶負(fù)電荷的聚合的交聯(lián)的涂層，所述涂層僅具有酰胺-酰胺交聯(lián)鍵并且在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下通過暴露于電子束而在所述微孔基質(zhì)的表面原位聚合，其中所述涂層由反應(yīng)物溶液形成，所述反應(yīng)物溶液包含具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑。
39.如權(quán)利要求38所述的裝置，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
40.從包含蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的蛋白質(zhì)溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的方法，其包括以下步驟(a)將包含蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的蛋白質(zhì)溶液濾過帶負(fù)電荷的微孔介質(zhì)，其中所述介質(zhì)包括被帶負(fù)電荷的交聯(lián)的聚合的涂層涂覆的微孔基質(zhì)，所述涂層由反應(yīng)物溶液形成，所述反應(yīng)物溶液包含具有一個或多個帶負(fù)電荷的懸垂基團的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑，在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下并且通過暴露于電子束在所述微孔基質(zhì)的表面原位聚合；b)回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白質(zhì)溶液；c)將回收的蛋白質(zhì)溶液通過一個或多個超濾膜過濾；d)以至少3LRV的水平將病毒顆粒截留在所述一個或多個超濾膜中；以及e)回收基本不含病毒顆粒的蛋白質(zhì)溶液。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其還包括沖洗被截留在在所述一個或多個超濾膜上的蛋白質(zhì)的步驟。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中步驟(a)過濾包括常規(guī)過濾模式。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述聚合的交聯(lián)的涂層僅包含酰胺-酰胺交聯(lián)鍵。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基單體包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，并且所述丙烯酰氨基交聯(lián)劑包括N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述聚合的交聯(lián)的涂層包含以所述反應(yīng)物溶液的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，以及以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽的重量計約1-約20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽約1-約20重量％的N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺。
46.如權(quán)利要求40所述的方法，其中步驟(c)過濾包括常規(guī)過濾模式或切向流過濾模式。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔過濾介質(zhì)，其包括多孔基質(zhì)和位于所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上的聚合的交聯(lián)的聚合物涂層。所述涂層可以由反應(yīng)物溶液形成，所述反應(yīng)物溶液包含帶負(fù)電荷的可交聯(lián)的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑，在所述基質(zhì)上原位聚合。所述帶負(fù)電荷的微孔過濾介質(zhì)適合用作從蛋白質(zhì)溶液選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體的預(yù)過濾膜。
文檔編號B01D71/56GK102333583SQ201080009642
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者K·勞蒂奧, M·科茲洛夫 申請人:米利波爾公司