專利名稱：：具有改進混合的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于改進對液體環(huán)境中分子相互作用的表征的方法和系統(tǒng)。更具體地講，本發(fā)明涉及用于在SPR測定法前進行溶液的管道混合(inlinemixing)的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：表面等離振子共振(SPR)是用于研究底物和靶標之間的親和力的強有力的技術(shù)。應(yīng)用SPR原理的儀器測定緊接傳感器芯片的介質(zhì)的折射率的變化，其是由表面上的質(zhì)量濃度改變所引起的。SPR廣泛用于檢測抗體和抗原(例如蛋白質(zhì))之間的相互作用。通常，采用胺偶聯(lián)方法將針對待分析的蛋白質(zhì)的抗體固定在傳感器芯片上。使用EDC/NHS混合物，先將傳感器芯片激活，所述混合物是不穩(wěn)定的，因此必須在混合后相對快速地通過傳感器芯片。目前，在缺乏先進的液體處理的儀器中，由操作人員在臨測定前進行EDC和NHS的混合。這由于時間原因而引起活性降低。SPR的另一種應(yīng)用是免疫原性測定法。藥物治療有時引起對藥物的抗體應(yīng)答，這導(dǎo)致藥效受到妨礙。因此，分析患者血清樣品中這些抗體的出現(xiàn)很重要。在分析前，樣品因此不得不被酸化以保持藥物和抗體相分離。然后使樣品通過具有固定化藥物的傳感器芯片。然而，酸性樣品首先不得不被中和以便能夠與傳感器表面結(jié)合。在中和后，樣品必須相對快地通過傳感器表面，因為抗體開始與溶液中的藥物重新結(jié)合。目前，中和步驟通常由操作人員在臨測定前進行。這導(dǎo)致時間推移，造成測定結(jié)果的準確性降低。SPR的又一種應(yīng)用是某些樣品的濃度分析。基于抗體的藥物以非常高的濃度(mg/ml范圍)純化和制備，而且在可進行SPR測定法前，必須以非常高的程度稀釋這些制備物。一種典型的應(yīng)用是分析來自層析法的樣品流分，其中PH或離子強度可能是極端的，同時濃度對于正常測定可能太高。因此，存在對以下方面的普遍需求增加測定某些樣品的動態(tài)范圍，以及在一些應(yīng)用中亦控制樣品基質(zhì)的PH和離子強度。SPR技術(shù)和其它生物分析儀器通常利用在層流條件下工作的微流體系統(tǒng)。在層流中，混合一般是個問題，因為它需要復(fù)雜的流動通道特征或有效的混合元件。因此，存在對快速和容易進行的混合方法的需要，所述方法也極適于流動池應(yīng)用。發(fā)明簡沭本發(fā)明涉及用于使SPR測定法的混合得到改進的系統(tǒng)和方法。因此，在第一個方面，本發(fā)明是用于表征在液體環(huán)境中在溶液中的至少一種物質(zhì)(species)和固定在流動池表面的靶標之間的相互作用的方法。所述方法包括以下步驟(a)激活流動池的表面，并將靶標固定在其上；(b)提供在液體流中的至少一種物質(zhì)；(c)使包含至少一種物質(zhì)的液體流通過含有固定化靶標的流動池表面；和(d)采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)檢測至少一種物質(zhì)和靶標之間的相互作用結(jié)果。所述方法的改進包括在步驟(a)或(b)的至少一個中，將至少兩種液體溶液進行管道混合以產(chǎn)生混合溶液，然后使混合溶液通過流動池的表面。在一個實施方案中，管道混合包括以下步驟(I)將多室流動池置于一體化射流器(integratedfluidiccartridge,IFC)中；(2)將多路針和管模塊(multiplexneedleandtubeblock)與一體化射流器連接,其中在各針和連接管間形成管道，即IFC和流動池室的通道；(3)采用泵送裝置將第一液體溶液吸入針中；(4)在不引入氣泡的情況下，吸入第二液體溶液；和(5)任選重復(fù)步驟(3)和(4);而第一液體溶液和第二液體溶液的混合在所述管道中發(fā)生，然后混合溶液到達流動池表面。優(yōu)選所述步驟被計算機程序控制。在第二個方面，本發(fā)明提供用于分析高度濃縮的樣品物質(zhì)的方法，所述方法包括對樣品進行SPR測定法以表征物質(zhì)和固定在流動池表面的靶標間的相互作用。該方法包括以下步驟(a)激活流動池的表面，并將靶標固定在其上；(b)提供在液體流中的合適濃度的物質(zhì)；(C)使包含該物質(zhì)的液體流通過含有固定化靶標的流動池表面；和(d)采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)檢測該物質(zhì)和靶標間的相互作用結(jié)果。所述方法的改進包括在計算機控制下使高度濃縮的樣品物質(zhì)與緩沖液進行管道混合，產(chǎn)生用于步驟(b)的混合溶液。管道混合包括以下步驟(I)將多室流動池置于一體化射流器(IFC)中；(2)將多路針和管模塊與一體化射流器連接，其中將多路針中的針和管模塊間隔開來，使得各針可達到標準多孔板的單獨試劑孔(例如96孔板的孔)中，而且其中在各針和連接管間形成管道，即所述IFC和流動池室的通道；(3)使用泵送裝置將緩沖溶液吸入針中；(4)在不引入氣泡的情況下，吸入所需量的高度濃縮樣品；和(5)在不引入氣泡的情況下，吸入第二體積的緩沖溶液。高度濃縮樣品的稀釋在管道中發(fā)生，然后樣品到達流動池的表面。附圖簡沭圖I是用于本發(fā)明一個實施方案的管道混合的注入和流動系統(tǒng)的示意圖。圖2說明用于本發(fā)明一個實施方案的方法的注入和流動系統(tǒng)的變化形式。自動進樣器臺(auto-samplertable)表示為流動系統(tǒng)的部件。圖3是短程注入(shortinjection)原理的示意圖。在實踐中，在到達傳感器芯片之前將兩種試劑混合。圖4顯示各自使用2μ節(jié)段(segment)分別以(A)10μ/分鐘和(B)60μ/分鐘進行的運行緩沖液(HBSEP+)和水的管道混合的傳感圖。圖5分別顯示某些節(jié)段體積和流速的平均混合水平的偏差。圖6顯示以不同流速和節(jié)段體積采用管道混合的混合能力。圖7顯示用于采用胺偶聯(lián)方法固定人血清白蛋白的EDC和NHS的管道混合的結(jié)果。圖7Α:在包括EDC和NHS的管道混合的8個平行流動池的4個中得到的結(jié)果。圖7Β包括EDC和NHS的手工混合的其它4個平行流動池中得到的結(jié)果。圖8是針對人血清白蛋白的固定化水平對圖7描述的EDC和NHS的手工混合和管道混合之間的比較。圖9按照一個實例說明短程注入響應(yīng)與樣品體積極為相關(guān)。圖10是按照一個實例的A蛋白固定的傳感器芯片上用顯示本體響應(yīng)(bulkresponse)的biatest溶液的兩次注入和用Xolair抗體的兩次注入的重疊曲線圖。圖11顯示一式兩份的Xolair抗體結(jié)合的平均響應(yīng)㈧和標準偏差⑶。所顯示的是以1-1000μδ/πι1的不同樣品濃度、混合流速為10-60μ/分鐘、自25μ/分鐘到100μ/分鐘的接觸時間流速和1-4μ的注入體積進行的短程注入的Xolair抗體的結(jié)合水平。1000M-g/mlο圖12顯示不同濃度的Xolair抗體通過短程注入的結(jié)合水平，但在最低濃度下精確度較低。圖13描繪了以不同濃度和樣品體積短程注入Xolair抗體后響應(yīng)的精確度。由2次測量計算各主題(staple)。圖14是顯示O.25μ樣品注入(提供至少40倍稀釋)的超短程注入提供線性響應(yīng)的曲線圖(圖14)。虛線表示99%置信區(qū)間的極限。圖15A和B顯示泵波動試驗的結(jié)果。用所采用的泵鑒定±4.5μ/分鐘的流速變化，其中10μι/分鐘和20μι/分鐘兩者的最低流速與最高流速之間的頻率約ιμι。圖16顯示組合管道混合原理的示意圖。(A)節(jié)段的吸入，(B)將樣品分配入混合孔，(C)從混合孔吸入樣品和注入混合樣品。圖17顯示緩沖液和15%糖各自的組合管道混合的傳感圖。定義對于本申請的目的，“物質(zhì)”是任何實體，例如分子、化合物、材料、抗體、抗原、細胞、細胞片段或可在液體環(huán)境中提供的任何其它部分。為了可被檢出，其應(yīng)優(yōu)選能夠與另一種物質(zhì)(或靶標)有某種相互作用，相互作用的結(jié)果可通過某種方法檢測出。然而，當(dāng)然的是，在某些情況下，分析物也許不與另一種目標物質(zhì)相互作用，因此測不出確切的相互作用結(jié)果，但是這種結(jié)果的缺乏也可被檢測出，因此這種類型的無相互作用物質(zhì)也包括在物質(zhì)的定義內(nèi)。發(fā)明詳沭本發(fā)明的方法可根據(jù)標記的使用與各種檢測系統(tǒng)一起使用，或者可優(yōu)選為無標記的。優(yōu)選檢測用傳感器例如生物傳感器進行，在這種情況下，固相支持體表面是(生物)傳感器的傳感表面。生物傳感器廣義上定義為使用與固態(tài)物理化學(xué)轉(zhuǎn)換器或與同轉(zhuǎn)換器結(jié)合的移動載體珠粒/顆粒直接結(jié)合的分子識別組分(例如具有固定化抗體的層)的裝置。雖然這種傳感器通常根據(jù)無標記技術(shù)檢測固定層的質(zhì)量、折射率或厚度的變化，但是也有依賴某種標記的生物傳感器。用于本發(fā)明目的的典型傳感器包括但不限于質(zhì)量檢測方法，例如光學(xué)方法和壓電或聲波方法，包括例如表面聲波(SAW)和石英晶體微量天平(QCM)方法。代表性的光學(xué)檢測方法包括檢測質(zhì)量表面濃度的方法，例如反射-光學(xué)方法，包括外部和內(nèi)部反射方法兩種，其可以是角度、波長、偏振或相解析的，例如隱失波橢圓光度法(evanescentwaveellipsometry)和隱失波光譜法(evanescentwavespectroscopy,EWS或內(nèi)反身寸光譜法(InternalReflectionSpectroscopy)),這兩種可包括通過表面等離振子共振(SPR)、布儒斯特角折射法(Brewsteranglerefractometry)、臨界角折射法、受抑全反射(FTR)、散射全內(nèi)反射(STIR)(其可包括散射增強標記)、光學(xué)波導(dǎo)傳感器、外反射成像、基于隱失波的成像例如臨界角解析成像、布儒斯特角解析成像、SPR-角解析成像等的瞬逝場增強。此外，可提及光度測定方法和成像/顯微鏡方法“本身“或與基于例如表面增強拉曼光譜法(SERS)、表面增強共振拉曼光譜法(SERRS)、隱失波熒光(TIRF)和磷光的反射方法的組合，以及波導(dǎo)干擾儀、波導(dǎo)漏出型光譜法(waveguideleakingmodespectroscopy)、反射干擾光譜法(RIfS)、傳輸干擾測量法、全息光譜和原子力顯微術(shù)(AFR)?，F(xiàn)今，基于SPR和其它檢測技術(shù)的生物傳感器系統(tǒng)是市售可獲得的。示例性的這種SPR-生物傳感器包括上述BIAC0RE儀器。BIAC0RE儀器技術(shù)方面和SPR現(xiàn)象的詳細論述可參見美國專利號5，313，264。例如美國專利號5，242，828和5，436，161給出了生物傳感器傳感表面基質(zhì)涂層材料的更詳細的信息。另外，與BIACORE儀器聯(lián)用的生物傳感器芯片的技術(shù)方面的詳細論述可參見美國專利號5，492，840。上述美國專利的全部公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在主要利用SPR的實例中對本發(fā)明進行了說明，這不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。首先將給出用于Biacore系統(tǒng)的SPR技術(shù)的概述。在SPR中，測量了緊接傳感器芯片的介質(zhì)的折射率變化，其是由表面上的質(zhì)量濃度改變引起的。信號以響應(yīng)單位RU衡量，IRU相當(dāng)于大約Ipg/mm2表面濃度，在傳感圖中圖示為時間的函數(shù)。用于本申請目的的術(shù)語中，與表面連接的分子稱為靶標，而待分析的化合物是溶液中的分子(物質(zhì))。將含有化合物的溶液注入通常用羧甲基-葡聚糖基質(zhì)包覆的表面，即傳感器芯片，并通過連續(xù)流轉(zhuǎn)運。該過程由自動化泵和樣品機器人(samplerobotics)的系統(tǒng)驅(qū)動。在稱為固定化的過程中，靶標與傳感器芯片基質(zhì)共價結(jié)合。最常應(yīng)用的固定化技術(shù)是胺偶聯(lián)，其中反應(yīng)性酯通過羧甲基的修飾而被引入表面基質(zhì)。這些酯然后與靶標上的胺和其它親核基團自發(fā)反應(yīng)形成共價鍵。共價偶聯(lián)經(jīng)受得住斷裂靶標和化合物之間的化學(xué)鍵的條件(一種稱為再生的過程)。因此同一表面可使用若干次。在注入期間，化合物分子被連續(xù)轉(zhuǎn)運至表面，并允許與靶標分子締合。當(dāng)注入停止時，緩沖液流洗掉解離的化合物。通過以下公式描述締合相(對于1:1結(jié)合)dR/dt=kf{Rma~R)-AdR(I)在平衡時得到響應(yīng)為Re=kaCRmJ{kaC+kA)(2)而在解離期間為dR/dt=_kfiQ(3)其中R表示在任何時間t的響應(yīng)，Req表示在平衡時的響應(yīng)，Rtl表示在注入結(jié)束時的響應(yīng),而Rniax表示表面的最大結(jié)合能力，以RU計。C是目的化合物的摩爾濃度。因此在SPR測定法中第一個挑戰(zhàn)與在表面準備用于胺偶聯(lián)期間EDC/NHS混合物缺乏穩(wěn)定性有關(guān)。EDC/NHS混合物不穩(wěn)定，因此混合后必須相對快地通過傳感器芯片。利用在中間沒有氣泡的脈沖串，通過使用本文所述管道混合來解決此。這使得有可能以非常簡單的方式使靶蛋白或靶抗體的固定自動化。因此，本發(fā)明的一個方面為可用于提供用于SPR測定法的至少兩種溶液的管道混合的方法和系統(tǒng)。參照附圖和可更好地理解本發(fā)明系統(tǒng)和方法的原理和操作。現(xiàn)參照附圖，圖I以示圖方式說明實施應(yīng)用本發(fā)明的管道混合原理的方法的系統(tǒng)的部件。它包括注入系統(tǒng)，為了本發(fā)明的目的，其包括多室流動池(即傳感器)、一體化射流器(IFC)、多路針和管模塊以及待表征的液體在其中流過的管道和泵。它還包括流動系統(tǒng)，其包括試劑模塊(reagentblock)(即自動進樣器臺)。未顯示用于檢測至少第一種化合物和另一種物質(zhì)(靶標)間的相互作用結(jié)果的傳感器裝置的其它部分。管道混合通過以下步驟實現(xiàn)(I)將流動池(例如多室流動池)置于一體化射流器(IFC)中；(2)使多路針和管模塊與IFC連接，以在各針和接觸管間形成管道，即IFC和流動池室的通道；(3)使用泵送裝置將第一液體溶液從試劑容器中吸入針中；(4)在不引入氣泡的情況下，從不同試劑容器中吸入第二液體溶液；(5)重復(fù)步驟(3)和(4);而第一液體溶液和第二液體溶液的混合發(fā)生在溶液到達流動池的表面之前的管道中(圖3)。優(yōu)選將多路針中的針和管模塊間隔開來，使得各針可達到標準多孔板的單獨試劑孔(例如96孔板的孔)中。任選多路針和管模塊包括8或12個被間隔開的針，使得各針可到達96孔板一行孔的各孔中。泵和/或閥用于使液流通過管道，并在控制單元的控制下從各試劑容器(孔)吸入液體。因此，系統(tǒng)在軟件控制下運行，軟件呈直接加載到連接系統(tǒng)的處理器內(nèi)存中的計算機程序產(chǎn)品形式。程序包括用于實施本發(fā)明方法的步驟的軟件編碼器(softwarecodemeans)。軟件還可呈存儲于計算機可用介質(zhì)中的計算機程序產(chǎn)品形式，包括引起裝置中的處理器控制本發(fā)明方法步驟的執(zhí)行的可讀程序。該系統(tǒng)的一個實例提供垂直移動的多路針和管模塊，而攜帶試劑板的流動系統(tǒng)的試劑模塊水平移動。該系統(tǒng)的略微變化見圖2。優(yōu)選針由不銹鋼制成。還優(yōu)選各個針的直徑為O.4mm。示例性的泵送裝置包括蠕動泵、注射泵或任何精確泵。可在大范圍的體積和流速內(nèi)實現(xiàn)本發(fā)明的管道混合方法。在各步驟中，盡管將介于約O.IμI-約10μI的溶液吸入針，但實現(xiàn)有效混合。優(yōu)選在各步驟中，將約O.25μI-約4μI的溶液吸入針中。還更優(yōu)選在各步驟中,將約O.5μI-約4μI的溶液吸入針中。樣品液體通過流動池的流速可為約10μI/分鐘-約100μI/分鐘、優(yōu)選約10μI/分鐘-約20μI/分鐘，更優(yōu)選約10μI/分鐘-約30μI/分鐘。在兩種或更多種溶液在到達流動池之前在管道中移動時，實現(xiàn)有效混合。在通過流送管轉(zhuǎn)運期間，通過控制節(jié)段大小和流速實現(xiàn)混合。由圖2可見，提供可以保持兩個或更多個試劑板(架)的自動進樣器臺，所述試劑板分別裝有不同的溶液，例如樣品和緩沖液。用于吸入溶液的針以及試劑板受計算機程序控制，使得針可按需序貫和重復(fù)吸入所需溶液。將針和管模塊與一體化射流器(IFC)(—種能夠向一個或多個流動池進行受控液體遞送的裝置)連接。各流動池具有傳感器表面，一種或多種合適的靶標被固定在其上。流量受精確泵控制，借此可單調(diào)控制實際的流速以提供所需流速，范圍為零流速至所需最大流速或其組合(圖I)。在這個方法中的第一步是將少量體積的第一溶液吸入針中，即將針浸入第一管，以及將適當(dāng)體積吸入針中。然后，將針移至第二管，并吸入合適體積的第二溶液。實際體積可取決于應(yīng)用和樣品種類，并可在大范圍內(nèi)(比如O.IμI和10μI之間)變化。樣品的吸入將導(dǎo)致樣品和緩沖液通過層流中的拋物線型水面線(parabolicflowprofile)混合,并在管道中分散。因此在一個實施方案中，該系統(tǒng)適用于對EDC(I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺HCl)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)進行管道混合用于傳感器表面準備?；旌显谝后w到達傳感器表面之前在管道中完成。如下面實施例中所示，這個過程僅花幾秒鐘(少于約1-2分鐘)，避免了混合物不穩(wěn)定的問題。因此提供用于準備表面用于胺偶聯(lián)的自動化過程。在另一個實施方案中，該系統(tǒng)和方法總的來說適于任何兩種或更多種液體溶液的管道混合。當(dāng)至少一種溶液含有至少一種化學(xué)不穩(wěn)定成分時，優(yōu)選該方法特別有用。因此，該方法的一種應(yīng)用涉及測定流體樣品中分析物的總濃度的方法，其中分析物至少部分可作為具有分析物結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物存在，通常作為免疫復(fù)合物存在。在這種情況下，首先使樣品經(jīng)歷使樣品中存在的任何復(fù)合物解離(通過降低分析物和分析物結(jié)合物質(zhì)之間的結(jié)合親和力)的條件(通常通過將解離劑(dissociatingagent)加入樣品中)，使得所有分析物呈游離形式。然后使樣品經(jīng)歷恢復(fù)結(jié)合親和力的條件，并且基本上在分析物的任何實質(zhì)性重新復(fù)合發(fā)生之前，立即測定樣品中的游離分析物濃度，優(yōu)選通過其與分析物特異性配體結(jié)合來測定。樣品可以是含有或疑似含有至少部分呈復(fù)合物形式的目標分析物的任何樣品。然而，樣品通常是哺乳動物(優(yōu)選人)的血清或血漿樣品，復(fù)合物是免疫復(fù)合物(即抗原-抗體復(fù)合物)。分析物可以是例如因響應(yīng)藥物(例如蛋白質(zhì)藥物)而誘導(dǎo)的抗體，例如治療性抗體。本文所用術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白，其可以是天然的或者部分或完全合成產(chǎn)生的，還包括活性片段，包括Fab抗原結(jié)合片段、一價片段和二價片段。該術(shù)語還包括具有與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可來源于天然來源，或者是部分或完全合成產(chǎn)生的。示例性抗體是免疫球蛋白同種型和Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dAb和Fd片段?？赡苄枰怆x以允許測量分析物的其它分析物-復(fù)合物(通常為蛋白質(zhì)-復(fù)合物)的實例包括PSA(前列腺特異性抗原)，PSA是很大程度上呈復(fù)合物形式的蛋白質(zhì)，對其感興趣的是能夠測定復(fù)合物的比例。在血液中，約70-90%的PSA呈與α-I-抗胰凝乳蛋白酶的復(fù)合物，但是還已知PSA與例如C蛋白抑制劑、α-I-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白形成復(fù)合物。游離PCA與總PCA的比率可能是前列腺癌的有用標志物，但是目前沒有可用來檢測與α-2-巨球蛋白的復(fù)合物的抗體，PSA被復(fù)合物中的α-2-巨球蛋白完全封閉(Balk等(2003)J.Clin.Oncology,383-391)。據(jù)推測其它蛋白質(zhì)復(fù)合物可能也是這種情況?？梢圆捎酶鞣N試劑和條件完成含有分析物的復(fù)合物的解離。例如，免疫復(fù)合物可被酸性試劑或堿性試劑解離，所述酸性試劑或堿性試劑分別使復(fù)合物處于低或高PH條件下。然后可通過使酸化或堿化樣品置于大致中性PH中來實現(xiàn)分析物結(jié)合活性的恢復(fù)。其它試劑和條件包括例如離液序列高的鹽、高或低離子強度的有機鹽。本發(fā)明實施方案的一個基本特征是大致在例如通過中和酸化或堿化樣品對樣品進行處理以恢復(fù)結(jié)合能力(與配體以及與復(fù)合物質(zhì)的結(jié)合能力)后，立即能夠測量分析物濃度。所謂“大致立即”意指分析物的重新復(fù)合(尤其取決于所用的分析物、復(fù)合物質(zhì)和測定裝置)不應(yīng)發(fā)生至任何相當(dāng)可觀的程度的時間。另一方面，必須提供足夠時間以在進行測量前基本完成恢復(fù)分析物結(jié)合能力的樣品處理，例如中和(這尤其取決于所用試劑和測定裝置)。然而，找出各個特定測定系統(tǒng)用于測量的最佳時間在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。優(yōu)選當(dāng)對分析物濃度進行測量時，不超過約5%，更優(yōu)選小于約1%的分析物可呈復(fù)合物形式。還可通過亦在無復(fù)合物解離的情況下測定分析物濃度，來測定樣品中游離分析物與復(fù)合物結(jié)合的分析物的比例。優(yōu)選包括具有固定化分析物特異性配體的傳感器表面的多相測定系統(tǒng)(heterogeneousassaysystem)用來通過直接或間接檢測分析物(直接測定，包括夾心測定法或置換測定法)或可檢測的分析物類似物(競爭測定法)與表面結(jié)合的量，來測定分析物濃度。在分析物是抗體的情況下，固定化配體可以是抗原。另ー方面，當(dāng)分析物是例如PSA吋，固相支持體表面可具有例如抗PSA，還優(yōu)選具有α-I-抗胰凝乳蛋白酶、C蛋白抑制齊U、α-I-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白固定在其上?；诒景l(fā)明構(gòu)思的多相測定法還可用于所謂的配體垂釣(ligandfishing)。例如，假定感興趣的是了解體內(nèi)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的是哪些物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))。然后，可將特定蛋白質(zhì)固定在傳感器表面，在表面被處理以首先解離復(fù)合物，然后恢復(fù)相互作用物質(zhì)的結(jié)合親和力后，立即使含有特定蛋白質(zhì)的樣品(例如細胞提取物或血漿)與表面接觸。(在不如此處理樣品的情況下，如果全部或幾乎全部結(jié)合蛋白質(zhì)會早與樣品中的特定蛋白質(zhì)結(jié)合，則會無法達到或極少達到結(jié)合蛋白質(zhì)與表面結(jié)合)。然后，可通過例如質(zhì)譜法，鑒定與固定在表面上的特定蛋白質(zhì)結(jié)合的ー種或多種蛋白質(zhì)。如上所述，重要的是，基本上在處理樣品以恢復(fù)分析物的結(jié)合能力后立即使樣品與固相支持體表面或檢測區(qū)接觸。應(yīng)選擇檢測區(qū)與針之間的距離和流體流速，使得當(dāng)混合流體到達固相支持體區(qū)時，分析物的結(jié)合能力基本上恢復(fù)，例如酸化樣品基本上被堿性流體中和，但分析物的重新復(fù)合基本上未發(fā)生。在另ー個實施方案中，用于管道混合的系統(tǒng)和方法可用于高度濃縮樣品的濃度分祈。準確地講，將高濃度樣品按所需比率與緩沖液進行管道混合，對混合物進行SPR型測定法。該方法特別適于含有高鹽或低PH的樣品的分析。正如預(yù)期一祥，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)水平主要受樣品體積和接觸時間控制。樣品吸入和混合流速并非如此關(guān)鍵。受測樣品體積顯示與SPR響應(yīng)呈線性關(guān)系，相對精確度為5-10%CV?？刂葡♂屢蜃咏橛?-100倍之間、例如介于5-40倍之間是可行的。精確度受蠕動泵性能限制。通過使用更準確的泵例如活塞操作泵，可改進精確度達至少10倍。因此，在Biacore或相關(guān)SPR系統(tǒng)中，短程注入可用于樣品的同時自動化稀釋和濃度分析。在這個實施方案的情況下要注意的是，只以ー小節(jié)段吸取樣品，且樣品通過運行緩沖液自動稀釋。它具有以下兩個功能；I)使樣品濃度降低，和2)如有需要，可改變樣品基質(zhì)(溶液)成適于結(jié)合分析的溶液。ー種典型應(yīng)用是層析法的樣品流分分析，其中PH或離子強度可能是極端的，同時對于正常測定法濃度可能太高。在采用Biacore系統(tǒng)的SPR測定法中，結(jié)合率通常為5-10(RU/s)/(Pg/ml),結(jié)合能力通常為1000-5000RU。這意味著對于Img/ml濃度的樣品，該測定法在O.1-1s的樣品暴露下完全飽和。在Biacore系統(tǒng)中，流速在10-100μ/分鐘的范圍內(nèi)，使得在I秒鐘期間在傳感器表面轉(zhuǎn)運的實際體積在Iμι范圍內(nèi)。在現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中，樣品的接觸時間需要降低至十分之幾毫秒，而且需要處理亞微升體積，這在大多數(shù)射流系統(tǒng)中具有精確度是不可能的。本發(fā)明通過使用這樣的針來解決該問題，所述針可處理很小的體積，通過管道混合稀釋樣品，并在短時間內(nèi)暴露傳感器表面。這通過非常簡單卻完全自動化的裝置來實現(xiàn)。它只需要流送管、檢測流動池和泵。流送管需要比樣品體積大得多的內(nèi)體積。在亞微升樣品體積的情況下，內(nèi)體積優(yōu)選的體積大于Iμι。吸入樣品作為前后兩處接觸運行緩沖液的節(jié)段。通過層流中的拋物線型水面線和擴散，樣品節(jié)段被運行緩沖液稀釋。經(jīng)由在通過流送管轉(zhuǎn)運期間控制節(jié)段大小和流速，控制稀釋度，并通過控制樣品暴露于傳感器表面時的流速，控制接觸時間，從而控制結(jié)合水平。雖然這是利用Biacore系統(tǒng)予以描述的，但是該方法同樣適用于具有先進微射流器(IFC)優(yōu)勢的其它儀器。實施例本文提供的本實施例僅用于說明目的，不應(yīng)理解為對由隨附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的限制。實施例I.構(gòu)思驗證一水和運行緩沖液的混合在BiacoreQlOO儀器(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)中進行了水(試劑B)和運行緩沖液(試劑A;0.01mMHEPES、0.15MNaCl、3mMEDTA和O.05%v/v表面活性劑P20，pH7.4)的管道混合作為原理證明。下面是在BiacoreQlOO和類似儀器中產(chǎn)生混合的簡單的MDL代碼。這同樣適用于其它實施例。FLOWOWAIT%pumpwaitPOS%pos—reagentIFLOW%FL0WWAIT%segtimeFLOW0WAIT%pumpwaitPOS%pos_reagent2FLOW%FL0WWAIT%segtime混合區(qū)為15-18μ，其是從針尖到傳感器表面的死體積。實施例有分別7節(jié)段的試劑A和試劑B。當(dāng)自動進樣器自A移動至B吋，樣品泵停止，這個停止時間為約2-3秒鐘。然后對于7.5-9次泵停止，以10μ/分鐘的混合時間為I.5-1.8分鐘加約24-27秒鐘，以60μ/分鐘的混合時間為O.25-0.3分鐘加約24-27秒鐘。當(dāng)然較快的自動進樣器可將該速度加得更快。圖4顯示結(jié)果。分別以(A)10μ/分鐘和(B)60μ/分鐘，各自使用2μ節(jié)段對運行緩沖液(HBSEP+)、試劑A和水、試劑B進行混合。在不同流速和節(jié)段大小下的混合表明以從10μ/分鐘至60μι/分鐘的流速和多達2μ節(jié)段的精確度良好。正如預(yù)期一祥，低流速下的較大節(jié)段混合不佳(參見10μ/分鐘下的4μ1節(jié)段)，圖5。理想的是，預(yù)期混合能力為50%。所得結(jié)果非常接近50%，圖6。實施例2.人血清白蛋白的固定采用包括EDC和NHS的管道混合的胺偶聯(lián)方法，在8個平行流動池的4個中將人血清白蛋白固定，參見圖7A。在其余4個流動池中按相同運行，進行了EDC和NHS的手工混合，參見圖7B。對于HAS的固定，除混合以外的所有步驟都相同。對于管道混合，節(jié)段(21)具有EDC和NHS，按10W/分鐘各為2W，接觸時間為9分鐘。在10mMこ酸鹽緩沖液(pH5.0)中的HSA濃度為17呢/ml。運行緩沖液為HBSEP+0手工混合試劑和管道混合試劑之間的固定化水平幾乎相同，管道混合略有利，且流動池間的變化非常小，參見圖8。(傳感圖顯示SPR響應(yīng)記錄為時間的函數(shù)。該圖顯示采用胺偶聯(lián)方法的HSA固定的典型傳感圖。如圖上部所示，通過在緩沖液、樣品和試劑溶液間轉(zhuǎn)換，在整個實驗中在傳感器表面保持連續(xù)流。毎次注入開始和結(jié)束時響應(yīng)的瞬時變化，由自運行緩沖液引入至各注入溶液的小氣泡引起。固定化水平是傳感圖的起點和傳感圖的終點之間的差異)。實施例3.濃度分析I.材料與方法1.1.材料權(quán)利要求1.一種表征在液體環(huán)境中在溶液中的至少一種物質(zhì)和固定在流動池表面的靶標之間的相互作用的方法，所述方法包括以下步驟(a)激活所述流動池的表面，并將所述靶標固定在其上；(b)提供在液體流中的至少一種物質(zhì)；(c)將包含至少一種物質(zhì)的液體流通過含有固定化靶標的流動池的所述表面；和(d)采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)檢測至少一種物質(zhì)和靶標之間的相互作用結(jié)果;改進包括在步驟(a)或(b)的至少一個中，將至少兩種液體溶液進行管道混合以產(chǎn)生混合溶液，然后使其通過所述流動池的表面。2.權(quán)利要求I的方法，其中所述管道混合包括以下步驟(1)將多室流動池置于一體化射流器(IFC)中；(2)將多路針和管模塊與所述一體化射流器連接，其中所述多路針和管模塊中的針被間隔開來，使得各針可達到標準多孔板的單獨試劑孔例如96孔板的孔中，而且其中在各個所述針和連接管間形成管道，即所述IFC和流動池室的通道；(3)使用泵送裝置將第一液體溶液從試劑容器中吸入針中；(4)在不引入氣泡的情況下，從不同試劑容器中吸入第二液體溶液；和(5)任選重復(fù)步驟(3)和(4);而在混合溶液到達所述流動池的表面之前發(fā)生第一液體溶液和第二液體溶液的混合。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟被計算機程序控制，并且多路針和管模塊垂直移動，而攜帶所述試劑容器的試劑模塊水平移動。4.權(quán)利要求I的方法，其中所述混合溶液含有至少一種化學(xué)不穩(wěn)定成分。5.權(quán)利要求I的方法，其中管道混合用于步驟(a)中以將用于抗體與流動池表面的胺偶聯(lián)的EDC和NHS混合。6.權(quán)利要求I的方法，其中在步驟(b)期間，對含有酸化抗體的溶液和高pH溶液進行的管道混合使抗體中和，然后使所述抗體與流動池表面上的所述靶標進行結(jié)合相互作用。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述多路針和管模塊含有間隔開來的8或12個針，使得各針可到達96孔板一行孔的獨立孔中。8.權(quán)利要求2的方法，其中所述泵送裝置是蠕動泵或注射泵。9.權(quán)利要求2的方法，其中每個吸入步驟吸取約O.IμI-約10μI的溶液。10.權(quán)利要求2的方法，其中每個吸入步驟吸取約O.25μI-約4μI的溶液。11.權(quán)利要求2的方法，其中每個吸入步驟吸取約O.5μI-約4μI的溶液。12.權(quán)利要求2的方法，其中所述液體通過流動池的流速為約10μI/分鐘-約100V-I/分鐘。13.權(quán)利要求2的方法，其中所述液體通過流動池的流速為約10μI/分鐘-約60V-I/分鐘。14.權(quán)利要求2的方法，其中所述液體通過流動池的流速為約10μI/分鐘-約30V-I/分鐘。15.一種用于分析高度濃縮的樣品物質(zhì)的方法，所述方法包括對樣品進行SPR測定法以表征所述物質(zhì)和固定在流動池表面的靶標之間的相互作用，所述方法包括以下步驟(a)激活所述流動池的表面，并將所述靶標固定在其上；(b)提供在液體流中的合適濃度的所述物質(zhì)；(c)使包含所述物質(zhì)的液體流通過含有固定化靶標的流動池的所述表面；和(d)采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)檢測所述物質(zhì)和靶標間的相互作用結(jié)果；改進包括在計算機控制下進行管道混合所述高度濃縮的樣品物質(zhì)與緩沖液以在步驟(b)之前產(chǎn)生混合溶液，所述管道混合包括以下步驟(1)將多室流動池置于一體化射流器(IFC)中；(2)將多路針和管模塊與所述一體化射流器連接，其中所述多路針和管模塊中的針被間隔開來，使得各針可達到標準多孔板的單獨試劑孔例如96孔板的孔中，而且其中在各個所述針和連接管間形成管道，即所述IFC和流動池室的通道；(3)使用泵送裝置將緩沖溶液吸入針中；(4)在不引入氣泡的情況下，吸入所需量的高度濃縮樣品；和(5)在不引入氣泡的情況下，吸入第二體積的所述緩沖溶液；其中高度濃縮的樣品的稀釋在樣品到達所述流動池的表面之前在所述管道中發(fā)生。16.權(quán)利要求15的方法，其中將所述樣品稀釋5-100倍。17.權(quán)利要求15的方法，其中將所述樣品稀釋10-40倍。18.權(quán)利要求2的方法，其在步驟(5)之后還包括將所述液體溶液自所述管道分配到混合容器中，并將樣品自所述混合容器中吸回。全文摘要本發(fā)明是用于表征在液體環(huán)境中在溶液中的至少一種物質(zhì)和固定在流動池表面的靶標之間的相互作用的方法。所述方法包括以下步驟(a)激活流動池的表面，并將靶標固定在其上；(b)提供在液體流中的至少一種物質(zhì)；(c)使包含至少一種物質(zhì)的液體流通過含有固定化靶標的流動池表面；和(d)采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)檢測至少一種物質(zhì)和靶標之間的相互作用結(jié)果。所述方法的改進包括在步驟(a)或(b)的至少一個中，將至少兩種液體溶液進行管道混合以產(chǎn)生混合溶液，然后使其通過流動池的表面。文檔編號B01F5/04GK102656464SQ201080058750公開日2012年9月5日申請日期2010年12月21日優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日發(fā)明者延森O.申請人:通用電氣健康護理生物科學(xué)股份公司