專利名稱：用于色譜介質(zhì)的容器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)柱色譜法分離化合物。具體地，本發(fā)明涉及用于色譜介質(zhì)的容器或袋和使用所述容器填充色譜柱或制備色譜介質(zhì)的固結(jié)的床的方法。
背景技術(shù)：
在液體色譜法中使用的柱通常包含封入多孔色譜介質(zhì)的填充床的管狀或圓柱形主體，通過(guò)該色譜介質(zhì)載體液體流動(dòng),其中通過(guò)在載體液體和多孔介質(zhì)的固相之間分配而發(fā)生分離。圓柱形柱通常稱為‘軸向’柱，色譜分離通常在沿著柱的長(zhǎng)度向下的垂直方向發(fā)生，而管狀柱通常稱為‘徑向’柱，隨著載體液體流動(dòng)至圓筒的中心，在徑向方向發(fā)生分離。在任何分離過(guò)程之前，床必須通過(guò)從待引入到柱中的粒狀介質(zhì)開(kāi)始制備。目的是高效率分離的常規(guī)柱使用床形成的過(guò)程，其稱為‘填充程序’。在高效率分離中，正確填充的 床是影響含有填充床的柱的性能的關(guān)鍵因素。通常，填充床通過(guò)漿料填充而制備，即，固結(jié)離散的顆?；蚶w維在液體中的懸浮液(稱為漿料)，將其泵送、倒入或抽吸入柱中。一旦已將預(yù)定體積的漿料遞送至柱中，需要將其進(jìn)一步固結(jié)和壓縮。在軸向柱中或在軸向色譜法中，可通過(guò)將可移動(dòng)的適配器(adapter)向下沿著柱的縱軸朝向柱的底部移動(dòng)來(lái)壓縮漿料，適配器通常以恒定的速度移動(dòng)。在該程序期間過(guò)量的液體在柱出口排出，而介質(zhì)顆粒借助過(guò)濾材料(所謂的‘床載體’或‘玻璃料(frit)’)被保留，過(guò)濾材料的孔太小而不能使介質(zhì)顆粒通過(guò)。一旦填充床已壓縮了最優(yōu)壓縮程度，則填充過(guò)程完成。在軸向和徑向柱兩者中使用的用于柱漿料填充的另一種方法為流動(dòng)填充方法，其中多孔結(jié)構(gòu)的壓縮主要通過(guò)在柱上施加高流速而實(shí)現(xiàn)，由此在出口床載體處開(kāi)始形成多孔結(jié)構(gòu)。在多孔結(jié)構(gòu)中的顆粒上所得到的曳力最終引起壓力下降和床的壓縮。壓縮的床最終通過(guò)將適配器放入就位而限制。目前，僅已知流動(dòng)填充方法用于填充徑向柱。隨后的色譜分離的效率強(qiáng)烈取決于1)在填充床的流體入口和出口處的液體分配和收集系統(tǒng)，2)介質(zhì)顆粒在填充床中特別的取向(也稱為填充幾何學(xué))，和3)填充床的壓縮。如果填充床的壓縮太低，則在該床上進(jìn)行的色譜分離遭受“拖尾”，并且通常這種不充分壓縮的床不穩(wěn)定。如果填充床的壓縮太高，則該床進(jìn)行的色譜分離遭受“前伸(leading) ”，并且這種過(guò)度壓縮的床可影響生產(chǎn)量和結(jié)合容量，并且，一般而言，得到高得多的操作壓力。如果壓縮最優(yōu)，則在使用期間形成的分離峰呈現(xiàn)小得多的前伸或拖尾，并且實(shí)質(zhì)上是對(duì)稱的。最優(yōu)壓縮程度對(duì)于實(shí)現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)的良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性也是關(guān)鍵的，因此通過(guò)多個(gè)過(guò)程周期確保最優(yōu)性能。對(duì)于每一種柱尺寸(寬度或直徑)、床高度和介質(zhì)類型，柱所需的最優(yōu)壓縮程度通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。用于軸向柱的備選的填充方法稱為“干填充”，其中使用多孔介質(zhì)的干顆粒填充柱，后來(lái)將液體引入柱中。這樣的優(yōu)點(diǎn)在于預(yù)填充的柱可干遞送至消費(fèi)者，而無(wú)需向填充液體中加入任何防腐劑，并且使在運(yùn)輸期間重量最小化。干填充通常用于目標(biāo)為分離小分子的二氧化娃介質(zhì)，例如由G Guiochon J Chromatogr A 704 (1995) 247-268所描述的，但是得到相當(dāng)差的柱效率。然而，對(duì)于可溶脹的色譜介質(zhì)，例如常用于分離生物分子的基于右旋糖酐或瓊脂糖的介質(zhì)，由于了解顆粒的溶脹可引起填充床的性能差，已避開(kāi)了干填充。對(duì)于適用于高效率色譜分離的填充床的制備的以上描述的背景，同樣適用于目標(biāo)為高效率地實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)的填充床或固定床，所述生物反應(yīng)例如酶轉(zhuǎn)化、細(xì)胞的處理或粘附于填充床的細(xì)胞的生長(zhǎng)和培育。上述柱和填充床也可用于穩(wěn)定物質(zhì)，特別是生物分子，例如蛋白、抗體和細(xì)胞。例如，這種穩(wěn)定可改進(jìn)和促進(jìn)分子的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。比起其它濃縮方法(例如過(guò)濾、沉淀或冷凍-干燥)可實(shí)現(xiàn)的，物質(zhì)(特別是生物分子)與色譜介質(zhì)的結(jié)合可保存物質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。 技術(shù)問(wèn)題
存在許多與制備和填充柱的現(xiàn)有方法相關(guān)的問(wèn)題。介質(zhì)通常在大的容器中載運(yùn)至操作者，并且在準(zhǔn)備填充程序時(shí)必須小心稱重和轉(zhuǎn)移至柱。由于許多介質(zhì)不使用并且必須儲(chǔ)存，它涉及經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員，這可能為耗時(shí)、浪費(fèi)和昂貴的過(guò)程。當(dāng)介質(zhì)用于制備需要批準(zhǔn)的產(chǎn)品(例如藥物和食品)時(shí)，還必須滿足規(guī)章要求。滅菌和清潔介質(zhì)和/或柱以降低微生物載荷可證明對(duì)于使用者來(lái)說(shuō)是困難的。此外，柱通常復(fù)雜并且具有大的‘占地面積(footprint) ’以進(jìn)行填充程序。另一個(gè)問(wèn)題在于，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的柱由于高成本、復(fù)雜性和低靈活性而不適于穩(wěn)定物質(zhì)，用于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)哪康?。因此，需要提供一種簡(jiǎn)單的和成本有效的裝置和方法，用于通過(guò)吸附于色譜介質(zhì)和在進(jìn)一步加工或使用之前解吸的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的穩(wěn)定。本發(fā)明的一個(gè)目的是減輕與填充柱和穩(wěn)定物質(zhì)用于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)默F(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的前述問(wèn)題。發(fā)明概述
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于色譜介質(zhì)的柔性袋，所述柔性袋包含與第一液體分配元件和第二液體分配元件連接的非多孔材料的外壁，由此限定用于其中的色譜介質(zhì)的隔間；所述第一液體分配元件與所述第二液體分配元件相對(duì)置；和介質(zhì)填充口 ；任選包含與所述外壁連接并且分別與第一和第二液體分配元件相鄰的第一和第二尾端件，兩個(gè)所述尾端件均包含開(kāi)口，用于接收載體液體的入口或出口 ；其中第一液體分配元件和/或第二液體分配元件與所述壁熔接(weld)或模塑。在一方面，袋具有管狀結(jié)構(gòu)并且另外包含內(nèi)壁，其中第一液體分配兀件與外壁熔接或模塑，而第二液體分配元件與所述內(nèi)壁熔接或模塑。優(yōu)選，袋用于徑向色譜法。在另一方面，袋具有圓柱形結(jié)構(gòu)并且包含與外壁連接并且分別與第一和第二分配元件相鄰的第一和第二尾端件，兩個(gè)所述尾端件均包含開(kāi)口，用于接收載體液體的入口或出口。在又一方面，第一和第二尾端件與外壁熔接或模塑。優(yōu)選，第一和第二尾端件由剛性或半剛性材料制成。合適的材料包括惰性金屬或塑料。在一方面，第一液體分配元件和第二液體分配元件選自過(guò)濾器、篩孔和網(wǎng)。優(yōu)選，分配元件為編織物、篩孔、過(guò)濾器和燒結(jié)物。在另一方面，第一液體分配元件和第一尾端件為集成單元，第二液體分配元件和第二尾端件為集成單元。集成單元可例如通過(guò)模塑或機(jī)械加工而形成。適宜地，第一尾端件部分是由聚丙烯制成的。
在又一方面，袋用于軸向色譜法。在一方面，袋另外包含第二隔間，其具有入口，用于液壓流體。在另一方面，壁或膜由塑料聚合材料制成，特別是用于熔接或模塑的材料?；诰垡蚁┑乃芰暇酆衔锾貏e合適。因此，合適的壁或膜包括，例如，American Renolit InfuflexBarrier 9101 (Solmed BF 9101 ；American Ronolit Crop,La Porte,IN,USA)^AmericanRenolit BF-1400 (Solmed BF-1400 Film ;American Renolit Corp, La Porte,IN,USA)>American Renolit 4301 (Solmed Granuflex, American Renolit Crop, La Porte, IN,USA)、Mitos Durapure (Mitos Technologies, Phoenixville, PA, USA)和 MilliporePureflex Process Container Film (MiIlipore Corp, Billerica, MA, USA)。在又一方面，袋另外包含圍繞所述壁的半剛性或剛性外殼，以在軸向和/或徑向方向提供剛性。
在一方面，袋另外含有濕或干的色譜介質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，濕或干的色譜介質(zhì)為無(wú)菌的。袋可通過(guò)使用輻射、高壓滅菌或化學(xué)消毒劑處理而被滅菌。Y輻射特別有效。較溫和的處理也可用于減少微生物載荷，或存在于介質(zhì)中的微生物(例如細(xì)菌和真菌)的總數(shù)。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種填充色譜柱的方法，所述方法包括以下步驟
a.將上文描述的袋插入色譜柱的室中；
b.關(guān)閉柱外殼；和
c.形成或壓縮色譜介質(zhì)的填充床或固結(jié)的床或流化床。固結(jié)的床在本文中定義為在不存在實(shí)質(zhì)的機(jī)械壓縮下，色譜介質(zhì)的床的多孔結(jié)構(gòu)。固結(jié)的床例如通過(guò)向填充色譜介質(zhì)的懸浮液的軸向色譜柱施加向下的流體流而形成。因此，在柱的出口(在過(guò)濾器處)形成多孔的固結(jié)的床，直至所有的色譜介質(zhì)已沉降。這種固結(jié)的床可用于實(shí)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)(例如蛋白、肽、抗體、核酸或其它生物學(xué)分子)的結(jié)合。固結(jié)的床也可用于結(jié)合細(xì)胞。頂部尾端件/過(guò)濾器可固定(間隙形成)或朝向或接近固結(jié)的床的表面移動(dòng)，以分別減少截留(hold up)體積和間隙。本發(fā)明的一方面提供一種用于固結(jié)的床的柔性容器，其中一個(gè)或多個(gè)柔性壁被剛性外殼機(jī)械支撐，用于當(dāng)向容器的內(nèi)部空間和固結(jié)的床施加流體壓力時(shí)提供剛性。本發(fā)明的另一方面提供一種含有色譜介質(zhì)的柔性容器，并且其中柔性容器及其內(nèi)含物可在使用化學(xué)品載荷于色譜介質(zhì)之后冷凍。本發(fā)明的另一方面提供一種填充有色譜介質(zhì)的柔性容器，所述色譜介質(zhì)可被冷凍、融化，并用于由色譜介質(zhì)形成固結(jié)的床，以施用涉及向所述固結(jié)的床施用液體的進(jìn)一步加工步驟。在一方面，袋含有干的色譜介質(zhì)，并且所述填充床的形成通過(guò)加入液體溶脹所述介質(zhì)，以得到液體的溶脹體積Vs為柱室的約105-120%。本文使用的術(shù)語(yǔ)“溶脹體積(Vs)”是指在液體中懸浮和平衡的顆粒的等分試樣的沉積體積?？扇缦聹y(cè)量沉積體積懸浮顆粒的等分試樣，平衡最多24小時(shí)，如果需要，再懸浮顆粒，讓顆粒沉積，在帶刻度的容器(例如量筒)中測(cè)量沉積體積。在另一方面，袋含有濕介質(zhì)，柱外殼為剛性的，并且填充床通過(guò)軸向壓縮袋而形成或壓縮。在又一方面，柱包含液壓室，并且填充床通過(guò)使用液壓流體填充所述室而形成或壓縮。液壓室可為柔性袋。在一方面，袋可包含第二隔間，并且填充床通過(guò)使用液壓流體填充所述第二隔間而形成或壓縮。任選地，柱包含可移動(dòng)的活塞或適配器，并且填充床通過(guò)軸向移動(dòng)所述活塞或適配器而形成或壓縮。在一方面，將含有濕介質(zhì)的袋放置覆蓋在柱室內(nèi)的剛性芯之上，并且填充床通過(guò) 徑向壓縮袋而形成或壓縮。優(yōu)選，填充床通過(guò)徑向壓縮柱外殼而形成或壓縮。在一方面，徑向壓縮柱外殼通過(guò)緊固在外殼的外部上的徑向帶而實(shí)現(xiàn)。在另一方面,濕介質(zhì)的體積壓縮為5_20%。優(yōu)選體積壓縮為7. 0_15%。在又一方面，所述方法另外包括使用輻射(例如Y輻射)使柱滅菌。類似的處理可用于減少微生物載荷。在一方面，形成色譜介質(zhì)的固結(jié)的床或流化床，所述方法另外包括以下步驟d)在所述固結(jié)的床或流化床上載荷化學(xué)品或細(xì)胞；和e)從所述色譜柱的所述室移除所述袋，用于儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，化學(xué)品選自蛋白、抗體、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。在另一方面，所述方法另外包括儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸袋的步驟。在_20°C至20°C的溫度下儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸袋。在其它方面，所述方法另外包括使袋返回色譜柱和從所述固結(jié)的床或流化床洗脫所述化學(xué)品或細(xì)胞的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的方面，化學(xué)品選自蛋白、抗體、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。在本發(fā)明的第三方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的第一方面的袋的用途，用于儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸在濕或干的色譜介質(zhì)上載荷的化學(xué)品或細(xì)胞。在一方面，在_20°C至20°C溫度下儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸袋。在本發(fā)明的第四方面，提供了包含如上文所述的柔性袋的色譜柱。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了如上文所述的色譜柱在分離或純化或加工化學(xué)品或細(xì)胞中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的方面，化學(xué)品選自蛋白、抗體、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。優(yōu)選。附圖
簡(jiǎn)述
圖Ia和Ib顯示本發(fā)明的熔接的袋(10)的一個(gè)實(shí)施方案的示意性截面圖，其具有可通過(guò)軸向壓縮而填充的半脊?fàn)钔鈿ぁD2a、b和c為含有本發(fā)明的袋的圓筒的示意性截面平面圖，所述袋可通過(guò)徑向壓縮而填充。圖3a、b和c為說(shuō)明含有本發(fā)明的袋的柱的組合部件的示意性圖示，其可通過(guò)徑向壓縮而填充。圖3d和e說(shuō)明組合部件如何裝配在一起和操作。圖4a、b和c顯示低溫儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。附圖詳述
圖Ia和Ib顯示放置在柱(20)中的本發(fā)明的熔接的袋(10)的一個(gè)實(shí)施方案的示意性截面圖。袋(10)由與非多孔材料的壁(12)熔接的第一(13)和第二(14)液體分配元件組成。分配元件(13，14)為起過(guò)濾器作用的床載體或玻璃料或網(wǎng)或燒結(jié)物，具有孔，該孔太小而不能允許色譜介質(zhì)通過(guò)，但是對(duì)于液體是多孔的。非多孔材料或膜由塑料聚合物制成，基于聚乙烯的那些特別適于熔接或模塑。例如,合適的膜包括American Renolit InfuflexBarrier 9101 (Solmed BF 9101 ；Amer ican Ronolit Crop,La Porte,IN,USA)^AmericanRenolit BF-1400 (Solmed BF-1400 FILM ;American Renolit Corp,La Porte,IN,USA)>American Renolit 4301 (Solmed Granuflex, American Renolit Crop, La Porte, IN,USA)、Mitos Durapure (Mitos Technologies, Phoenixville, PA, USA)和 MilliporePureflex Process Container Film (MiIlipore Corp, Billerica, MA, USA)。袋還包含色譜介質(zhì)填充口(16)，通過(guò)該口將干或濕的介質(zhì)或漿料加入到袋(10)中。在示于圖Ib的實(shí)施方案中，袋(10)具有一個(gè)隔間(11)，用于經(jīng)由口(16)接收介質(zhì)(未示出)。雖然未示于圖Ia或lb，袋(10)還包含與外壁(12)連接并且分別與各分配元件(13，14)相鄰的第一和第二尾端件。尾端件由剛性或半剛性材料制成，其防止載體液體從袋(10)滲漏，并且具有開(kāi)口，用于接收載體液體的入口(25)和出口(26)。在一個(gè)實(shí)施方案中，開(kāi)口采用彈性膈膜(未示出)形式，其接收載體液體的入口(25)或出口(26)。用于生產(chǎn)尾端件的合適的材料包括惰性金屬和塑料例如聚丙烯。優(yōu)選尾端件與外壁(12)熔接或模塑。在一個(gè)實(shí)施方案(未示出)中，尾端件和分配元件可集成為單一單元；合適的材料可包括半柔性塑料例如聚丙烯。該單元可通過(guò)機(jī)械加工或模塑制備。在袋的組合部件中使用剛性或半剛性材料使得能形成或壓縮填充床。優(yōu)選，袋及其組合部件由生物學(xué)和化學(xué)惰性材料制造，這些材料要經(jīng)過(guò)管理官方例如美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，用于制造藥物。袋(10)還可包含第二隔間(17)，其與袋(10)的第一隔間(11)相鄰，充當(dāng)液壓室，以壓縮第一隔間(11)，如以下所描述的。在其它實(shí)施方案中，第二隔間(17)可為與第一隔間(11)相鄰的單獨(dú)的袋，其充當(dāng)液壓室。在圖Ia和Ib中，袋(10)被柱(20)外殼(22)和蓋(21)封閉，這些組件中至少一個(gè)為半剛性或剛性的。袋(10)通過(guò)口 16填充色譜介質(zhì)的干粉末或濕漿料。在使用前，在填充介質(zhì)時(shí)柱(20)可通過(guò)Y輻照滅菌，或者袋可在裝入介質(zhì)時(shí)通過(guò)Y輻照或高壓滅菌來(lái)滅菌，隨后儲(chǔ)存或載運(yùn)至使用者。為了制備介質(zhì)床用于色譜分離，使用者將袋(10)插入色譜柱(20)的室，關(guān)閉柱外殼(22)和蓋(21)，使得袋(10)的壁緊緊貼合在室內(nèi)，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用流動(dòng)填充方法來(lái)壓縮床(未示出)。在使用前，填充柱隨后還可通過(guò)Y輻射滅菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二隔間或液壓室(17)可經(jīng)由口(24)填充液壓流體，以軸向壓縮含有介質(zhì)的袋(10)的第一隔間(11)，以保持床穩(wěn)定性?；蛘撸谝桓糸g(11)可通過(guò)存在于柱室中的活塞或適配器機(jī)械壓縮?，F(xiàn)在通過(guò)將含有化合物的載體液體流動(dòng)進(jìn)入袋10 (經(jīng)由入口 25)和通過(guò)色譜介質(zhì)，在出口 26處收集洗脫液，可發(fā)生化合物(例如蛋白)的分離?；蛘?，載體流動(dòng)可反向，使得口 26用作入口，在口 25處收集洗脫液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用者將袋(10)插入軸向色譜柱(20)的室中，關(guān)閉柱外殼
(22)和蓋(21)，使得袋被剛性外殼限制和在垂直方向排列柱，以向袋施用液體，使得形成固結(jié)的床。當(dāng)通過(guò)以向下的方向施加流動(dòng)而形成固結(jié)的床時(shí)，可在固結(jié)的床之上形成間隙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，更換袋的壁，以減少在固結(jié)的床之上形成的所述間隙，以便減少柱的截留體積和/或機(jī)械穩(wěn)定該固結(jié)的床。在使用中，將含有化學(xué)品(例如蛋白、肽、抗體、核酸或它們的混合物)或細(xì)胞(或細(xì)胞混合物)的液體樣品在固結(jié)的床上載荷，并平衡。隨后將袋從柱移除，并且可于低溫(例如，-20°C )下儲(chǔ)存，使得由于化學(xué)、光化學(xué)或生物學(xué)不穩(wěn)定性造成的化學(xué)品或細(xì)胞的損失或破壞最小化?；蛘?，袋可在低溫(例如，-200C )下運(yùn)輸至另一個(gè)位置。在低溫下儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸之后，袋可平衡至4°C或超過(guò)4°C的操作溫度，放置在半剛性或剛性柱中，從色譜介質(zhì)洗脫化學(xué)品或細(xì)胞?；蛘?，在4°C或超過(guò)4°C的溫度下，在平衡和更換剛性或半剛性柱中的袋之后，在色譜介質(zhì)上載荷的化學(xué)品或細(xì)胞可經(jīng)歷加工，例如化學(xué)或生物學(xué)反應(yīng)。然后加工步驟的產(chǎn)品可從柱中洗脫。在一個(gè)實(shí)施方案中，圖I的軸向柱設(shè)計(jì)為圓柱形。在另一個(gè)實(shí)施方案中，軸向柱設(shè) 計(jì)為具有偏離在圓柱形中所見(jiàn)的圓的橫截面形狀，例如橢圓或長(zhǎng)方形。相應(yīng)改裝限制柱的剛性外殼的形狀。例如，可使柱采用在入口和出口側(cè)裝配合適的分配系統(tǒng)的2D枕頭袋或3D長(zhǎng)方形袋的形狀。在又一個(gè)實(shí)施方案中，柱和袋的橫截面可橫跨尾端件之間的軸向位置而變化，例如，在尾端件處為長(zhǎng)方形或橢圓，而在柱的中間為圓形或橢圓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在柱和外殼側(cè)面打開(kāi)和關(guān)閉剛性外殼，而不是如圖I所述具有可移除的蓋。在又一個(gè)實(shí)施方案中，剛性外殼由在插入袋之后安裝在一起的兩個(gè)或更多個(gè)壁片段組成。圖2a、b和c為本發(fā)明的袋(210)的示意性截面平面圖，其可通過(guò)徑向壓縮而填充。袋(210)實(shí)際上為具有中空芯或中心(230)的管狀。在所示實(shí)施方案中，袋(210)的外壁(212)和內(nèi)壁(219)已熔接相對(duì)的液體分配元件(213，214)，其允許載體液體從袋的外部流向內(nèi)部(或者以相反的方向，這取決于流動(dòng)方向)。在所示實(shí)施方案中，袋(210)具有半剛性壁(222)，其可對(duì)袋(210)的壁(212，219)施加徑向壓縮力。袋的外部或外壁(212)具有凹處(215)，其允許響應(yīng)半剛性壁(222)的徑向力溫和壓縮介質(zhì)填充的袋(210)。袋(210)在這種溫和壓縮下是穩(wěn)定的，并且可儲(chǔ)存或運(yùn)輸至使用者(圖2a)。通過(guò)向袋(210)的壁(222)施加徑向機(jī)械壓縮，實(shí)現(xiàn)床填充，如圖2b中的箭頭所示。由圖2c可見(jiàn)，在袋(210)上施加的徑向力關(guān)閉凹處(215)，并且通過(guò)袋傳輸，壓縮其中的介質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用上述流動(dòng)填充方法實(shí)現(xiàn)床的溫和壓縮。圖3a、b和c顯示使用本發(fā)明的袋310的徑向柱的組合部件。圖3a說(shuō)明具有架臺(tái)(342)和鎖閉蓋(344)的圓柱形剛性芯(340)。蓋344具有孔或連接器，以容納介質(zhì)填充口(348)和用于洗脫液的出口(346)。圖3b描述外部圓柱形殼(350)，通常由半剛性塑料片材(351)組成，其可圍繞徑向流動(dòng)袋310纏繞，如圖3c所示，并用于徑向壓縮袋310。在所示實(shí)施方案中，片材(351)的長(zhǎng)度大于袋310的外圓周，使得存在重疊354，以允許在壓縮期間改變片材(351)的直徑。其它功能設(shè)計(jì)(例如將片材打摺)也可用于實(shí)現(xiàn)該目的。殼(350)具有孔或連接器(352)，以容納載體液體入口(325)。圖3c說(shuō)明本發(fā)明的袋(310)。袋具有管狀結(jié)構(gòu)，具有中空芯330。第一液體分配元件(313)和第二液體分配元件(314)分別與袋(310)的外壁(312)和內(nèi)壁(319)熔接。介質(zhì)入口(316)用于使用介質(zhì)(通常為漿料形式)填充袋，如圖3c中的箭頭所示。載體液體經(jīng)由入口 325進(jìn)入袋，流動(dòng)通過(guò)介質(zhì)床(未示出)，并經(jīng)由出口(326，參見(jiàn)箭頭)離開(kāi)。如下制備徑向流動(dòng)柱(360):插入袋(310)覆蓋在剛性芯(340)之上，圍繞袋的外壁纏繞圓柱形殼(350)，和將蓋(344)鎖閉就位(圖3d)。經(jīng)由入口 316使袋填充介質(zhì)漿料，在密封入口(316)之前，將過(guò)量的介質(zhì)經(jīng)由出口 326或325移除。袋中的介質(zhì)隨后可用載體液體平衡，該載體液體經(jīng)由入口 325進(jìn)入柱，并經(jīng)由口 326離開(kāi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，床通過(guò)上述流動(dòng)填充方法壓縮。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將外殼(350)徑向壓縮，以在袋中形成色譜介質(zhì)的填充床。徑向壓縮可采用多種方式實(shí)現(xiàn)，例如拉拔重疊354，以倚靠著剛性芯(圖3e)收縮和壓縮袋。用于壓縮的其它手段是可能的，例如夾緊或緊固徑向帶。一旦外殼350已被壓縮，將其固定就位以穩(wěn)定介質(zhì)的填充床(例如，通過(guò)使用連接帶370)。柱現(xiàn)在準(zhǔn)備好用于色譜分離化學(xué)品，例如蛋白和/或肽。將含有待分離或純化的化學(xué)品的樣品溶解于載體液體中，并施用于柱。載體液體經(jīng)由入口 325和第一分配元件313進(jìn)入袋，在介質(zhì)床(未示出)之上分配，在介質(zhì)床上發(fā)生分離，并通過(guò)第二元件314，以在出口 326處離開(kāi)柱。應(yīng)理解的是，通過(guò)使流動(dòng)方向反向，柱可反向運(yùn)行。低溫儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)
以下詳述的實(shí)驗(yàn)充分描述于申請(qǐng)人2010年8月5日提交的題為“Stabilizationand Storage Media and Method (穩(wěn)定和儲(chǔ)存介質(zhì)和方法)”的共同待審的美國(guó)專利申請(qǐng)61/370878。在國(guó)家法律允許的情況下，其內(nèi)容通過(guò)全文引用結(jié)合到本文中，就好像其被具體結(jié)合一樣。通常已知蛋白(例如，抗體)在溶液中的儲(chǔ)存導(dǎo)致隨著時(shí)間而聚集。通過(guò)在仔細(xì)設(shè)計(jì)的緩沖環(huán)境中以低且受控的冷凍速率冷凍蛋白溶液，可減少聚集，但是在儲(chǔ)存后聚集體含量不可避免地較高。隨后使用備選的儲(chǔ)存方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)使用不同的凝膠介質(zhì)以結(jié)合或包封靶蛋白。具有低初始二聚體含量的人多克隆IgG在溶液中或在凝膠介質(zhì)上的儲(chǔ)存
首先使用VIVASPIN 6超濾單元將人多克隆IgG(l%二聚體)的單體部分濃縮至121. 5AU(A280 nm)，并使用0.2 U m注射器過(guò)濾器過(guò)濾。將各種實(shí)驗(yàn)捕集儲(chǔ)存水凝膠介質(zhì)和對(duì)照(非捕集SEC)介質(zhì)(參見(jiàn)以上材料)分配在96孔濾板(MULTITRAP 板)中。使用人多克隆IgG的濃縮的單體部分作為抗體樣品，運(yùn)行MULTITRAP 方案。并行地，將抗體樣品與用于不同的“凝膠介質(zhì)”的各種緩沖液混合，用于隨后在_20°C的溶液中儲(chǔ)存。將6. 7 Ul抗體溶液分別與13. 3 Ul每一種緩沖液混合。用于凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌和樣品的緩沖液為對(duì)于不同的所用介質(zhì)的典型的吸附性捕集緩沖液
“pH 5 IEX”=20 mM Na-乙酸鹽，0. 02%(w/v) Na-疊氮化物，pH 5.0
“pH 9 IEX，，=20 mM Na-甘氨酸，0. 02%(w/v) Na-疊氮化物，pH 9.0
“PBS” =10 mM Na-磷酸鹽，2. 7 mM KCl, 0. 14 M NaCl, 0. 02%(w/v) Na-疊氮化物，pH
7. 4
“pH 5 HIC，，=25 mM Na-乙酸鹽，0. 5 mM EDTA，0. 75 M (NH4)2SO4, pH 5. 0將各種色譜法凝膠介質(zhì)儲(chǔ)存于96-孔MULTITRAP 板中。將MULTITRAP "板儲(chǔ)存于4-8°C的冷藏箱中4周(方案溫育時(shí)間)，而將抗體樣品的溶液于_20°C下儲(chǔ)存4周，包括6個(gè)冷凍/融化周期。所有的樣品一式三份實(shí)驗(yàn)，但三個(gè)陰離子交換凝膠介質(zhì)CAPTO Q、QSEPHAROSE FF和Q SEPHAROSE XL除外，它們作為單一樣品實(shí)驗(yàn)。溫育或儲(chǔ)存4周后，收集(凝膠過(guò)濾SEC介質(zhì)SEPHADEX G-50和SUPERDEX 200)非結(jié)合抗體(流通)或收集結(jié)合抗體，隨后洗脫抗體(除凝膠過(guò)濾介質(zhì)以外的所有介質(zhì))。所用的洗脫和解吸(strip)緩沖液為
洗脫緩沖液“3. 3XPBS”=30 mM Na-磷酸鹽，8. I mM KCl,0. 42 M NaCl,pH 7.4(對(duì)于用于樣品和凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌的緩沖液為“pH 5 IEX”和“pH 9 IEX”的那些樣品)； 洗脫緩沖液0. I M Na-甘氨酸pH 2. 9 (對(duì)于用于樣品和凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌的緩沖液為“PBS”的那些樣品)；
洗脫和解吸緩沖液20 mM Tris-HCl pH 7. 5 (對(duì)于用于樣品和凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌的緩沖液為“pH 5 HIC”的那些樣品)；
解吸緩沖液10 mM NaOH, I M NaCl (對(duì)于用于樣品和凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌的緩沖液為“pH 5 IEX”和“pH 5 HIC”的那些樣品)；
解吸緩沖液0. 5M乙酸(對(duì)于用于樣品和凝膠介質(zhì)的平衡/洗滌的緩沖液為“PBS”和“pH 9 IEX”的那些樣品)。洗脫在兩步中進(jìn)行，首先使用洗脫緩沖液，其次使用解吸緩沖液。后者通常在生物加工中用于除去未被洗脫緩沖液洗脫的任何殘余的蛋白，并且用于制備用于可能的另外的應(yīng)用的柱。分別分析對(duì)于每一種樣品的兩個(gè)洗脫部分。通過(guò)SEC分析在溶液中、在SEC對(duì)照介質(zhì)上或在結(jié)合介質(zhì)上儲(chǔ)存的所有的樣品。結(jié)果示于表1A-1D。表IA 在 pH 5 “ffiX” 緩沖液(20 mM Na-乙酸鹽，0. 02%(w/v) Na-疊氮化物，pH
5.0)中，在4-8°C的凝膠介質(zhì)上儲(chǔ)存或在_20°C的溶液中冷凍4周，來(lái)自人多克隆IgG的洗脫部分的二聚體含量
權(quán)利要求
1.一種用于色譜介質(zhì)的柔性袋，所述袋包含 與第一液體分配元件和第二液體分配元件連接的非多孔材料的外壁，由此限定用于其中的色譜介質(zhì)的隔間； 所述第一液體分配元件與所述第二液體分配元件相對(duì)置；和 介質(zhì)填充口； 任選包含與所述外壁連接并且分別與第一和第二液體分配元件相鄰的第一和第二尾端件，兩個(gè)所述尾端件均包含用于接收載體液體的入口或出口的開(kāi)口； 其中第一液體分配元件和/或第二液體分配元件與所述壁熔接或模塑。
2.權(quán)利要求I的袋，其中所述袋具有管狀結(jié)構(gòu)并且另外包含內(nèi)壁，其中第一液體分配元件與所述外壁熔接或模塑，第二液體分配元件與所述內(nèi)壁熔接或模塑。
3.權(quán)利要求2的袋，所述袋用于徑向色譜法。
4.權(quán)利要求I的袋，其中所述袋具有圓柱形結(jié)構(gòu)，并且包含與外壁連接并且分別與第一和第二分配元件相鄰的第一和第二尾端件，兩個(gè)所述尾端件均包含用于接收載體液體的入口或出口的開(kāi)口。
5.權(quán)利要求4的袋，其中第一和第二尾端件與外壁熔接或模塑。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的袋，其中第一和第二尾端件由剛性或半剛性材料制成。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的袋，其中第一液體分配元件和第二液體分配元件選自過(guò)濾器、篩孔、網(wǎng)和燒結(jié)物。
8.權(quán)利要求I和權(quán)利要求7的袋，其中第一液體分配元件和第一尾端件為集成單元，第二液體分配元件和第二尾端件為集成單元。
9.權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的袋，所述袋用于軸向色譜法。
10.權(quán)利要求I和4-9中任一項(xiàng)的袋，其中所述袋另外包含具有用于液壓流體的入口的第二隔間。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的袋，其中所述壁由塑料聚合材料制成。
12.權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)的袋，所述袋另外包含圍繞壁的半剛性或剛性外殼，以在軸向和/或徑向方向提供剛性。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的袋，所述袋另外含有濕或干的色譜介質(zhì)。
14.權(quán)利要求13的袋，其中所述濕或干的色譜介質(zhì)為無(wú)菌的。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的袋，所述袋通過(guò)輻射和/或高壓滅菌而滅菌。
16.一種填充色譜柱的方法，所述方法包括以下步驟 a.將權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的袋插入色譜柱的室內(nèi)； b.關(guān)閉柱外殼； c.形成或壓縮色譜介質(zhì)的填充床或固結(jié)的床或流化床。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述袋含有干的色譜介質(zhì)，并且填充床的形成通過(guò)加入液體溶脹所述介質(zhì)，以得到液體的溶脹體積Vs為柱室的約105-120%。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述袋含有濕介質(zhì)，所述柱外殼為剛性的，并且所述填充床通過(guò)軸向壓縮袋而形成或壓縮。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述柱包含液壓室，并且填充床通過(guò)使用液壓流體填充所述室而形成或壓縮。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述液壓室為柔性袋。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述袋包含第二隔間，并且填充床通過(guò)使用液壓流體填充所述第二隔間而形成或壓縮。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述柱包含可移動(dòng)的活塞或適配器，并且填充床通過(guò)軸向移動(dòng)所述活塞或適配器而形成或壓縮。
23.權(quán)利要求16的方法，其中將含有濕介質(zhì)的權(quán)利要求2的袋放置覆蓋在柱室內(nèi)的剛性芯之上，并且填充床通過(guò)徑向壓縮袋而形成或壓縮。
24.權(quán)利要求23的方法，其中通過(guò)徑向壓縮柱外殼而施加力。
25.權(quán)利要求24的方法，其中徑向壓縮所述柱外殼通過(guò)緊固在外殼的外部上的徑向帶而實(shí)現(xiàn)。
26.權(quán)利要求16和18-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述濕介質(zhì)的體積壓縮為5-20%。
27.權(quán)利要求16-26中任一項(xiàng)的方法,所述方法另外包括使用福射使柱滅菌。
28.權(quán)利要求16的方法，其中形成色譜介質(zhì)的固結(jié)的床或流化床，所述方法另外包括以下步驟 d.在所述固結(jié)的床或流化床上載荷化學(xué)品或細(xì)胞；和 e.從所述色譜柱的所述室移除所述袋，用于儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸。
29.權(quán)利要求28的方法，所述方法另外包括儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸袋的步驟。
30.權(quán)利要求29的方法，其中在-20°C至20°C的溫度下儲(chǔ)存或運(yùn)輸袋。
31.權(quán)利要求28-30中任一項(xiàng)的方法，所述方法另外包括使袋返回色譜柱和從所述固結(jié)的床或流化床洗脫所述化學(xué)品或細(xì)胞的步驟。
32.權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述化學(xué)品選自蛋白、抗體、肽、低聚肽、核酸、低聚核苷酸、RNA、DNA、寡糖和多糖。
33.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的袋的用途，其用于儲(chǔ)存或運(yùn)輸在濕或干的色譜介質(zhì)上載荷的化學(xué)品或細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的袋的用途，其用于在_20°C至20°C的溫度下儲(chǔ)存或運(yùn)輸化學(xué)品或細(xì)胞。
35.一種色譜柱，所述色譜柱包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的柔性袋。
36.權(quán)利要求35的色譜柱在用于分離、純化或加工化學(xué)品或細(xì)胞中的用途。
37.權(quán)利要求36的色譜柱的用途，其中所述化學(xué)品為蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于色譜介質(zhì)的容器或袋和使用此類容器填充色譜柱的方法。所述袋可用于儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸色譜介質(zhì)，并且在準(zhǔn)備好用于使用時(shí)可直接插入色譜柱的室內(nèi)。
文檔編號(hào)B01D15/22GK102655919SQ201080058765
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者格鮑爾 K. 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司