專利名稱：一種有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管整體柱的制備方法，更具體地涉及一種有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法。
背景技術(shù)：
生物樣品的復(fù)雜性和多樣性對現(xiàn)有分離技術(shù)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。僅就色譜技術(shù)在分離科學(xué)研究中的應(yīng)用而言，人們已在微柱液相色譜、毛細(xì)管電色譜及其色譜固定相等方面做了大量的改進(jìn)，其核心部件是毛細(xì)管色譜柱。傳統(tǒng)的毛細(xì)管填充柱存在背壓大、裝填困難、需要制備柱塞等缺點(diǎn)，無法滿足快速、高效、高通量、高選擇性分離的要求。整體柱作為繼多聚糖、交聯(lián)與涂漬、單分散之后的第四代分離介質(zhì)，正是應(yīng)對復(fù)雜樣品體系的快速、高效、高通量分析需要而發(fā)展起來的一種新型多孔微分離介質(zhì)(Iberer. G, Hahn. R, Jungbauer. A, LC-GC，1999，17: 998)。與傳統(tǒng)的填充柱相比，整體柱采用原位聚合，具有制備簡單、易于改性、高容量、傳質(zhì)快、柱效高以及試劑耗量少等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于來源寶貴的微量生物樣品，是當(dāng)前微分離分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(Sykora. D, Svec. F, Frechet. J. M, J. Chromatogr. A, 1999，852: 297)。毛細(xì)管整體柱按其基質(zhì)不同可分為無機(jī)整體柱和有機(jī)聚合物整體柱。以硅膠為基質(zhì)的無機(jī)整體柱具有快速、低壓、機(jī)械強(qiáng)度好等優(yōu)異特性，適合小分子物質(zhì)的高效快速分離，但制備繁瑣、需高溫老化、抗溶劑性能差、適用的PH范圍較小。而有機(jī)聚合整體柱制備方法簡單、PH適用范圍寬、單體及交聯(lián)劑選擇面廣、能夠?qū)崿F(xiàn)對生物大分子的高效、快速、高通量分離等優(yōu)點(diǎn)，但其溶脹效應(yīng)會影響固定相的穩(wěn)定性和機(jī)械性能。新近發(fā)展起來的有機(jī)-無機(jī)雜化法則是將有機(jī)硅烷與無機(jī)硅烷相結(jié)合，在溫和條件下通過“一步”或“二步”催化法聚合而成(Yan L, Zhang Q, Zhang J , Zhang L, LiT, Feng Y, Zhang L, Zhang W, Zhang Y. J. Chromatogr. A, 2004, 1046 255 ；Ma, J. F. , Liang, Ζ. , Qiao, X. Q. , Deng, Q. L. , Tao, D. Y. , Zhang, L. H. , Zhang, Y. K. , Anal. Chem. 2008，80，2949 - 2956.)，制得的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱兼?zhèn)淞擞袡C(jī)整體柱和硅膠整體柱的優(yōu)點(diǎn)，具有寬的PH適用范圍及良好的機(jī)械穩(wěn)定性。 然而，“一步”或“二步”催化法可供選擇的有機(jī)硅烷種類較少，成本昂貴、反應(yīng)時間過長，操作繁瑣，嚴(yán)重制約著該方法的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述不足，本發(fā)明提供了一種有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，該方法原料來源簡單、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間較短、成本低。本發(fā)明提供的制備整體柱的方法，包括如下步驟
1)將硅烷前驅(qū)體、分散劑以及催化劑混合，于冰水浴下劇烈攪拌至透明粘稠狀；
2)將有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑加入到步驟1)得到的透明粘稠液中，于0 4°C 下超聲至完全溶解，將混合液注入經(jīng)乙烯基改性的石英毛細(xì)管內(nèi)，密封后置于水浴鍋內(nèi)，于 35 45°C和60 75°C下分別加熱8 M小時完成聚合反應(yīng)，再用甲醇或乙腈清洗制得所述整體柱。步驟1)中，所述硅烷前驅(qū)體為四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷中的一種以及乙烯基三甲氧基硅烷和乙烯基三乙氧基硅烷中的一種的混合物，或四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷中的一種以及3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三乙氧基硅烷中的一種的混合物，即硅烷前驅(qū)體為乙烯基三甲(乙)氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧) 丙基三甲(乙)氧基硅烷中的一種與四甲(乙)氧基硅烷的混合物，混合物中兩者的體積比為 9-3 1 ；分散劑為聚乙二醇10000，用量為硅烷前驅(qū)體質(zhì)量的20%-35% ；催化劑為0. 01mol/L 乙酸水溶液，催化劑與硅烷前驅(qū)體的體積比為4-1:1;
步驟2)中，所述有機(jī)功能單體為4-乙烯基苯硼酸、3-丙烯酰胺基苯硼酸或3- (2-羰基乙烯基)苯硼酸；致孔劑為二甘醇或丙酮；引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為18-40 :56-160 :0. 2-1. 0，有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的總質(zhì)量占透明粘稠液質(zhì)量的16%-22%。所述混合物中兩者的體積比優(yōu)選為5-6 1 ；分散劑的用量優(yōu)選為硅烷前驅(qū)體質(zhì)量的25%_30% ；所述催化劑與硅烷前驅(qū)體的體積比優(yōu)選為2-3 1 ；所述有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比優(yōu)選為20 80 0. 6。有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的總質(zhì)量占透明粘稠液質(zhì)量的20%。步驟2)中，反應(yīng)溫度分別優(yōu)選40°C和75°C ；反應(yīng)時間各優(yōu)選12小時。制得的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱用于分離或富集含1，2-順式二醇結(jié)構(gòu)的小分子、核苷酸、多糖以及糖蛋白質(zhì)?！耙诲仭狈ㄊ且环N非常具有前景的有機(jī)合成方法。一鍋法反應(yīng)中的多步反應(yīng)可以從相對簡單易的原料出發(fā)，不經(jīng)中間體的分離，直接獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子。具有取材廣泛、 反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)成本低廉以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明正是采用“一鍋”法來實(shí)現(xiàn)有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
ι.本發(fā)明提供的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱制備方法，反應(yīng)溫度溫和，大大改善了柱體由于高溫老化而造成的柱體結(jié)構(gòu)不均一以及體積收縮等問題，制備過程簡單，易于操作，重現(xiàn)性好，使用壽命長。制得的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱具有良好的三維連續(xù)骨架結(jié)構(gòu)，孔徑分布均勻，背壓低，生物兼容性好，可滿足快速、高通量、高效分離等要求；
2.本發(fā)明提供的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱可滿足1，2-順式二醇結(jié)構(gòu)的小分子、核苷酸、多糖以及糖蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分離或富集，具有高效的選擇性。


圖1為本發(fā)明的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱截面的掃描電鏡圖； 圖2為圖1所示整體柱柱體與管內(nèi)壁連接處的掃描電鏡圖3為實(shí)施例3中間苯二酚與鄰苯二酚的色譜分離圖4為實(shí)施例4中非糖蛋白質(zhì)(人血清白蛋白)與糖蛋白(卵清蛋白)的色譜分離圖； 圖5為實(shí)施例5中雞蛋清中選擇性分離富集卵蛋白的色譜分離圖。
具體實(shí)施例方式
4
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于此。本發(fā)明采用的原材料可在市場購得，或可用本領(lǐng)域已知的方法合成。實(shí)施例1 1.柱子預(yù)處理
首先用0. lmol/L的HCl溶液沖洗毛細(xì)管空柱約lh，然后用去離子水沖洗30min，再用 0. lmol/L的NaOH沖洗4h，接著用去離子水沖洗30min，最后用甲醇沖洗30min，氮?dú)獯蹈?，待用?.硅烷化
在預(yù)處理過的毛細(xì)管內(nèi)注入無水甲醇與甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(Y-MAPS)體積比為1 :1的混合液，在60°C下反應(yīng)Mh，然后用甲醇30min，在60°C氮?dú)獯蹈伞?.柱內(nèi)合成
準(zhǔn)確稱取38 mg聚乙二醇10000 (PEG 10000)于圓底燒瓶中，分別加入0. 01 mol/L的乙酸0.；35 mL,四甲氧基硅烷(TMOS) 132 μ L, y-MAPS 22 μ L，在冰水浴條件下劇烈攪拌 1 h，混合物呈透明粘稠狀。于上述混合物中分別加入20mg 4-乙烯基苯硼酸(VPBA)，二甘醇80mg偶氮二異丁腈(AIBN)，于0 4 °C下反復(fù)超聲20 min，直至混合物完全
溶解。將粘稠狀混合物注入硅烷化后的75μπι內(nèi)徑毛細(xì)管中，至25 cm處，兩端封口放入40 °C水浴中反應(yīng)12 h后轉(zhuǎn)入75 °C水浴中再反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫，用高壓恒流泵在低流速下100%甲醇沖洗40 min以除去未反應(yīng)的功能單體以及反應(yīng)產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物，制得有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱。用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知材料具有微米級的通孔和連續(xù)的三維骨架，如圖1所示。用掃描電子顯微鏡觀察上述制備得到的整體柱的柱體微觀形貌，可以得知整體柱基質(zhì)與石英毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合完好，能耐受15兆帕的泵壓，具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性，如圖2所
7J\ ο實(shí)施例2
準(zhǔn)確稱取38 mg PEG 10000于圓底燒瓶中，分別加入0. 01 mol/L的乙酸0.35 mL, TMOS 132 yL，乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS)44 μ L，在冰水浴條件下劇烈攪拌1 h，混合物呈透明粘稠狀。于上述混合物中分別加入12. 5 mg VPBA，丙酮10 μ L ^P 1 mg AIBN，反復(fù)超聲渦旋20min (超聲過程中防止超聲水過熱)，直至混合物完全溶解。將粘稠狀混合物注入硅烷化后的75 μ m內(nèi)徑毛細(xì)管中，至25 cm處，兩端封口放入45 °C水浴中反應(yīng)12 h后轉(zhuǎn)入75 °C水浴中再反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫，用高壓恒流泵在低流速下100%甲醇沖洗40 min以除去未反應(yīng)的功能單體以及反應(yīng)產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物，制得有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱。實(shí)施例3
在微柱液相色譜(μΗΡΙΧ)模式下，以PH 8.0，離子濃度20 mmol/L、乙腈磷酸鹽 (30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相Α，運(yùn)行時間0 6 min ；以pH 3. 6，離子濃度20 mmol/L、乙腈醋酸鹽(30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相B，運(yùn)行時間從7min開始；泵流速為0. 05 mL/ min ；檢測波長為214 nm ；在流動相A條件下，間苯二酚(0. 1 mg/mL)在整體柱上不保留而直接被洗脫出來，而含1，2-順式結(jié)構(gòu)的鄰苯二酚(0. 1 mg/mL)因與硼酸基團(tuán)形成可逆共價鍵而被吸附在柱上，當(dāng)流動相切換到B條件下，鄰苯二酚得到洗脫。二者混合物在實(shí)施例1 中制得的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖3所示。實(shí)施例4
在微柱液相色譜(μΗΡΙΧ)模式下，以PH 8.0，離子濃度20 mmol/L、乙腈磷酸鹽 (30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相Α，運(yùn)行時間0 6 min ；以ρΗ 3. 6，離子濃度20 mmol/L、乙腈醋酸鹽(30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相B，運(yùn)行時間從7min開始；泵流速為0. 05 mL/ min;檢測波長為214 nm;以非糖蛋白(0.2 mg/mL人血清白蛋白，HSA)與含1，2-順式結(jié)構(gòu)的糖蛋白(0. 2 mg/mL卵清蛋白，OVA)為例，在流動相A條件下，HSA在整體柱上不保留而直接被洗脫出來，而OVA上的糖鏈因與硼酸基團(tuán)形成可逆共價鍵而被吸附在柱上，當(dāng)流動相切換到B條件下，OVA得到洗脫。二者蛋白混合物在實(shí)施例1中制得的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱上實(shí)現(xiàn)高效選擇性的分離，其色譜分離圖如圖4所示。實(shí)施例5
取一定體積的雞蛋清用超純水稀釋1000倍，用0. 45 μ m的纖維素濾膜過濾后置于4°C 冰箱中保存，待用。在微柱液相色譜(μΗΡΙΧ)模式下，以ρΗ 8.0，離子濃度20 mmol/L、乙腈磷酸鹽(30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相Α，運(yùn)行時間0 6 min ；以ρΗ 3. 6，離子濃度20 mmol/L、乙腈醋酸鹽(30/70，ν/ν)的緩沖液為流動相B，運(yùn)行時間從7min開始；泵流速為 0. 05 mL/min;檢測波長為214 nm ；蛋清樣品中的非糖蛋白在流動相A條件下被直接洗脫出來，而卵清蛋白(糖蛋白)被吸附在柱上，當(dāng)流動相切換到B條件下，卵清蛋白得到洗脫，通過色譜加標(biāo)試驗(yàn)確認(rèn)是0VA。利用實(shí)施例1中制得的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱可實(shí)現(xiàn)雞蛋清中糖蛋白質(zhì)的選擇性分離，其色譜分離圖如圖5所示。通過分時段收集，可以富集到卵清蛋白。
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟1)將硅烷前驅(qū)體、分散劑以及催化劑混合，于冰水浴下劇烈攪拌至透明粘稠狀；2)將有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑加入到步驟1)得到的透明粘稠液中，于0 4°C 下超聲至完全溶解，將混合液注入經(jīng)乙烯基改性的石英毛細(xì)管內(nèi)，密封后置于水浴鍋內(nèi)，于 35 45°C和60 75°C下分別加熱8 M小時完成聚合反應(yīng)，再用甲醇或乙腈清洗制得所述整體柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于步驟1)中，所述硅烷前驅(qū)體為四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷中的一種以及乙烯基三甲氧基硅烷和乙烯基三乙氧基硅烷中的一種的混合物，或四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷中的一種以及3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三乙氧基硅烷中的一種的混合物，混合物中兩者的體積比為9-3 1 ；分散劑為聚乙二醇10000，用量為硅烷前驅(qū)體質(zhì)量的20%-35% ；催化劑為0. Olmol/L乙酸水溶液，催化劑與硅烷前驅(qū)體的體積比為4-1 1 ；步驟2)中，所述有機(jī)功能單體為4-乙烯基苯硼酸、3-丙烯酰胺基苯硼酸或3- (2-羰基乙烯基)苯硼酸；致孔劑為二甘醇或丙酮；引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為18-40 :56-160 :0. 2-1. 0，有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的總質(zhì)量占透明粘稠液質(zhì)量的16%-22%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于所述混合物中兩者的體積比優(yōu)選為5-6 1 ；分散劑的用量優(yōu)選為硅烷前驅(qū)體的25%-30%;所述催化劑與硅烷前驅(qū)體的體積比優(yōu)選為2-3 1 ；所述有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比優(yōu)選為20 80 0. 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于有機(jī)功能單體、致孔劑和引發(fā)劑的總質(zhì)量占透明粘稠液質(zhì)量的20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于步驟2)中，反應(yīng)溫度分別優(yōu)選40°C和75°C ；反應(yīng)時間各優(yōu)選12小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于 制得的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱用于分離或富集含1，2-順式二醇結(jié)構(gòu)的小分子、核苷酸、多糖以及糖蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種有機(jī)-無機(jī)雜化毛細(xì)管整體柱的制備。該方法將硅烷前驅(qū)體、分散劑、催化劑混合，于冰水浴下劇烈攪拌至透明粘稠狀，隨后加入有機(jī)功能單體、致孔劑、引發(fā)劑于0～4℃下超聲至完全溶解，再注入經(jīng)乙烯基改性的石英毛細(xì)管內(nèi)，經(jīng)過處理制得整體柱。該方法制得的雜化整體柱兼?zhèn)溆袡C(jī)整體柱和無機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)，適用于分離或富集含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的小分子、核苷酸、多糖以及糖蛋白質(zhì)。
文檔編號B01J20/30GK102225249SQ20111008526
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者龐紀(jì)磊, 張?zhí)m, 楊黃浩, 林子俺, 陳國南 申請人:福州大學(xué)