專利名稱：一種瓊脂糖凝膠的n-羥基丁二酰亞胺修飾方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，屬于層析分離中基質材料的修飾方法。
背景技術：
層析技術是一種最有效、最普遍采用的生物分離技術和方法之一，層析技術的關鍵就是層析介質。瓊脂糖凝膠具有良好的親水性、化學可修飾性而作為層析介質的基質材料應用于各種生物大分子的分離純化；其表面必須進行修飾，通過對其表面羥基的活化并偶聯(lián)配基，進而衍生出各種層析介質。常見的羥基活化方法有溴化氰(CNBr)、環(huán)氧氯丙烷、 高碘酸鈉(NaIO4)、二乙烯基亞砜，1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)等。烯丙基縮水甘油醚的一端環(huán)氧基活性較高，易開環(huán)與瓊脂糖基質上的羥基反應， 而另一端雙鍵則相對惰性，交聯(lián)或水解等副反應受到限制。與環(huán)氧氯丙烷、羰基二咪唑等常規(guī)的活化方法比較，烯丙基縮水甘油醚活化法具有活性高、副反應少的優(yōu)點；相對于溴化氰法其活化過程也較安全。這種高效安全的活化方法為瓊脂糖凝膠色譜介質的高密度配基偶聯(lián)提供了可能。末端含有N-羥基丁二酰亞胺基團(MB)的瓊脂糖凝膠可以共價結合含有伯胺基團的配基，對于制備免疫親和介質來說經(jīng)常是首選。相對于其他活化基團，末端含有NHS基團的瓊脂糖與配基偶聯(lián)時速度快、效率高，在介質的儲存和層析過程中很少會發(fā)生配基泄露。并且，使用NHS-瓊脂糖凝膠可以形成酰胺鍵，在pH為13的條件下仍能很穩(wěn)定，適用于在純化過程中需要較高PH條件的操作。因此，本發(fā)明采用烯丙基縮水甘油醚對國產(chǎn)交聯(lián)瓊脂糖凝膠進行活化，加成巰基乙酸后，偶聯(lián)N-羥基丁二酰亞胺，得到一種連接臂長度為10個原子、具有對氨基高度特異性的瓊脂糖凝膠。通過控制瓊脂糖凝膠活化雙鍵的量，可使N-羥基丁二酰亞胺的修飾密度處在一個較寬的范圍(20-150 μ mol/mL)，這將有效減少介質上雜基團的引入并有利于配基密度的設計。上述活化過程對介質的性能沒有明顯影響?；罨橘|在30min內即可完成對 L-苯丙氨酸的偶聯(lián)，效率在90%以上，且配基在貯藏過程中穩(wěn)定性好、幾乎無泄露。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法。所述的瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法的步驟是1)烯丙基縮水甘油醚活化將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌， 最后用5倍體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到IOOmL具塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 05-2mL烯丙基縮水甘油醚和50-300 μ L的三氟化硼乙醚，35°C下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30%、70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈；
2)雙鍵加成巰基乙酸取IOmL活化基質，加入1. 20mL巰基乙酸、IOmL去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C下反應8h ；3) N-羥基丁二酰亞胺基團的偶聯(lián)取IOmL巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到IOOmL帶塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 2-lgN-羥基丁二酰亞胺、0. 2-lgN, N, - 二環(huán)己基碳二亞胺， 25°C振蕩8-12h ；最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用烯丙基縮水甘油醚對交聯(lián)瓊脂糖凝膠進行活化，加成巰基乙酸后，偶聯(lián)N-羥基丁二酰亞胺。本發(fā)明的優(yōu)點在于烯丙基縮水甘油醚的活化效率高，活化密度范圍廣；瓊脂糖末端的N-羥基丁二酰亞胺對氨基特異性高，偶聯(lián)配基后穩(wěn)定性好；制備工藝簡單，易于控制和放大；成本低廉，環(huán)境污染小。


圖1是本發(fā)明的工藝流程。圖2是本發(fā)明修飾后瓊脂糖凝膠對L-苯丙氨酸的偶聯(lián)性能。實驗條件25°C， 150 μ mo 1雙鍵/mL-濕膠。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述1、N-羥基丁二酰亞胺修飾實施例1將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌， 最后用5倍體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到IOOmL具塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 0511^烯丙基縮水甘油醚和30(^1^的三氟化硼乙醚，351下140印111水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30^^70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈。再將這些瓊脂糖凝膠，加入1. 20mL巰基乙酸、IOmL去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C 下反應8h。最后將巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到IOOmL帶塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 5g N-羥基丁二酰亞胺、0. 5g N，N，- 二環(huán)己基碳二亞胺，25°C 振蕩他；最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆?。得到的瓊脂糖凝膠，其烯丙基密度為25ymol/mL，N-羥基丁二酰亞胺的基團密度為20ymol/ mL。實施例2將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌， 最后用5倍體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到IOOmL具塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 2mL烯丙基縮水甘油醚和300 μ L的三氟化硼乙醚，35°C下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30^^70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈。再將這些瓊脂糖凝膠，加入1. 20mL巰基乙酸、IOmL去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C 下反應8h。最后將巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到IOOmL帶塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 5g N-羥基丁二酰亞胺、0. 5g N，N，- 二環(huán)己基碳二亞胺，25°C 振蕩他；最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆谩５玫降沫傊悄z，其烯丙基密度為lOOymol/ml，N-羥基丁二酰亞胺的基團密度為85 μ mol/
mLo實施例3將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌， 最后用5倍體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到IOOmL具塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 5mL烯丙基縮水甘油醚和250 μ L的三氟化硼乙醚，35°C下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30^^70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈。再將這些瓊脂糖凝膠，加入1. 20mL巰基乙酸、IOmL去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C 下反應8h。最后將巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到IOOmL帶塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 7g N-羥基丁二酰亞胺、0. 7g N，N，- 二環(huán)己基碳二亞胺，25°C 振蕩他；最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆?。得到的瓊脂糖凝膠，其烯丙基密度為120 μ mol/mL，N-羥基丁二酰亞胺的基團密度為100 μ mol/
mLo實施例4將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌， 最后用5被體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到100ml具塞三角瓶中，加入10m L 二氧六環(huán)、Iml烯丙基縮水甘油醚和300 μ L的三氟化硼乙醚，35°C下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30^^70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈。再將這些瓊脂糖凝膠，加入1. 20ml巰基乙酸、IOml去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C下反應他。最后將巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗， 再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到100ml帶塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、IgN-羥基丁二酰亞胺、IgN，N, - 二環(huán)己基碳二亞胺，25°C振蕩8h ； 最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆?。得到的瓊脂糖凝膠，其烯丙基密度為220 μ mol/mL, N-羥基丁二酰亞胺的基團密度為150 μ mol/mL。2、修飾后瓊脂凝膠偶聯(lián)實驗實施例5取IOmL實施例4中N-羥基丁二酰亞胺修飾的瓊脂糖凝膠依次用70%、30%的丙酮溶液清洗，然后用大量去離子水洗滌干凈，轉移到250mL帶塞三角瓶中，加入50mL 20mg/ mL的L-苯丙氨酸溶液，25°C下140rpm水浴搖床中反應一段時間，隨后用大量去離子清洗干凈，將介質懸浮在含ImL乙醇胺的水溶液中，震蕩池，最后再用大量去離子洗滌干凈。15min L-苯丙氨酸偶聯(lián)效率即達到90%左右，配基密度在30min時就已經(jīng)達到最值，且在20%乙醇溶液中貯存1個月配基密度未減少?；诒景l(fā)明精神或主要特征的具體形式并不僅限于上述實施例，還可有多種組合或變化，如各種時間、試劑添加量等均可在一定程度上進行調整，因此，無論從哪一點來看， 本發(fā)明的上述實施方式都只能認為是對本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，在與本發(fā)明權利要求書相當?shù)暮x和范圍內的任何變化，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，其特征在于采用烯丙基縮水甘油醚活化瓊脂凝膠上的羥基，加成巰基乙酸后，偶聯(lián)N-羥基丁二酰亞胺，得到一種連接臂長度為10個原子、具有對氨基高度特異性的瓊脂糖凝膠。
2.按照權利要求1所述的一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，其特征在于烯丙基縮水甘油醚的活化密度可控制在20-400 μ mol/mL, N-羥基丁二酰亞胺修飾密度可控制在 20-150 μ mol/mL。
3.按照權利要求1所述的一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，其特征在于所用的瓊脂糖凝為市售進口或國產(chǎn)瓊脂糖凝膠，型號為4FF和6FF，粒徑范圍30-150μπι。
4.按照權利要求1所述的一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，其特征在于其方法的步驟如下1)烯丙基縮水甘油醚活化將IOmL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30 %、70 %丙酮洗滌，最后用5倍體積的100%二氧六環(huán)洗滌5次、抽干，轉移到IOOml具塞三角瓶中，加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 05-2mL烯丙基縮水甘油醚和50-300 μ L的三氟化硼乙醚，35°C下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30%、70%丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈；2)雙鍵加成巰基乙酸取IOmL活化基質，加入1. 20mL巰基乙酸、IOmL去離子水、0. 25g過硫酸銨，60°C下反應8h ；3)N-羥基丁二酰亞胺基團的偶聯(lián)取IOmL巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用100%二氧六環(huán)清洗5次；將二氧六環(huán)替換后的瓊脂糖凝膠轉移到IOOmL帶塞三角瓶中， 加入IOmL 二氧六環(huán)、0. 2-lg N-羥基丁二酰亞胺、0. 2_lg多肽縮合試劑，25°C振蕩8_12h ； 最后用大量二氧六環(huán)、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存?zhèn)溆谩?br> 5.按照權利要求4所述的一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，其特征在于所用的多肽試劑為N，N，- 二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法。本發(fā)明采用烯丙基縮水甘油醚對瓊脂糖凝膠進行活化，加成巰基乙酸后，偶聯(lián)N-羥基丁二酰亞胺，得到一種連接臂長度為10個原子、具有對氨基高度特異性的瓊脂糖凝膠。通過控制瓊脂糖凝膠烯丙基縮水甘油醚的活化密度，可使N-羥基丁二酰亞胺的修飾密度處在一個較寬的范圍，這將有效減少介質上雜基團的引入并有利于配基密度的設計。本發(fā)明對瓊脂糖凝膠的性能沒有明顯影響。N-羥基丁二酰亞胺修飾后的瓊脂糖凝膠對配基的偶聯(lián)速度快、效率高，且配基在貯藏過程中穩(wěn)定性好、無泄露。
文檔編號B01D15/38GK102241791SQ20111012491
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權日2011年5月16日
發(fā)明者吳璞強, 夏海鋒, 金雄華, 饒志明 申請人:江南大學