專利名稱：17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分析測定生物樣品和食品樣品中的 17 β -雌二醇的分子印跡復(fù)合微球。
背景技術(shù)：
17 β -雌二醇(17 β -Estradiol)是人工合成雌激素的一種，它主要用于醫(yī)學(xué)上治療婦女更年期綜合癥等疾病，但長期攝入17 β -雌二醇會(huì)產(chǎn)生一些副作用，并增加某些疾病的發(fā)病危險(xiǎn)，鑒于具有這些風(fēng)險(xiǎn)，故而國家嚴(yán)禁在食品中使用17 β-雌二醇等人工合成雌激素。但不乏一些不法分子為強(qiáng)化其產(chǎn)品功能，降低成本而添加17 β-雌二醇等具有的雌激素樣作用的人工合成雌激素。此外，濫用同化激素，對人和動(dòng)物健康，對社會(huì)和生態(tài)環(huán)境都會(huì)造成直接或潛在的危害。因此對食品、保健食品中17 β-雌二醇等人工合成的雌激素監(jiān)測也是保證此類食品衛(wèi)生安全的必要措施。17 β -雌二醇可通過生命體的代謝進(jìn)入環(huán)境，或作為雌性激素類藥物生產(chǎn)的母體化合物隨工業(yè)廢水進(jìn)入環(huán)境，以致在水生物中殘留，由食物鏈進(jìn)入人體，而其代謝產(chǎn)物又與人類癌癥有密切的關(guān)系。因此，它引起的食品營養(yǎng)和安全問題不容忽視，對這類物質(zhì)的存在水平和生物學(xué)活性的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于食品中的殘留待測藥物濃度低且波動(dòng)范圍大、樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多、樣品基質(zhì)和待測組分的不確定性等特點(diǎn)，檢測前需去除樣品中干擾雜質(zhì)，富集痕跡量待測目的組分。分子印跡聚合物(MIPs)具有特異性識(shí)別，可用于復(fù)雜基質(zhì)的樣品前處理，且制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定和可重復(fù)使用，已在分離科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、傳感器技術(shù)和化學(xué)反應(yīng)的控制等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。但現(xiàn)有的制備MPIMs方法都存在明顯的局限性本體聚合得到的聚合物為塊狀，使用前須經(jīng)過研磨、篩分等處理，尺寸和形狀不規(guī)則使得樣品處理困難， 工作繁瑣、費(fèi)時(shí)，且產(chǎn)率低(一般< 50% )，應(yīng)用效率大幅降低；沉淀聚合法對溶劑的要求高，難以得到廣泛應(yīng)用；乳液聚合法制得的MPIMs粒徑小(< Iym)，不適合在液相色譜中使用且吸附后不易分離；利用球形硅膠表面印跡或犧牲硅膠法時(shí)，硅膠表面的羥基會(huì)影響功能單體與模板分子間的作用力，以致MPIMs識(shí)別能力較弱；懸浮聚合法雖制備工藝簡單， 但獲得的MPIMs粒徑分布寬，需經(jīng)繁瑣的分級處理才可使用；多步溶脹聚合法雖能制得微米級且粒徑較均勻的MPIMs，經(jīng)簡單的洗滌即可使用，但需經(jīng)多步溶脹，過程較為繁瑣、制備周期較長，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。相比之下，分子印跡聚合物微球性能較好、制備與使用較方便， 特別適用于分析檢測、傳感器陣列和分離組件。因此，分子印跡聚合物微球的制備和應(yīng)用研究成為分子印跡技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。表面印跡的結(jié)合位點(diǎn)位于聚合物的表面，模板分子易于洗脫，可提高結(jié)合容量；再結(jié)合時(shí)目標(biāo)分子無需進(jìn)入其剛性結(jié)構(gòu)，大大加快了結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程。但這種方法目前使用的基質(zhì)主要局限于硅膠，使用微粒硅膠要特別注意它的使用PH范圍是2 7. 5，若過堿(pH > 7.幻，硅膠會(huì)粉碎或溶解；若過酸(pH <幻，鍵合相的化學(xué)鍵會(huì)斷裂。反應(yīng)結(jié)束后去除基質(zhì)比較麻煩，一般采用氫氟酸腐蝕的方法，但對聚合物的骨架結(jié)構(gòu)有一定的不良影響。
發(fā)明內(nèi)溶本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述制備方法的缺點(diǎn)，提供一種反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物穩(wěn)定性好、識(shí)別能力強(qiáng)的17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成1、合成單分散聚苯乙烯分散液將苯乙烯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入無水乙醇中，苯乙烯與偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9，超聲分散，通氮?dú)獬?，攪拌?0°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，制備成聚苯乙烯；將聚苯乙烯用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液超聲分散，得到單分散聚苯乙烯分散液。上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量為10000 70000，由中國 派尼化學(xué)試劑廠 鄭州提供。2、制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液加入環(huán)己醇與甲苯的混合溶劑中，甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60，用細(xì)胞破碎儀在功率為300 500W下超聲，每間隔10 20秒超聲1次，每次超聲10 20秒，超聲乳化至上層無油滴，加入到步驟1得到的單分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0. 1，30°C攪拌溶脹10小時(shí)，通氮?dú)獬酰?70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，過濾，依次用甲醇、丙酮洗滌，60°C真空干燥4小時(shí)，制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。上述分散劑水溶液中的分散劑為十二烷基硫酸鈉和聚乙烯醇，十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，所述的聚乙烯醇的聚合度為1700，醇解度為88%，由天津天大化工實(shí)驗(yàn)廠提供。3、抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E2制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中 140°C抽提48小時(shí)，依次用無水乙醇、丙酮洗滌，干燥，得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。4、單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4- 二氧六環(huán)中， 每IOOmL 1，4_ 二氧六環(huán)中加入3 IOg單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，室溫?cái)嚢枞苊? 12小時(shí)，通氮?dú)獬?，加入甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 5 4 6的混合液，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0. 1 2，30 60°C攪拌8 15小時(shí)，過濾，產(chǎn)物依次用 1，4_ 二氧六環(huán)、甲醇、蒸餾水、丙酮洗滌，真空干燥，得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球以乙腈為溶劑，超聲分散17 β-雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，室溫?cái)嚢枞苊? 12小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球丙酯微球的質(zhì)量比為1 20 120，17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 2 12 8 20 1 2，通氮?dú)獬酰?0 70°C聚合反應(yīng)16 48小時(shí)，產(chǎn)物用甲醇與乙酸的體積比為8 2的洗脫液洗脫，除去17 β-雌二醇，先用蒸餾水洗至中性，再用甲醇洗滌，真空干燥，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。本發(fā)明的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的最佳質(zhì)量比為1 1，甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的最佳質(zhì)量比為1 2.6 5。本發(fā)明的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中，最佳將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4- 二氧六環(huán)中，室溫?cái)嚢枞苊?小時(shí)，通氮?dú)獬?，加?，4_ 二氧六環(huán)與甲基丙烯酸羥乙酯、三氟化硼乙醚的混合液， 45°C攪拌12小時(shí)，得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。本發(fā)明的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的最佳質(zhì)量比為1 40，17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的最佳摩爾比為1 4 10 1.2。本發(fā)明的合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，最佳將17 β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中，加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，超聲分散，室溫?cái)嚢枞苊?小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，通氮?dú)獬酰?0°C聚合反應(yīng)M小時(shí)。本發(fā)明以1，4_ 二氧六環(huán)為溶劑，制備表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，以表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?yàn)檩d體，采用表面印跡技術(shù)制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球，該方法反應(yīng)條件溫和，所得產(chǎn)物穩(wěn)定性好，對17 β-雌二醇的識(shí)別能力強(qiáng)、吸附速度快，可用于建立簡便的提取、控化和濃縮樣品預(yù)處理，對含雌激素產(chǎn)品的質(zhì)量和成分進(jìn)行評估，同時(shí)可用于經(jīng)受高流速高壓力操作的高效液相色譜，大大提高柱效與重現(xiàn)性。另外，由于印跡的結(jié)合位點(diǎn)位于聚合物的表面，模板分子易于洗脫，結(jié)合時(shí)目標(biāo)分子無需進(jìn)入其剛性結(jié)構(gòu)，大大加快了吸附與解吸的動(dòng)力學(xué)過程，可將其用作快速、高效的固相萃取吸附劑。


圖1是17 β -雌二醇、白藜蘆醇和辣椒堿在印跡柱上的色譜分離圖。圖2是17 β -雌二醇、白藜蘆醇和辣椒堿在非印跡柱上的色譜分離圖。圖3是17 β -雌二醇和雌酮在印跡柱上的色譜分離圖。圖4是17 β -雌二醇和雌酮在非印跡柱上的色譜分離圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1 1、合成單分散聚苯乙烯分散液 將苯乙烯10. 908g、偶氮二異丁腈0. M06g、分子量為10000 70000的聚乙烯吡咯烷酮1.5006g加入盛有96g無水乙醇的250mL單口燒瓶中，苯乙烯與偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.02 014 8. 8，用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散20分鐘，通氮?dú)?5分鐘除氧，攪拌，70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心除去溶劑，用無水乙醇洗滌，制備成聚苯乙烯；將0. 2g聚苯乙烯用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散于IOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液中，得到單分散聚苯乙烯分散液。2、制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰0. 1667g、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯2.064g、乙二醇二甲基丙烯酸酯 3. 03g、十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇(醇解度為88% )的混合物水溶液62. 35g加入盛有 1.92g環(huán)己醇與1.0392g甲苯的250mL燒杯中，甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇的混合物水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60，用細(xì)胞破碎儀在功率為400W下超聲，每間隔15秒超聲1 次，每次超聲15秒，超聲乳化至上層無油滴，加入到步驟1得到的單分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0.1，120轉(zhuǎn) /分鐘攪拌，30°C溶脹10小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，用玻砂漏斗抽濾，用70°C蒸餾水洗滌，再依次用甲醇、丙酮洗滌，60°C真空干燥4小時(shí)，制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。上述的十二烷基硫酸鈉與聚乙烯醇的混合物水溶液中，十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%，聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，聚乙烯醇的聚合度為1700，醇解度為88%。3、抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E2制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球置于索式提取器中，加入 50mL甲苯，140°C抽提48小時(shí)，依次用無水乙醇、丙酮洗滌，在真空度為0. 06MPa下60°C干燥3小時(shí)，得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。4、單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球2. Og加入50mL 1， 4- 二氧六環(huán)中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹6小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，加入2. Og甲基丙烯酸羥乙酯、5. 2g 1，4-二氧六環(huán)、10. Og三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羥乙酯與1， 4-二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2.6 5，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 1，45°C攪拌12小時(shí)，過濾，產(chǎn)物依次用1，4_二氧六環(huán)、甲醇、蒸餾水、丙酮洗滌，30°C真空干燥2小時(shí)，得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。5、合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)?7 3-雌二醇201^(0.078讓01)、甲基丙烯酸27“1^(0.32讓01)溶于15mL乙腈中，加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球0. 8g，用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹6小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L (0. 774mmol)、偶氮二異丁腈15mg (0. 094mmol)，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 40，17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 4 10 1.2，通氮?dú)?0分鐘除氧，70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，產(chǎn)物先依次用蒸餾水、甲醇洗滌，再用甲醇與乙酸的體積比為8 2的洗脫液洗脫M小時(shí)，除去17β-雌二醇，然后用蒸餾水洗至中性，再用甲醇洗滌，30°C真空干燥2小時(shí)，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。對比實(shí)施例1按照實(shí)施例1步驟1 4的方法，制備成表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。不添加模板分子17 β-雌二醇，直接將甲基丙烯酸27 yL (0.32mmol)溶于15mL乙腈中，加入0. 8g表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹6小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯147 μ L(0. 774mmol)、偶氮二異丁腈15mg(0. 094mmol)，通氮?dú)?0分鐘除氧，70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，產(chǎn)物依次用蒸餾水、甲醇洗滌，30°C真空干燥2小時(shí)，制備成非分子印跡復(fù)合微球。實(shí)施例2在實(shí)施例1的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中， 將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球1. 6g加入53. 2mL 1，4_ 二氧六環(huán)中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹6小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，加入0. 16g甲基丙烯酸羥乙酯、0.32g 1，4-二氧六環(huán)、0.64g三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羥乙酯與1， 4-二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 4，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0.1，該步驟的其他步驟與實(shí)施例1相同。在合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，將17 β -雌二醇40mg(0. 156mmol)、甲基丙烯酸^yL(0.312mmol)溶于15mL乙腈中，加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球0. Sg,用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘，200轉(zhuǎn) /分鐘，室溫溶脹6小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯237yL(1.248mm0l)、偶氮二異丁腈 26mg(0. 156mmol)，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 20，17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 :2:8: 1，該步驟的其他步驟與實(shí)施例1相同。其他步驟與實(shí)施例1相同， 制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實(shí)施例3在實(shí)施例1的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4中，將步驟3制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球1. 6g加入16mL 1，4_ 二氧六環(huán)中， 200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹6小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，加入3. 2g甲基丙烯酸羥乙酯、16g 1，4-二氧六環(huán)、19. 2g三氟化硼乙醚的混合液，甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 5 6，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 2，該步驟的其他步驟與實(shí)施例1相同。在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，將17 β-雌二醇6. 7mg(0. 026mmol)、甲基丙烯酸25 μ L (0. 31mmol)溶于15mL乙腈中，加入步驟4得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球 0. 8g，用超聲波清洗器在功率為80W下超聲分散5分鐘，200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫溶脹6小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯 100 μ L (0. 52mmol)、偶氮二異丁腈 9. 3mg (0. 056mmol)，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 120，17β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 12 20 2，該步驟的其他步驟與實(shí)施例1相同。其他步驟與實(shí)施例1相同，制備成17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球。
實(shí)施例4在實(shí)施例1 3的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4 中，將單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六環(huán)中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌， 室溫溶脹4小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，加入甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的混合液，30°C攪拌15小時(shí)，該步驟的其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同。其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實(shí)施例5在實(shí)施例1 3的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟4 中，將單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六環(huán)中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌， 室溫溶脹12小時(shí)，通氮?dú)?0分鐘除氧，加入甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的混合液，60°C攪拌8小時(shí)，該步驟的其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同。其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同，制備成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實(shí)施例6在實(shí)施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，將17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球超聲分散于乙腈中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹4小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，通氮?dú)?20分鐘除氧，60°C聚合反應(yīng)48小時(shí)，該步驟的其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同。其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。實(shí)施例7在實(shí)施例1 5的合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟5中，將17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球超聲分散于乙腈中，200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，室溫溶脹12小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，通氮?dú)?0分鐘除氧，70°C聚合反應(yīng)16小時(shí)，該步驟的其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同。其他步驟與相應(yīng)實(shí)施例相同，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。為了驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例1制備的17β_雌二醇分子印跡復(fù)合微球和對比實(shí)施例1制備的非分子印跡復(fù)合微球進(jìn)行了各種試驗(yàn)，具體試驗(yàn)情況如下實(shí)驗(yàn)試劑過氧化苯甲酰(ΒΡ0，A.R.天津市福晨化學(xué)試劑廠)；甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(GMA，Sigma-Aldrich)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酸(MAA, Sigma-Aldrich)；甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA, Sigma-Aldrich) ；1，4-二氧六環(huán)(A.R.天津市福晨化學(xué)試劑廠)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市福晨化學(xué)試劑廠)； 17 β -雌二醇，雌三醇和雌酮，均采購自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。1、色譜實(shí)驗(yàn)(1)稱取17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球(MIP)、非分子印跡復(fù)合微球(NIP)各 0. 8g置于30mL異丙醇中，超聲勻漿10分鐘，在20ΜΙ^壓力下，以乙腈作為頂替液，濕法裝柱 (50mmX4. 6mm)，以乙腈為流動(dòng)相，直到獲得穩(wěn)定的基線。以17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球填充的色譜柱稱為印跡柱，以非分子印跡復(fù)合微球填充的色譜柱稱為非印跡柱。色譜條件以體積分?jǐn)?shù)為36%的乙腈-水溶液為流動(dòng)相；流速為0. 5mL/分鐘；進(jìn)樣量為5. 0 μ L，樣品為20 μ g · mL—1的乙腈水溶液；檢測波長為280nm。
測定數(shù)據(jù)容量因子k' = (、-、)/、，其中、是分析物的保留時(shí)間，、是死時(shí)間 (以NaNO2測定)；印跡因子IF = k' MIP/k' NIP，其中k' 和k' NIP分別為17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球和非分子印跡復(fù)合微球的容量因子；分離因子α =k/ /k2'，其中k/ 和1 '分別是17 β -雌二醇和雌三醇在印跡柱上的容量因子。(2) 17 β -雌二醇在印跡柱和非印跡柱上的保留情況以17 β-雌二醇及與其結(jié)構(gòu)差異較大的白藜蘆醇和辣椒堿作為研究對象，研究 17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球和非分子印跡復(fù)合微球的選擇性，結(jié)果如圖1和圖2所示。 由圖1可見，在相同的分離條件下，17 β-雌二醇在印跡柱上的保留比白藜蘆醇、辣椒堿強(qiáng)， 表明17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)?7 β-雌二醇具有一定的吸附選擇性；如圖2所示， 相同的分離條件下，三種物質(zhì)在非印跡柱上的保留時(shí)間十分接近，證明分子印跡復(fù)合微球?qū)δ０宸肿泳哂刑禺愋赃x擇。這是由于在17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備過程中形成了能夠與模板分子17 β-雌二醇空間結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴和結(jié)合位點(diǎn)，其對模板分子具有特異識(shí)別能力；白藜蘆醇和辣椒堿的結(jié)構(gòu)與17 β-雌二醇的結(jié)構(gòu)不相同，很難與模板分子留下的印跡孔穴相匹配，因此，17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)ζ洳痪邆渥R(shí)別能力。 而非分子印跡復(fù)合微球上并不存在這樣的特異性結(jié)合位點(diǎn)，三種物質(zhì)在非印跡柱上的保留時(shí)間十分接近。另外，選擇17 β -雌二醇的結(jié)構(gòu)類似物雌酮作為研究對象研究分子印跡復(fù)合微球?qū)ν愇镔|(zhì)的識(shí)別作用。由圖3可以看出，雌二醇和雌酮在印跡柱上的保留時(shí)間很接近，說明17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球?qū)Y(jié)構(gòu)類似物具有相似的保留情況。由圖3、4對比可以看出，17 β -雌二醇和其結(jié)構(gòu)類似物雌酮在非印跡柱上的保留時(shí)間均小于在印跡柱上的保留時(shí)間，由此進(jìn)一步證明分子印跡復(fù)合微球?qū)δ０宸肿佑刑禺愋宰R(shí)別作用。(3) ρΗ值對分離的影響分別以乙腈與ρΗ為3、5、7、9、11的PBS緩沖液05mmol/L的磷酸鹽緩沖液)的體積比為36 64的混合液為流動(dòng)相，考察流動(dòng)相的ρΗ對17 β-雌二醇及雌三醇在印跡柱上保留情況的影響。結(jié)果如表1所示。表1流動(dòng)相中磷酸鹽酸沖液的ρΗ值對分離的影響
權(quán)利要求
1.一種17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，由下述步驟組成(1)合成單分散聚苯乙烯分散液將苯乙烯、偶氮二異丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入無水乙醇中，苯乙烯與偶氮二異丁腈、 聚乙烯吡咯烷酮、無水乙醇的質(zhì)量比為1 0.01 0.04 0.1 0.3 7. 5 9，超聲分散，通氮?dú)獬?，攪拌?0°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，制備成聚苯乙烯；將聚苯乙烯用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 2%的十二烷基硫酸鈉水溶液超聲分散，得到單分散聚苯乙烯分散液；上述聚乙烯吡咯烷酮的分子量為10000 70000 ；(2)制備單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⑦^氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液加入環(huán)己醇與甲苯的混合溶劑中，甲苯與環(huán)己醇、過氧化苯甲酰、甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散劑水溶液的質(zhì)量比為1 2 0. 15 2 3 60，用細(xì)胞破碎儀在功率為300 500W下超聲，每間隔10 20秒超聲1次，每次超聲10 20秒，超聲乳化至上層無油滴，加入到步驟(1)得到的單分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯與單分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的質(zhì)量比為1 0. 1，30°C攪拌溶脹10小時(shí)，通氮?dú)獬酰?70°C聚合反應(yīng)M小時(shí)，制備成單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球；上述分散劑水溶液中的分散劑為十二烷基硫酸鈉和聚乙烯醇，十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%，聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，所述的聚乙烯醇的聚合度為1700，醇解度為 88% ；(3)抽提單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?qū)⒉襟E( 制備的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中140°C 抽提48小時(shí)，得到單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球；(4)單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基將步驟⑶制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4_二氧六環(huán)中，每 IOOmL 1，4_ 二氧六環(huán)中加入3 IOg單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，室溫?cái)嚢枞苊? 12小時(shí)，通氮?dú)獬?，加入甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2 5 4 6的混合液，單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 0.1 2，30 60°C攪拌8 15小時(shí)，得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球；(5)合成17β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球以乙腈為溶劑，超聲分散17 β -雌二醇、甲基丙烯酸、表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，室溫?cái)嚢枞苊? 12小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，17 β -雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為 1 20 120，17 β-雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 2 12 8 20 1 2，通氮?dú)獬酰?0 70°C聚合反應(yīng)16 48小時(shí)，洗脫 17 β -雌二醇，制備成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于 在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟中，所述的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球與甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為1 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟中，所述的甲基丙烯酸羥乙酯與1，4_ 二氧六環(huán)、三氟化硼乙醚的質(zhì)量比為1 2.6 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于 在單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球表面鍵合乙烯基步驟(4)中，將步驟C3)制備的單分散多孔交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球加入1，4_ 二氧六環(huán)中，室溫?cái)嚢枞苊?小時(shí)，通氮?dú)獬?，加?，4_ 二氧六環(huán)與甲基丙烯酸羥乙酯、三氟化硼乙醚的混合液，45°C攪拌12小時(shí)，得到表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟(5)中，所述的17 β-雌二醇與表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球的質(zhì)量比為1 40。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于 在合成17 β -雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟( 中，所述的17 β -雌二醇與甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈的摩爾比為1 4 10 1.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，其特征在于 在合成17 β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球步驟( 中，將17β-雌二醇、甲基丙烯酸溶于乙腈中，加入步驟(4)得到的表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，超聲分散，室溫?cái)嚢枞苊?小時(shí)，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈，通氮?dú)獬酰?0V聚合反應(yīng)M小時(shí)。
全文摘要
一種17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球的制備方法，以1，4-二氧六環(huán)為溶劑，制備表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，以表面鍵合乙烯基的單分散交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?yàn)檩d體，采用表面印跡技術(shù)制備成17β-雌二醇分子印跡復(fù)合微球，該方法反應(yīng)條件溫和，所得產(chǎn)物穩(wěn)定性好，對17β-雌二醇的識(shí)別能力強(qiáng)、吸附速度快，可用于建立簡便的提取、控化和濃縮樣品預(yù)處理，對含雌激素產(chǎn)品的質(zhì)量和成分進(jìn)行評估，同時(shí)可用于經(jīng)受高流速高壓力操作的高效液相色譜，大大提高柱效與重現(xiàn)性，還可用作快速、高效的固相萃取吸附劑。
文檔編號(hào)B01J20/30GK102382273SQ20111019470
公開日2012年3月21日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者岳宣峰, 張靜, 王玲玲, 陳月萌, 韓艷婷, 馬晉琴 申請人:陜西師范大學(xué)