專利名稱：一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法
一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及手性液相色譜固定相技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法。
背景技術(shù)：
手性化合物是指分子量、分子結(jié)構(gòu)相同，但左右排列相反的一對分子，其物理化學(xué)性質(zhì)幾乎完全相同，但它們的生化和藥理作用可能存在極大差異。例如具有鎮(zhèn)靜作用的反應(yīng)停(thalidomide，酞胺哌啶酮)，其有效成分是R構(gòu)型，而S構(gòu)型則具有致畸作用。近年來，隨著生物科學(xué)和生物工程的發(fā)展，手性拆分已經(jīng)成為了人們關(guān)注的焦點。目前用于手性分離的方法主要有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、亞臨界及超臨界流體色譜法、氣相色譜法和液相色譜法等。高效液相色譜法以其高效的分離能力，已成為手性拆分強有力的手段之一。液相色譜手性拆分一般需使用特殊色譜固定，即手性固定相(CSP)，其性能決定了手性拆分的能力。CSP由采用一種手性物質(zhì)化學(xué)鍵合或涂漬在固定相擔(dān)體上制成?？捎糜谝合嗌V手性拆分的手性固定相種類繁多，最常見的有多糖類、蛋白質(zhì)和環(huán)糊精等類手性固定相。蛋白質(zhì)手性固定相手性選擇性高，分離能力強，色譜峰形好。通?？梢栽诜聪嗄Ｊ较峦瓿煞蛛x，通過色譜操作參數(shù)的調(diào)整，如緩沖液的組成、離子強度、PH值、有機改性劑和柱溫等，優(yōu)化分離方法，因此其可拆分的化合物分布面廣。對于蛋白質(zhì)鍵合方式，主要有吸附法和化學(xué)鍵合法。1973年，Mewart和Doherty將牛血清白蛋白(BsA)鍵合到瓊脂糖上并在其上成功地拆分了 D/L —色氨酸，20世紀(jì)80年代已出現(xiàn)了鍵合BSA和AGP的商品化硅膠HPLC填料。為提高CSI^s的柱容和穩(wěn)定性，人們進(jìn)行了許多嘗試，如用戊二醛將蛋白質(zhì)交鏈，用蛋白質(zhì)片段或結(jié)構(gòu)域制備CSI^s，改變載體骨架等。由于蛋白質(zhì)分子本身具有較大體積，無論采取何種鍵合固化方式，得到的CSP固載量均較低。這也使得它們在孔徑有限的填料上存在非常少的手性識別部位，柱容量較低。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法，通過在大孔固定相基質(zhì)外表面和孔內(nèi)表面同時鍵合蛋白質(zhì)分子，提高柱容量。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一、硅膠基質(zhì)1、硅膠的預(yù)處理(1)堿化將孔徑大小為30 200nm的大孔硅膠置于稀堿溶液中堿化，然后用水洗至中性， 使-Si-OH充分活化。(2)硅烷化改性將堿化后的大孔硅膠與3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在一定溶劑條件(APTES MeOH H20 = 2 1 7)下，機械攪拌反應(yīng)M小時，將氨基充分鍵合到大孔硅膠上。2、蛋白質(zhì)鍵合在上述預(yù)處理完畢的大孔硅膠中加入濃度為15%戊二醛溶液，將之完全覆蓋，反應(yīng)12小時，使硅膠上-NH2充分被C = O代替，將硅烷化改性后的大孔硅膠醛化，并用二次蒸餾水洗滌至中性；然后將溶于磷酸鹽緩沖液OOml，pH = 7. 4)的蛋白質(zhì)與醛化后大孔硅膠混合，機械振蕩反應(yīng)12 M小時，用二次蒸餾水多次洗滌，即可得到硅膠基質(zhì)的新型蛋白質(zhì)手性固定相，于4°C環(huán)境下0.02%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖溶液(50mmol/L，PH = 7)中保存。二、聚酰胺類高聚物基質(zhì)1、醛化將聚酰胺溶于乙醇與異丙醇的混合溶液中，加入15%戊二醛溶液，室溫攪拌反應(yīng) 12小時后，用水洗滌至中性。2、蛋白質(zhì)鍵合將溶于磷酸鹽緩沖液QOml，pH = 7. 4)的蛋白質(zhì)與改性后的聚酰胺基質(zhì)混合，機械振蕩反應(yīng)12h以上，用二次蒸餾水多次洗滌，即可得到聚合物基質(zhì)的新型蛋白質(zhì)手性固定相。本發(fā)明所述新型蛋白手性固定相制備方法在大孔固定相基質(zhì)外表面和孔內(nèi)表面同時鍵合蛋白質(zhì)分子，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的大孔內(nèi)徑通路，與孔內(nèi)表面修飾的蛋白質(zhì)分子作用。使用的基質(zhì)可以為大孔硅膠和大孔聚酰胺類高聚物，還可以為大孔氨基鍵合硅膠及帶氨基活性基團的其它大孔聚合物。不僅可以在基質(zhì)上鍵合某一種蛋白，還可以根據(jù)需要在基質(zhì)上同時鍵合多種蛋白。與現(xiàn)有蛋白質(zhì)手性固定相制備方法相比，本發(fā)明的積極效果是(1)本發(fā)明充分利用了大孔基質(zhì)的大孔內(nèi)徑，在大孔固定相基質(zhì)外表面和孔內(nèi)表面同時鍵合蛋白質(zhì)分子，極大地提高柱容量，有效改善分離。(2)普適性高，基質(zhì)可以為大孔硅膠、氨基鍵合硅膠、聚酰胺類高聚物和其它帶氨基活性基團的大孔聚合物；可在基質(zhì)上鍵合一種或多種蛋白質(zhì)。(3)操作簡單，使用范圍廣，制備的手性固定相可以用于液相色譜分離分析、毛細(xì)管電色譜分析以及制備液相色譜手性分離。

圖1為實施例1中所得大孔硅膠鍵合蛋白質(zhì)手性固定相示意2為實施例2中所得大孔聚酰胺鍵合蛋白質(zhì)手性固定相示意3為實施例1中氨基酸對映體分離色譜圖
具體實施方式以下提供本發(fā)明一種新型的蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法的具體實施方式
。實施例1稱取5. Og粒徑為5 μ m的大孔硅膠，內(nèi)孔直徑100納米，置于0. lmol/L稀堿溶液中，機械攪拌反應(yīng)半小時，然后用水洗至中性；稱取APTES = 6ml,H20 = 3ml,MeOH = 21ml, 將三種溶液混合后，與上述大孔硅膠加入混合，機械攪拌反應(yīng)M小時，再用二次蒸餾水洗滌至中性；加入15%戊二醛溶液反應(yīng)12小時，使其-NH2充分被C = O代替，并用二次蒸餾水洗滌至中性；將溶于磷酸鹽緩沖液的糖蛋白質(zhì)置于醛化后的大孔硅膠中，機械振蕩反應(yīng) 12小時，用二次蒸餾水多次洗滌，放置于4°C環(huán)境下疊氮鈉的磷酸鹽緩沖溶液中保存。將上面得到的糖蛋白手性固定相填充規(guī)格為4. 6X200mm的HPLC分析柱，在流動相為20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH = 4. 5)，流速lmL/min，室溫下分離谷氨酸對應(yīng)異構(gòu)體。結(jié)果如圖3所示，谷氨酸對應(yīng)異構(gòu)體得到良好分離。實施例2將聚酰胺溶于乙醇與異丙醇的混合溶液中，待完全溶解后，加入15%戊二醛溶液， 室溫攪拌反應(yīng)12小時后，用水洗滌至中性，真空烘干。得到的基質(zhì)內(nèi)孔直徑70納米。將溶于磷酸鹽緩沖液QOml，pH = 7. 4)的蛋白質(zhì)置于改性后的聚酰胺基質(zhì)中，機械振蕩使其充分反應(yīng)，用二次蒸餾水多次洗滌，最后將所得產(chǎn)物緩慢倒入正己烷中，析出沉淀，過濾，干燥。以上所述是本發(fā)明的兩種使用方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干該進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法，其特征在于在大孔固定相基質(zhì)外表面和孔內(nèi)表面同時鍵合蛋白質(zhì)分子制備成液相色譜手性固定相，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的內(nèi)孔通路，與孔內(nèi)表面修飾的蛋白質(zhì)分子作用，極大地提高柱容量，有效改善分 1 ；
2.如權(quán)利要求1所述的新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法，其特征在于所述的大孔基質(zhì)材料包括硅膠及聚酰胺類等高聚物；
3.如權(quán)利要求1所述的新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法，其特征在于大孔顆?；|(zhì)的外徑為5-50微米，內(nèi)孔的直徑為30-200納米；
4.如權(quán)利要求1所述的新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法，其特征在于用于固定相表面改性的蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、α 1-酸性白蛋白、卵類白蛋白、纖維二糖水解酶及其它蛋白；
5.如權(quán)利要求1所述的新型蛋白質(zhì)手性固定相，其特征在于可以用于液相色譜分離分析、毛細(xì)管電色譜分析以及制備液相色譜手性分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型蛋白質(zhì)手性固定相的制備方法。在大孔固定相基質(zhì)外表面和孔內(nèi)表面同時鍵合蛋白質(zhì)分子制備成液相色譜手性固定相，小分子手性樣品可以充分利用鍵合后的內(nèi)孔通路，與孔內(nèi)表面修飾的蛋白質(zhì)分子作用，極大地提高柱容量，有效改善分離?；|(zhì)可以為硅膠或高聚物，作為手性選擇器的蛋白質(zhì)可以根據(jù)分離選擇性的不同加以調(diào)節(jié)。本發(fā)明的優(yōu)點在于制作方法簡單，分離效率高。
文檔編號B01J20/29GK102553549SQ20111032785
公開日2012年7月11日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者喬月, 張凌怡, 張維冰, 鄭翌, 黃蘭淇 申請人:華東理工大學(xué)