專利名稱：一種突變的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變體蛋白領(lǐng)域，更具體地涉及一種與親本分子相比顯示出提高的穩(wěn)定性的突變體蛋白以及涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的突變體蛋白的方法。本發(fā)明也涉及一種親和性分離基質(zhì)，其中本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)被用作親和配體。
背景技術(shù)：
在生物技術(shù)和制藥工業(yè)中的大量的應(yīng)用需要廣泛關(guān)注污染物的嚴(yán)格去除。這些污染物可以是例如色譜分析方法中固定相或基質(zhì)吸附的非洗脫分子，諸如非目的的生物分子或微生物，包括例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、細(xì)菌和病毒。通常進(jìn)行目的產(chǎn)物的第一次洗脫之后從基質(zhì)去除這些污染物，以便在隨后的應(yīng)用之前再生基質(zhì)。此類去除通常包括被稱為就地清洗0ΠΡ)的方法，其中使用了能夠從固定相洗脫污染物的試劑。 通常使用的這類試劑為流經(jīng)所述固定相的堿性溶液。目前最廣泛使用的凈化和清潔試劑是 NaOH,且其濃度可依據(jù)污染的程度和本性在0. 1直至例如IM的范圍內(nèi)。已知NaOH是一種能實(shí)現(xiàn)多途徑地減少污染物諸如微生物、蛋白質(zhì)、脂類和核酸的有效CIP試劑。NaOH的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可以很容易地被去除而不用任何進(jìn)一步的處理。然而，此方案涉及將基質(zhì)暴露于超過(guò)13的pH值。對(duì)于許多含有蛋白親和配體的親和層析基質(zhì)來(lái)說(shuō)，這樣的堿性環(huán)境是非常粗糙的條件，并且因此由于配體對(duì)所涉及的高PH值的不穩(wěn)定性而導(dǎo)致了基質(zhì)能力的降低。因此廣泛的研究集中于開(kāi)發(fā)對(duì)堿性pH值具有增大的耐受能力的基因工程蛋白質(zhì)配體。例如，Gulich等(Susanne Gulich,MartinLinhult,Per-ikeNygren,Mathias Uhlen, Sophia Hober，Journal ofBiotechnology 8(^2000)，169-178 對(duì)堿性條件的穩(wěn)定性可被工程改造到蛋白配體中)提出通過(guò)蛋白質(zhì)工程來(lái)增加結(jié)合鏈球菌白蛋白的結(jié)構(gòu)域(ABD) 在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定特性。以前，人們表明了天冬酰胺和谷氨酰胺殘基在堿性條件下的結(jié)構(gòu)修飾，諸如肽主鏈的脫酰胺化和裂解是在堿性溶液處理后活性損失的主要原因，且天冬酰胺是兩個(gè)中最敏感的(Geiger，Τ.，和S.Clarke. 1987.肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰殘基的脫酰胺化、異構(gòu)化和外消旋作用。J. Biol. Chem. 262 :785-794)。已知脫酰胺化速率是高度特異性和構(gòu)象依賴的(Kosky，Α. A.，U. 0. Razzaq, M. J. Treuheit, ^P D. N. Brems. 1999. α-螺旋對(duì)天冬酰胺殘基穩(wěn)定性的影響不同螺旋性的肽中的脫酰胺化速率。Protein Sci. 8 =2519-2523 ；Kossiakoff，Α. A. 1988.三級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白脫酰胺化的主要決定因素。 Science. 240 :191-194 ；和Lura, R.，和V. Schirch. 1988.肽的構(gòu)象在天冬酰胺酰殘基的脫酰胺化速率和機(jī)制中的作用。Biochemistry. 27 :7671-7677)，且最短的脫酰胺化的半衰期與序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-絲氨酸相關(guān)。相應(yīng)地，Giilich等人創(chuàng)造了一種ABD的突變體，其中天然ABD的所有四個(gè)殘基已被亮氨酸(一個(gè)殘基)，天冬氨酸(兩個(gè)殘基)和賴氨酸(一個(gè)殘基)所替代。此外，Giilich等人報(bào)道了他們的突變體顯示出類似于天然蛋白的靶蛋白結(jié)合特性，而且含有工程改造的配體的親和層析柱在重復(fù)暴露于堿性條件之后，比利用父本的非工程改造的配體制備的柱顯示出較高的結(jié)合能力。因此，斷定其中的所有四個(gè)天冬酰胺殘基可被替代而對(duì)結(jié)構(gòu)和功能沒(méi)有任何顯著的影響。因此，Giilich等人針對(duì)結(jié)合鏈球菌白蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了研究。然而，親和層析也用于純化其它分子諸如例如用于藥物應(yīng)用的免疫球蛋白的操作流程中。一類特別有趣的親和性試劑是能夠特異性結(jié)合于抗體分子的不可變部分的蛋白質(zhì)，此類相互作用不依賴于抗體的抗原結(jié)合特異性。此類試劑可廣泛地用于通過(guò)親和性色譜層析從不同的樣品諸如但不限于獲自原種的血清或血漿制品或細(xì)胞培養(yǎng)物中回收免疫球蛋白。此蛋白的一個(gè)實(shí)例為含有能夠結(jié)合于來(lái)自不同種的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的結(jié)構(gòu)域的葡萄球菌蛋白 A0基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的試劑取決于其高度的親和性和選擇性在生物技術(shù)領(lǐng)域找到了廣泛的應(yīng)用，例如，用在捕獲和純化以及檢測(cè)抗體的親和層析中。目前，基于SpA 的親和性培養(yǎng)基可能是最廣泛應(yīng)用的從不同樣品包括來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的工業(yè)原料來(lái)分離單克隆抗體及其片段的親和性培養(yǎng)基。因此，含有蛋白A-配體的不同基質(zhì)可市售得到，例如以天然蛋白 A 的形式(例如，Protein A Sepharose, AmershamBiosciences, Uppsala, 瑞典)且也包括以重組蛋白質(zhì)A(例如，ProteinA Sepharose, Amersham Biosciences, Uppsala，瑞典)的形式市售的。更具體地，在所述商品化的重組蛋白質(zhì)A產(chǎn)物上進(jìn)行的遺傳操作的目的在于促進(jìn)其對(duì)載體的附著。因此，在此領(lǐng)域需要獲得能夠結(jié)合免疫球蛋白的蛋白配體，特別是通過(guò)其Fc-片段結(jié)合免疫球蛋白的蛋白配體，這些蛋白配體也對(duì)一種或多種利用堿性試劑的凈化方法有耐性。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種突變的免疫球蛋白結(jié)合蛋白配體，其在增加的pH 值下顯示出提高的穩(wěn)定性，因此與親本分子相比對(duì)在堿性條件下的凈化有提高的耐性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這樣的一種蛋白配體，其特異性地結(jié)合于免疫球蛋白諸如IgG, IgA和/或IgM的Fc-片段。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種如上所述的蛋白配體，其在堿性條件下比親本分子顯示出能保持較長(zhǎng)時(shí)間的親和性。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種親和性分離基質(zhì)，其含有能夠優(yōu)選地通過(guò)它們的 Fc-片段結(jié)合免疫球蛋白諸如IgG、IgA和/或IgM的突變蛋白配體，這些配體與親本分子的配體相比在堿性條件下顯示出提高的耐性。上述所限定的一或多個(gè)目的可通過(guò)所附的權(quán)利要求書(shū)來(lái)實(shí)現(xiàn)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了 SpA的5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(E，D，A，B和C)的氨基酸比對(duì)。圖2(a)和(b)說(shuō)明了在對(duì)本發(fā)明的突變蛋白進(jìn)行堿處理(原位清洗)之后獲得的與不穩(wěn)定的蛋白Z相比較的結(jié)果。圖3顯示了如實(shí)施例4(a)所述在插入載體中之后編碼Z (N23T/N3AN6D)-Cys的基因。
圖4顯示了實(shí)施例4(a)所述的質(zhì)粒pAY91的質(zhì)粒圖譜。圖5顯示了如實(shí)施例4(b)所述在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3A/N6D)的基因。圖6顯示了實(shí)施例5所述質(zhì)粒ρΑΥΙΟΟ的質(zhì)粒圖譜的實(shí)例。圖7顯示了根據(jù)實(shí)施例6的用于將KpnI-位點(diǎn)導(dǎo)入到具有SPA啟動(dòng)子和信號(hào)序列的載體中的銜接子。圖8顯示了如實(shí)施例6所描述的質(zhì)粒PAY104，其含有用于導(dǎo)入含有KpnI-位點(diǎn)的銜接子的SPA啟動(dòng)子和信號(hào)序列。圖9顯示了根據(jù)實(shí)施例6在插入銜接子之后產(chǎn)生的質(zhì)粒pAY128。圖10顯示了實(shí)施例6的構(gòu)建的克隆盒，其中在原始的銜接子下加了下劃線。圖11顯示了如實(shí)施例6所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚體之后的質(zhì)粒 PAY114。圖12顯示了實(shí)施例7的構(gòu)建的克隆盒，其中在原始的銜接子下加了下劃線。圖13顯示了根據(jù)實(shí)施例7在插入銜接子之后產(chǎn)生的質(zhì)粒pAY129。圖14顯示了如實(shí)施例7所述在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚體-Cys之后的質(zhì)粒 pAY1250圖15為實(shí)施例8所述的通過(guò)分離人IgG(hlgG)而獲得的色譜圖。圖16顯示了表示實(shí)施例8的基質(zhì)的保持動(dòng)態(tài)的結(jié)合能力的圖表。術(shù)語(yǔ)“蛋白”在此處用來(lái)描述蛋白質(zhì)及其片段。因此，具有三維結(jié)構(gòu)的氨基酸的任意鏈也包括在術(shù)語(yǔ)“蛋白”中，相應(yīng)地也包括蛋白片段。術(shù)語(yǔ)蛋白的“功能性變體”是指一種變異的蛋白，其中與本發(fā)明定義的親和性和穩(wěn)定性有關(guān)的功能基本上被保持。因此，一個(gè)或多個(gè)與所述功能不相關(guān)的氨基酸可被替換。術(shù)語(yǔ)“親本分子”是指以在導(dǎo)入本發(fā)明的突變之前的形式存在的相應(yīng)蛋白。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性”是指分子的三維形式的完整性，而“化學(xué)穩(wěn)定性”是指承受化學(xué)降解的能力。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合Fc片段的”蛋白是指該蛋白能夠結(jié)合于免疫球蛋白的Fc片段。然而， 其沒(méi)有排除結(jié)合Fc片段的蛋白也可以結(jié)合其它的區(qū)區(qū)域，諸如免疫球蛋白的Fab區(qū)域。在本說(shuō)明書(shū)中，若非引用其全稱，氨基酸被用常規(guī)的單字碼符號(hào)來(lái)表示。突變通過(guò)交換位置的編號(hào)來(lái)定義，前面是野生型或非突變的氨基酸，后面是突變的氨基酸。因此，例如，在位置23處的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸被表示為N23T。發(fā)明詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種能夠結(jié)合于免疫球蛋白分子的除互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 之外的其它區(qū)域的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，其中親本的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的至少一個(gè)天冬酰胺殘基已突變?yōu)槌斯劝滨０分獾陌被?，與親本分子相比該突變賦予了增加的在堿性PH值下的化學(xué)穩(wěn)定性。增加的穩(wěn)定性是指突變蛋白對(duì)于免疫球蛋白的初始親合力基本上被保持所持續(xù)的一段時(shí)間，如下面將要討論的。通過(guò)本發(fā)明獲得的對(duì)于靶蛋白的保留的親合力在某種程度上取決于保留的突變體蛋白的空間構(gòu)象。突變蛋白質(zhì)對(duì)免疫球蛋白的親合力可以例如由技術(shù)人員利用生物傳感器技術(shù)通過(guò)例如Biacore 2000標(biāo)準(zhǔn)裝備(Biacore AB, Uppsala，瑞典)來(lái)測(cè)定，如將在以下實(shí)驗(yàn)部分所描述的。在上下文中，可以理解術(shù)語(yǔ)“基本上”保持是指突變蛋白顯示出具有與親本分子同一數(shù)量級(jí)的對(duì)于免疫球蛋白的親合力。相應(yīng)地在初始階段，突變蛋白的結(jié)合能力與親本分子的相當(dāng)。然而，由于下面所討論的突變蛋白的在時(shí)間上保持化學(xué)穩(wěn)定性，其所保持的結(jié)合能力將比在堿性環(huán)境中的親本分子的結(jié)合能力更緩慢地減少。環(huán)境可以被定義為堿性的，意思是增加的PH值，例如高于大約10，諸如最高達(dá)大約13或14，即10-13或 10-14通常表示堿性的條件?；蛘撸瑮l件可通過(guò)NaOH的濃度來(lái)定義。其可最高達(dá)大約1. 0M， 諸如0. 7M或特別是大約0. 5M，相應(yīng)地在0. 7M-1. OM的范圍內(nèi)。本發(fā)明的突變蛋白的增加的化學(xué)穩(wěn)定性可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地證實(shí)，例如通過(guò)用NaOH以0. 5M濃度進(jìn)行常規(guī)處理，如下面實(shí)驗(yàn)部分所描述的。在此上下文中，可以理解與上所述類似地，“增加的”穩(wěn)定性是指與親本分子相比初始穩(wěn)定性被保持較長(zhǎng)的一段時(shí)間。盡管人們已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于結(jié)合鏈球菌白蛋白的結(jié)構(gòu)域的類似的突變(Gulich等人， 同上)，然而眾所周知與在堿性環(huán)境中降解的蛋白敏感性有關(guān)的脫酰胺化的速率是高度序列和構(gòu)象依賴的。由于ABD的氨基酸序列與免疫球蛋白-結(jié)合蛋白諸如單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域葡萄球菌蛋白A沒(méi)有氨基酸序列相似性，其不會(huì)出現(xiàn)好象Gulich等人的教導(dǎo)也可應(yīng)用于免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的情況。然而，本發(fā)明第一次表明了免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基的突變令人驚訝地提供了增加的化學(xué)穩(wěn)定性以及在PH大于大約10，諸如最高達(dá)大約13或14的環(huán)境中的降低的降解速率。因此，本發(fā)明提供了一種突變蛋白，其是有用的，例如作為蛋白配體用于選擇性地吸附免疫球蛋白，諸如來(lái)自哺乳動(dòng)物種類諸如人的IgG，IgA和/或IgM，優(yōu)選地為IgG的親和層析中。吸附的目的可用于產(chǎn)生純化產(chǎn)物，諸如純的免疫球蛋白組分或來(lái)自已經(jīng)除去免疫球蛋白的液體，或用于檢測(cè)樣品中免疫球蛋白的存在。本發(fā)明的配體顯示出足以耐受常規(guī)的堿洗達(dá)較長(zhǎng)的一段時(shí)間的化學(xué)穩(wěn)定性，這使得該配體成為用于再生柱所必需的有成本效益的大規(guī)模操作的有吸引力的候選物。相應(yīng)地，在本發(fā)明的蛋白中，一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺(N)殘基已經(jīng)突變?yōu)檫x自由下列氨基酸組成的組的氨基酸甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸 (I)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、精氨酸(I )、組氨酸(H)、賴氨酸(K)或脯氨酸(P)，或任意經(jīng)修飾的對(duì)不希望的脫酰胺化和異構(gòu)化不敏感的氨基酸。可選擇地，一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺(N)殘基已突變?yōu)楣劝滨０?Q)。免疫球蛋白-結(jié)合蛋白可以是任意的具有天然免疫球蛋白-結(jié)合能力的蛋白， 諸如葡萄球菌蛋白A(SpA)或鏈球菌G蛋白(SpG)。為了回顧其它的此種蛋白，參見(jiàn)例如 Kaonvall, G.，Jonsson, K. Receptins 用于對(duì)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)具有結(jié)合特性的天然的和工程改造的微生物蛋白的展開(kāi)譜的新的術(shù)語(yǔ)，J. Mol. Recognit. 1999Jan-Feb ；12(1) =38-44, 綜述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為一種突變蛋白，其至少包括免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域并且其中在所述區(qū)域內(nèi)存在至少一個(gè)此種天冬酰胺突變。相應(yīng)地，在此實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白包括至少大約75%，諸如至少大約80%或優(yōu)選地至少大約95%的 SEQ ID NO. 1或2的序列，條件是在位置21處沒(méi)有天冬酰胺突變。在本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中，SEQ ID NO 1限定了 SpA的B-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，而SEQID NO 2限定了被稱為Z蛋白的蛋白。Z蛋白是獲自SpA的B-結(jié)構(gòu)域的合成的構(gòu)建體，其中在位置四的甘氨酸已替換為丙氨酸，且已公開(kāi)在文獻(xiàn)中，參見(jiàn)例如Mahl等人，1999 生物技術(shù)中的親和性融合關(guān)注 A蛋白和G蛋白，生物方法技術(shù)百科全書(shū)發(fā)酵，生物催化和生物分離。M. C. Fleckinger和 S. W. Drew, editors. John Wiley 和 Sons Inc. ,New York, 8-22 此外，蛋白 Z 被用作親和層析中的配體。然而，盡管蛋白Z與SpAB-結(jié)構(gòu)域相比對(duì)除了 NaOH之外的某些化學(xué)試劑顯示出增加的化學(xué)穩(wěn)定性，但是，其在增加的PH值的條件下仍然是不穩(wěn)定的，不能滿足經(jīng)濟(jì)工廠中所期望的許多CIP再生步驟的需求。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述的突變蛋白含有SEQ ID NO 1或2的氨基酸序列，或是其功能性變體。在上下文中的術(shù)語(yǔ)“功能性變體”包括任意類似的序列，其包括在增加PH值的環(huán)境中在不影響突變體蛋白對(duì)免疫球蛋白的親合力或其增加的化學(xué)穩(wěn)定性的氨基酸位置上的一或多個(gè)其它的變化。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變選自由N23T ；N23T和N43E ；N28A ；N6A ； NllS ；NllS和N23T以及N6A和N23T組成的組；且其中親本分子包括由SEQ ID NO 2所限定的序列。如上所述，為了獲得對(duì)于作為在堿性條件中具有長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的高度結(jié)合能力的配體有用的突變體蛋白，避免使位置21處的天冬酰胺殘基突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置3處的天冬酰胺殘基沒(méi)有突變。在最有利的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的蛋白中，位于亮氨酸殘基和谷氨酰胺殘基之間的天冬酰胺殘基已突變?yōu)槔缣K氨酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，序列SEQ ID NO 2 的位置23處的天冬酰胺殘基已突變?yōu)槔缣K氨酸殘基。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，序列 SEQ ID NO 2的位置43處的天冬酰胺殘基也已經(jīng)突變?yōu)槔绻劝彼?。在該?shí)施方案中，其中氨基酸43已經(jīng)突變，其看起來(lái)最有利地與至少一個(gè)其它的突變，諸如N23T相結(jié)合。本發(fā)明的關(guān)于可以認(rèn)為SpA和蛋白Z的B-結(jié)構(gòu)域的不同天冬酰胺殘基對(duì)突變蛋白的親合力和穩(wěn)定性特性具有不同的貢獻(xiàn)的發(fā)現(xiàn)是完全出乎意料的，尤其由于上述討論的 Gulich等人的教導(dǎo)已斷定所有的ABD的天冬酰胺殘基可被突變而沒(méi)有任何內(nèi)在的差別。因此，本發(fā)明包括上述討論的單體突變體蛋白。然而，這種蛋白單體可結(jié)合為多聚體蛋白，諸如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等等。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種由至少一個(gè)本發(fā)明的突變體蛋白與一個(gè)或多個(gè)其它的單元，優(yōu)選地同樣為本發(fā)明的突變體蛋白組成的多聚體。因此，本發(fā)明是例如由兩個(gè)重復(fù)單元組成的二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚體包括通過(guò)優(yōu)選范圍為0到15個(gè)氨基酸，諸如 5-10個(gè)氨基酸的一段氨基酸序列連接的單體單元。這種連接的本性優(yōu)選地不破壞蛋白單元的空間構(gòu)象。此外，所述連接優(yōu)選地在堿性環(huán)境中同樣是充分穩(wěn)定的，不損害突變的蛋白單元的特性。在目前最好的實(shí)施方案中，多聚體是含有突變N23T的蛋白Z的四聚體，其中連接單元的長(zhǎng)度為5-10個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體含有序列VDAKFN-Z (N23T)-QAPK VDAKFN-Z (N23T) QAPKC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體含有序列VDAKFD-Z (N23T) -QAPKVDAK FD-Z (N23T) -ZQAI3KC。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，多聚體也含有一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌蛋白A的E，D，A，B， 和C結(jié)構(gòu)域。在此實(shí)施方案中，優(yōu)選位于環(huán)形區(qū)域的天冬酰胺殘基已經(jīng)突變?yōu)楦铀?穩(wěn)定的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有利的原因，SEQ ID NO. 1的位置四處的甘氨酸殘基也已經(jīng)突變，優(yōu)選地突變?yōu)楸彼釟埢?。同樣地，避免位?2處的天冬酰胺殘基的突變對(duì)于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也是有利的，因?yàn)槿藗円呀?jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)蛋白A分子的α -螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量有貢獻(xiàn)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及編碼上述突變體蛋白或多聚體的核酸。相應(yīng)地，本發(fā)明包括了可用于通過(guò)已建立的生物技術(shù)方法在重組的宿主中表達(dá)來(lái)生產(chǎn)突變體蛋白的 DNA序列。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種表達(dá)系統(tǒng)，其能夠產(chǎn)生上述的突變體蛋白。細(xì)菌宿主可被方便地用于下面所描述的實(shí)驗(yàn)部分中。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明為一種已被遺傳操作來(lái)表達(dá)本發(fā)明突變體蛋白的細(xì)胞系。用于實(shí)現(xiàn)此目的的方法，參見(jiàn)例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratoryv Manual (2nd ed)，vols. 1-3，Cold Spring HarborLaboratory, (1989)。當(dāng)然，一旦確定了目的序列，本發(fā)明的突變體蛋白可選擇地通過(guò)合成方法來(lái)生產(chǎn)。相應(yīng)地，本發(fā)明同樣包括生產(chǎn)本發(fā)明的突變體蛋白或多聚體的生物技術(shù)方法或合成方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于親合分離的基質(zhì)，該基質(zhì)含有包含與固相載體偶聯(lián)的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的配體，其中在該蛋白中的至少一個(gè)天冬酰胺殘基已突變?yōu)槌斯劝滨０分獾陌被?。本發(fā)明的基質(zhì)，當(dāng)與由作為配體的親本分子組成的基質(zhì)相比時(shí)，在兩種或多種利用間歇式堿洗分離的過(guò)程中顯示出增加的結(jié)合能力。突變的蛋白配體優(yōu)選地為結(jié)合Fc-片段的蛋白，并且可用于選擇性結(jié)合IgG、IgA和/或IgM，優(yōu)選IgG。本發(fā)明的基質(zhì)可含有如上所述的任意實(shí)施方案中作為配體的突變體蛋白。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在固相載體上的本發(fā)明的配體含有如上所述的多聚體。本發(fā)明的基質(zhì)的固相載體可以是任意合適的眾所周知的種類。常規(guī)的親和性分離基質(zhì)通常具有有機(jī)特性且基于將其親水性表面暴露于所用的水性介質(zhì)的聚合物，即將羥基-0H)、羧基(-C00H)、羧氨基(-CONH2,可以是N-取代的形式)、氨基(-NH2，可以是取代的形式)、寡-或聚氧化乙烯基團(tuán)暴露在它們的外表面上，如果存在，也暴露在內(nèi)表面上。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物可以例如基于多糖，諸如右旋糖酐、淀粉、纖維素、支鏈淀粉、瓊脂糖等等，有利地其已例如與雙環(huán)氧化物、表鹵醇、1，2，3_三鹵取代的低級(jí)烴交聯(lián)， 來(lái)提供合適的多孔性和剛性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相載體是多孔的瓊脂糖珠。本發(fā)明所用的載體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法很容易地制備，諸如反向懸浮液凝膠化(SHjerten =Biochim Biophys Acta 79 ( ，393-398 (1964)。可選擇的，基體基質(zhì)是市售的產(chǎn)品，諸如kpharose FF(AmershamBiosciences, Uppsala，瑞典)。在一個(gè)對(duì)于大規(guī)模的分離尤其有利的實(shí)施方案中，載體已被改造來(lái)增加其剛性，由此使得基質(zhì)更適用于高流速?？蛇x擇的，固相載體基于合成的聚合物，諸如聚乙烯醇、聚羥烷基丙烯酸酯、聚羥烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯等等。在為疏水性聚合物，諸如基于二乙烯基-和單乙烯基-取代苯的基質(zhì)的情況下，基質(zhì)的表面常常被親水化來(lái)將上述的親水基團(tuán)暴露于周圍的水性液體。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法很容易地生產(chǎn)此種聚合物，參見(jiàn)例如“通過(guò)懸浮聚合作用改進(jìn)基于聚合物載體的苯乙烯”(R ArshadyChimica e L' Industria70 (9), 70-75(1988))?？蛇x擇的，使用市售的產(chǎn)品，諸如 Source (Amersham Biosciences, Uppsala,瑞典)。
在另一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的固相載體含有具有無(wú)機(jī)特性的載體，例如硅石、氧化鋯等等。在又一個(gè)實(shí)施方案中，固相載體為其它的形式，諸如表面、芯片、毛細(xì)管或過(guò)濾器。關(guān)于本發(fā)明基質(zhì)的形狀，在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)為多孔整料的形式。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，基質(zhì)是以多孔的或無(wú)孔的珠子或粒子的形式。珠子或粒子形式的基質(zhì)可用作填充床或以懸浮的形式使用。懸浮的形式包括被稱為膨脹床和純的懸浮液的那些，其中粒子或珠子自由地移動(dòng)。在為整料，填充床和膨脹床的情況下，分離方法通常使用常規(guī)的帶有濃度梯度的層析分離法。在為純的懸浮液的情況下， 使用分批的方式。可以通過(guò)利用例如存在于配體中的氨基和/或羧基基團(tuán)的常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)將配體附著于載體。雙環(huán)氧化物、表氯醇、CNBr、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等等是公知的偶聯(lián)試劑。在載體和配體之間，可導(dǎo)入一種被成為間隔子的分子，其將會(huì)增加配體的有效性并促進(jìn)配體與載體的化學(xué)偶聯(lián)?？蛇x擇地，配體可通過(guò)非共價(jià)鍵，諸如物理吸附或生物特性的吸附附著于載體上。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，配體通過(guò)硫醚鍵與載體相偶聯(lián)。進(jìn)行這種偶聯(lián)的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和設(shè)備很容易地進(jìn)行。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，首先為配體提供一個(gè)用于隨后偶聯(lián)的末端半胱氨酸殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員同樣很容易地進(jìn)行合適的純化步驟。如上所述，對(duì)免疫球蛋白的親和性即配體的結(jié)合特性，從而也是基質(zhì)的容量在通過(guò)用堿性試劑處理時(shí)基本上沒(méi)有改變。通常，為了進(jìn)行親和性分離基質(zhì)的就地洗凈，所用的堿性試劑為NaOH且其濃度最高達(dá)0. 75M，諸如為0. 5M。因此，另一種表征本發(fā)明基質(zhì)的方式是，由于上述討論的突變，在用0. 5 MNaOH處理7.證之后，其結(jié)合能力將減少到小于大約70%，優(yōu)選地小于大約50%且更優(yōu)選的小于大約30%，例如大約為28%。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種分離免疫球蛋白，諸如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用了本發(fā)明的突變體蛋白、多聚體或基質(zhì)。因此，本發(fā)明包含了層析分離的方法，其中通過(guò)吸附于如上所述的突變體蛋白或多聚體或基質(zhì)來(lái)從液體中分離至少一種靶化合物。目的產(chǎn)物可以為分離的化合物或液體。因此，本發(fā)明在此方面涉及了親和層析，其是一種廣泛使用且眾所周知的分離技術(shù)。簡(jiǎn)言而之，在第一個(gè)步驟中，讓含有靶化合物，優(yōu)選為上述抗體的溶液，在允許靶化合物吸附到存在于所述基質(zhì)上的配體上的條件下流經(jīng)分離基質(zhì)。例如通過(guò)PH和/或鹽濃度即溶液中的離子強(qiáng)度來(lái)控制此條件。應(yīng)注意不要超過(guò)基質(zhì)的容量，即流動(dòng)應(yīng)充分地慢來(lái)允許進(jìn)行令人滿意的吸附。在此步驟中，溶液的其它組分將基本上不受阻礙地通過(guò)。任選擇地，然后洗滌基質(zhì)，例如用水溶液洗滌，來(lái)除去保留的和/ 或松馳結(jié)合的物質(zhì)。正如以上所討論的，通過(guò)利用堿性試劑的洗滌步驟基質(zhì)被最有利地利用。在下一步驟中，讓用作洗脫液的第二溶液在提供脫附作用即釋放靶化合物的條件下流經(jīng)該基質(zhì)。此條件通常通過(guò)改變PH、鹽濃度即離子強(qiáng)度、疏水性等等來(lái)提供。各種洗脫方式是已知的，諸如梯度洗脫和步進(jìn)式洗脫。也可以通過(guò)一種含有競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的第二溶液來(lái)提供洗脫，競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)將取代基質(zhì)上的目的抗體。親和層析原理的綜述，參見(jiàn)，例如Wilchek， Μ.，和 Chaiken, I. 2000。親和層析的概述，MethodsMol. Biol. 147 :1_6。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變體蛋白被用作該方法中的先導(dǎo)化合物，其中有機(jī)化合物被模型化而與其三維結(jié)構(gòu)相類似。此所謂的模型化合物被稱為模擬物。 模擬物的設(shè)計(jì)、合成和測(cè)試可用于避免隨機(jī)篩選大量的分子。簡(jiǎn)言之，此方法包括測(cè)定對(duì)于一種特性諸如對(duì)于結(jié)合免疫球蛋白關(guān)鍵的和重要的蛋白的特定部分。一旦鑒定了這些部分，就可以依據(jù)它的物理性能，例如立體化學(xué)、鍵、大小、電荷等，利用來(lái)自諸如分光技術(shù)、X 射線衍射數(shù)據(jù)和NMR的數(shù)據(jù)而將其結(jié)構(gòu)模型化。計(jì)算分析、相似性映射及其它技術(shù)可用于此方法。對(duì)于此方法的重要考慮是合成化合物的容易程度、藥學(xué)上可接受、體內(nèi)降解的模式等等。最后，本發(fā)明也包括上述突變體蛋白的其它應(yīng)用，諸如用于分析方法、用于醫(yī)學(xué)目的，例如用于診斷、陣列等等。附圖的詳細(xì)說(shuō)明圖1顯示了 SpA的五個(gè)同源性結(jié)構(gòu)域(E，D，A，B和C)的氨基酸比對(duì)。橫線表明氨基酸是相同的。三個(gè)方框顯示了 Tashiro及其同事測(cè)定的Zwt的α -螺旋(Tashiro等， 1997)。天冬酰胺殘基以及B結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)甘氨酸殘基被替換，在附圖中被加上了下劃線。同樣，也顯示了 Zwt和Z(Ν23Τ)的氨基酸比對(duì)。圖2(a)、2(b)說(shuō)明了在堿處理(就地清洗)之后本發(fā)明的突變體蛋白質(zhì)與去穩(wěn)定的蛋白Z與相比較的結(jié)果。在通過(guò)常規(guī)的親和層析方式進(jìn)行重復(fù)的CIP-處理之后的能力的比較。0.5M的NaOH用作洗凈劑。該方案進(jìn)行16輪次且每一輪用堿處理的持續(xù)時(shí)間為 30分鐘。圖2(a)顯示了 Z(F30A)及其變體的失活模式，而圖2 (b)顯示了 Zwt和Z(N23T) 的失活模式。圖3顯示了如實(shí)施例4(a)所述，在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。突變用*標(biāo)記。圖4顯示了實(shí)施例4(a)所述的質(zhì)粒pAY91的質(zhì)粒圖譜，其含有編碼實(shí)施例4 (a) 所述編碼Z (N23T/N3AN6D)-Cys的基因。圖5顯示了如實(shí)施例4(b)所述，在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3A/N6D)的基因。突變用*標(biāo)記。圖6顯示了實(shí)施例5中所述的表達(dá)四聚體Z (N23T/N3AN6D) -Cys的質(zhì)粒ρΑΥΙΟΟ的質(zhì)粒圖譜的實(shí)例。圖7顯示了根據(jù)實(shí)施例6的用于將KpnI-位點(diǎn)導(dǎo)入到具有SPA啟動(dòng)子和信號(hào)序列的載體中的銜接子。圖8顯示了如實(shí)施例6所述的質(zhì)粒PAY104，其含有用于導(dǎo)入含有KpnI-位點(diǎn)的銜接子的SPA啟動(dòng)子和信號(hào)序列。圖9顯示了根據(jù)實(shí)施例6在插入銜接子之后產(chǎn)生的質(zhì)粒pAY128。圖10顯示了實(shí)施例6構(gòu)建的克隆盒，其中原始的銜接子被加上了下劃線。圖11顯示了如實(shí)施例6所述，在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚體之后的質(zhì)粒 PAY114。圖12顯示了實(shí)施例7構(gòu)建的克隆盒，其中原始的銜接子被加上了下劃線。圖13顯示了根據(jù)實(shí)施例7，在插入銜接子之后產(chǎn)生的質(zhì)粒pAY129。圖14顯示了如實(shí)施例7所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚體-Cys之后的質(zhì)粒pAY1250圖15為獲自實(shí)施例8所述操作的色譜圖，其中第一個(gè)峰對(duì)應(yīng)于流通的材料，而第二個(gè)峰對(duì)應(yīng)于洗脫的hlgG。圖16顯示了實(shí)施例8的表示保持動(dòng)態(tài)結(jié)合能力的基質(zhì)的圖表。自上而下分別表示 Z (N23T/N3A/N6D) 二聚體 _Cys、Z (N23T/N3A) 二聚體 _Cys、Z (N23T) 二聚體-Cys 和 Z (N23T/ K4G) 二聚體-Cys。由于軟件問(wèn)題，缺少Z(N23T/N3A) 二聚體-Cys的最后兩個(gè)測(cè)定點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)部分在下面，將通過(guò)實(shí)施例的方式來(lái)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的而不應(yīng)被理解為對(duì)附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明范圍的限定。所有下面以及其它地方所給出的參考被通過(guò)引用在此合并。在此部分，由于原始形式的Z已具有顯著的但非充分的對(duì)堿處理的穩(wěn)定性，因此由于突變而引起的穩(wěn)定性的小的改變的假定將難以在實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中進(jìn)行評(píng)價(jià)。^￠$11 ^ ^ ' (Kotsuka, Τ, . S. Akanuma, Μ. Tomuro, Α. Yamagishi, 和Τ. Oshima. 1996，通過(guò)抑制基因突變的方法進(jìn)一步穩(wěn)定極端嗜熱的生物嗜熱棲熱菌的 3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶。JBacteriol. 178 :723-727 ；和 Sieber, V.，A. Pluckthun, 以及F. X. Schmidt. 1998，通過(guò)基于噬菌體的方法來(lái)選擇具有增加的穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。 NatureBiotechnology. 16 =955-960)被用來(lái)提供具有降低的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的Z結(jié)構(gòu)域的變體。根據(jù)此策略，Z蛋白的不穩(wěn)定變體，在這里表示為Z (F30A) (Cedergren等，1993，上述) 被用作支架來(lái)用于隨后導(dǎo)入與堿性穩(wěn)定性的研究相關(guān)的其它突變。此突變體的結(jié)合特性類似于天然蛋白Z，因?yàn)镕30不涉及Fc-結(jié)合。此外，Zwt表示野生型的Z結(jié)構(gòu)域不含有F30A取代。實(shí)驗(yàn)策略為了分析在堿性條件下造成不穩(wěn)定性的Z結(jié)構(gòu)域中的天冬酰胺，進(jìn)行了突變分析。為了能夠檢測(cè)ζ結(jié)構(gòu)域的堿性穩(wěn)定性的改善，決定利用一種突變的變體Z(F30A)，因?yàn)閆結(jié)構(gòu)域已具有對(duì)堿性條件顯著的但不充分的穩(wěn)定性。先前已經(jīng)顯示Z(F30A)具有對(duì) IgG的親和性也即類似于野生型的親和性，以及由于通常參與疏水核心的氨基酸的突變而具有顯著降低的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(Cedergren等，1993，同上文Jendeberg, L.，B. Persson, R. Anderson, R. Kar Is son, Μ. Uhlen，和 B. Nilsson. 1995，利用胞質(zhì)基因共振檢測(cè)蛋白 A 結(jié)構(gòu)域和人Fc之間相互作用的動(dòng)力學(xué)分析，Journal of Molecular Recognitiosl，8270-278)。 Z-結(jié)構(gòu)域?yàn)橛?8個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括八個(gè)天冬酰胺的3-螺旋束(N3，N6，mi，N21，N23， N28, N43 禾口 N52)(圖 1)(Nilsson, B.，T. Moks, B. Jansson, L. Abrahmsen, A. Elmblad, E. Holmgren, C. Henrichson, Τ. A. Jones，和 Μ. Uhlen, 1987，一種基于葡萄球菌蛋白 A 的合成的結(jié)合IgG的結(jié)構(gòu)域.Protein Eng. 1 :107-113)。為了評(píng)價(jià)在堿性條件下不同的天冬酰胺對(duì)失活率的影響，將其中的7個(gè)殘基替換為其它的氨基酸。因?yàn)镹3位于結(jié)構(gòu)域的柔性氨基末端，其被從研究中排除。假定這些氨基酸的降解不影響單體配體的活性并且因此在本分析中是不可檢測(cè)的，所述分析測(cè)定保留的活性。此外，因?yàn)榘被嵛挥诮Y(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)部分的外部，認(rèn)為其在結(jié)構(gòu)域的多聚化而獲得蛋白A類分子的過(guò)程中是容易被替換的。為了方便蛋白設(shè)計(jì)，人們進(jìn)行了來(lái)自蛋白A的其它結(jié)構(gòu)域的同源性序列的比較(附圖1) (Gulich等， 2000a)。從比較中可斷定，天冬酰胺11被替換為絲氨酸并且天冬酰胺23被替換為蘇氨酸最后天冬酰胺43被替換為谷氨酸。因?yàn)楫?dāng)注視同源序列時(shí)可替的是天冬氨酸，因此天冬酰胺6被替換為丙氨酸，也已報(bào)道天冬氨酸在堿性條件中是敏感的。蛋白A的所有五個(gè)結(jié)構(gòu)域在其它位置Ol二8，52)都具有天冬酰胺。因此，將它們替換為丙氨酸。^MM 1 突奪體蛋白z的i秀奪、表汰和鈍化材料和方法利用兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Higuchi等，1988)。將質(zhì)粒 PDHZF30A(Cedergren等，1993)用作模板。通過(guò)hteractiva合成編碼不同的天冬酰胺替換和M9G替換的寡核苷酸(Interactiva Biotechnologie GmbH，Ulm，德國(guó))。依據(jù) Sambrook描述的操作方式(Sambrook等，1987)，將限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII (MBI Fermentas Inc. , Amhurst, NY)用于克隆到載體 pDHZ (Jansson 等，1996)。為了產(chǎn)生 pTrpZ， 通過(guò)利用質(zhì)粒pKNIZ作為模板進(jìn)行PCR來(lái)擴(kuò)增Z結(jié)構(gòu)域(Nord等，1995)。用)(baI和I^stI 時(shí)片段進(jìn)行限制性酶切并連接到已用相同的酶進(jìn)行了限制性酶切的載體pTrpABDTlT2 中(Kraulis 等，1996)。使用 MegaBACE 1000 DNA 測(cè)序系統(tǒng)(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)來(lái)證明插入片段的正確序列。在基于雙脫氧法的循環(huán)測(cè)序方案中根據(jù)生產(chǎn)商的建議利用MegaBACE終止劑化學(xué)作用(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) (Sanger等，1977)。在克隆過(guò)程中，使用大腸桿菌菌株RR1AM15 (American Type Culture Collection, Rockville, MA)，而為了表達(dá)不同的基因產(chǎn)物則利用017(01sson, Μ. 0.，和 L. A. Isaksson. 1979.大腸桿菌中rpsD突變的分析。I 在核糖體蛋白S4.中具有不同變化的突變體的比較。Molec. gen. Genet. 169 :251-257)。根據(jù)GUlich描述的方案進(jìn)行Z(F30A)和不同構(gòu)建體的生產(chǎn)和純化(Gillich等， 2000b，參見(jiàn)上面)。根據(jù)Kraulis等人描述的規(guī)程進(jìn)行Z和pZ(N23T)的生產(chǎn)(Kraulis， P. J. , P. Jonasson, P. -L Nygren, Μ. Uhlen, L. Jendeberg, B. Nilsson,禾口 J. Korde 1. 1996,鏈球菌G蛋白的血清白蛋白-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種3-螺旋束異核NMR研究。FEBSlett. 378 190-194)。凍干相應(yīng)的組分。通過(guò)利用特定的吸光率系數(shù)在280納米處測(cè)定吸光率來(lái)估計(jì)蛋白的量，a (lg-1 cnT1)，Z 0. 156 ；Z(N23T) ,0. 169 ；Z(F30A)，Z(F30A，N43E)，Z(F30A, N23T, N43E)0. 157；Z(F30A, N6A)，Z(F30A，NlIS)，Z(F30A，N21A)，Z(F30A，N23T)，Z(F30A，N28A)， Z(F30A, N52A), Z(F30A, N6A, N23T)，Z(F30A, N11S, Ν23Τ)0· 158。通過(guò)氨基酸分析來(lái)確定濃度(BMC，Uppsala, Sweden) 0利用Wiast系統(tǒng)通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分析同質(zhì)性(Laemmli，U. K. 1970，結(jié)構(gòu)蛋白在噬菌體T4的頭部裝配過(guò)程中的裂解，Nature. 227 :680-685)。根據(jù)生產(chǎn)商的建議在還原條件下將凍干的蛋白裝載高密度凝膠 (AmershamBiosciences, Uppsala, Sweden)上并用用考馬斯亮藍(lán)染色。通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)一步證實(shí)同質(zhì)性和分子量。為了進(jìn)行CD光譜，在磷酸鹽緩沖液(8. ImM K2HPO4,1. 9mM KH2PO4, pH 7.5)中制備濃度為IOpM的蛋白樣品。利用J-720分光偏振計(jì)(JASC0，Tokyo, Japan)在路徑長(zhǎng)度為 0. Icm的石英小池中在室溫下以IOnm mirT1的掃描速度記錄250到200nm的遠(yuǎn)UV區(qū)域的光譜。每一光譜是五個(gè)累積掃描的平均數(shù)并且將最后的光譜轉(zhuǎn)化為平均殘基重疊率(MRE) (deg cm2 dmol 。結(jié)果(實(shí)施例1)所有的Z變體都在大腸桿菌中在37°C下成功地在胞內(nèi)產(chǎn)生并且顯示出相同的表達(dá)水平，由SDS-PAGE估計(jì)大約為50mg/l。通過(guò)IgG親和層析將蛋白完全純化。純化之后，用SDS-PAGE分析樣品(數(shù)據(jù)未顯示)，并且凍干和儲(chǔ)存來(lái)用于進(jìn)一步的分析。蛋白Z及其不同突變體的分子量同樣通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)證實(shí)。數(shù)據(jù)證實(shí)了所有突變體的正確的氨基酸含量(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，通過(guò)圓二色譜(CD)設(shè)備進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，因?yàn)樗郧耙驯蛔C明適用于檢測(cè)α-螺旋蛋白的結(jié)構(gòu)變化(Johnson，C. W，Jr. 1990.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和圓二色性應(yīng)用指導(dǎo)，Proteins. 7 :205-214 ；以及 Nord, K.，J. Nilsson, B. Nilsson, M.Uhlen，和P. - A.Nygren. 1995. α -螺旋細(xì)菌的受體結(jié)構(gòu)域的組合文庫(kù)，Prot. eng 8 601-608)。所有光譜都在208納米處和在222nm處顯示出最小值以及在195nm附近顯示出最大值，這表明了突變體和親本分子具有類似的結(jié)構(gòu)。然而，Z(F30A, N52A)似乎具有比野生型Z以及另一個(gè)突變體稍微較低的α-螺旋度(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例2 牛物特異件的相互作用分析材料和方法締合和解離狀態(tài)的親和性以及動(dòng)力學(xué)常數(shù)的差異被通過(guò)BiacOreTm2000裝置 (Biacore,Uppsala, Sweden)來(lái)檢測(cè)。根據(jù)生產(chǎn)商的建議，通過(guò)將胺偶合到CM5傳感器芯片 (Biacore)的羧基化的右旋糖酐層來(lái)固定人的多克隆IgG和HSA(陰性參照)。IgG的固定產(chǎn)生大約 2000RU。以 10 種不同的濃度(100-550nM)在 HBS(10mM HEPES，0. 15MNaCl,3. 4mM EDTA，0. 005%表面活性劑P20, pH 7. 4)中制備Ζ、ZF30A以及不同的突變體。以隨機(jī)順序和30 μ 1 miiT1的流速將樣品注射到表面作為復(fù)制本。使用IOmM的HCl來(lái)再生表面。利用 BIA評(píng)價(jià)3. 0. 2b軟件(BiacoreAB)分析數(shù)據(jù)。從IgG表面的信號(hào)中扣除用HSA固定的對(duì)照表面的信號(hào)。采用1 1蘭格繆爾模型并計(jì)算表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)和親和性常數(shù)。同樣，計(jì)算與天然分子相關(guān)的自由結(jié)合能(AAG = -RTln Kaff,fflUtanl/Kaff,native)的變化。結(jié)果(實(shí)施例2)為了測(cè)定Z變體對(duì)IgG的親和性的差異，利用Biacore進(jìn)行表面胞質(zhì)團(tuán)共振 (SPR)。目的是比較本發(fā)明的不同突變的Z變體的親和性與親本分子的親和性。如上所述， 由于親本Z的結(jié)構(gòu)域的高度堿性穩(wěn)定性，決定使用包括F30A突變的Z的結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定的變體 (Cedergren, L. , R. Andersson, B. Jansson, M. Uhlen,禾口 B. Nilsson. 1993.葡萄球菌蛋白 A 和人IgGl之間相互作用的突變分析，Proteineng. 6 :441-448)。因此，重要的是首先證實(shí)盡管發(fā)生了突變但是仍保留了突變分子和IgG之間親和性。從下表1可見(jiàn)，Z(F30A)的親和性沒(méi)有受到顯著的影響。親和性的細(xì)微的變化給Z(F30A)和IgG的復(fù)合物帶來(lái)了比親本分子Z和IgG稍微更高的穩(wěn)定性。這些與較早的Jendeberg等報(bào)道的結(jié)果(Cedergren等， 1993，同上Jendeberg等，1995，同上)一致。分析所有的用Z(F30A)作為支架構(gòu)建的突變體并與它們的親本分子(Z(F30A))相比較。結(jié)果顯示了總體上親和性沒(méi)有顯著地受突變的影響，表明了沒(méi)有一個(gè)本發(fā)明的天冬酰胺突變對(duì)于與IgG的結(jié)合是非常重要的(參見(jiàn)下表 1)。在包括N21A或N43E突變?cè)趦?nèi)的所有Z變體中，僅僅觀察到稍微較低的親合常數(shù)。對(duì)于具有N23T突變的突變體而言，令人驚訝地，其親和性甚至看上去稍微更高一些。同樣，在為N^A-突變的情況下，親和性的降低是細(xì)微的，并且如果突變用作例如蛋白配體，則不能期待其具有任意實(shí)質(zhì)的影響。此外，包括N28A-突變的所有構(gòu)建體具有顯著增加的關(guān)閉-速率。對(duì)于包括N23T突變的突變體而言，稍微增加的親和性似乎是由于增加的開(kāi)啟-速率的引起的。同樣，N6A-突變產(chǎn)生了較高的開(kāi)啟-速率，但因?yàn)殡S突變而生的還有增加的關(guān)閉-速率，因此親和性常數(shù)沒(méi)有受到影響。利用Biacore對(duì)不同Z的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的動(dòng)力學(xué)研究的概述。
權(quán)利要求
1.一種能夠結(jié)合于免疫球蛋白分子的除互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之外的其它區(qū)域的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白，其中SEQ ID NO. 1或2所定義的親本免疫球蛋白-結(jié)合蛋白或其功能性變體的至少一個(gè)天冬酰胺殘基，已經(jīng)突變?yōu)槌斯劝滨０分獾钠渌被?，與親本分子相比，該突變賦予了在堿性PH值下的提高的化學(xué)穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白，它是Fc片段-結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白，其中所述的突變選自由N23T；N23T和N43E ；N28A ；N6A ； mis ;mis和N23T ；以及N6A和N23T組成的組；并且其中親本分子含有SEQ ID NO. 2定義的序列。
4.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的蛋白，其中位置23處的天冬酰胺殘基已經(jīng)突變，優(yōu)選地突變?yōu)樘K氨酸殘基。
5.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的蛋白，其中位置43處的天冬酰胺殘基也已經(jīng)突變，優(yōu)選地突變?yōu)楣劝彼釟埢?br> 6.一種包含前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的突變蛋白單元的多聚體，其含有兩個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多聚體，其中所述的蛋白單元通過(guò)最高包含大約15個(gè)氨基酸的元件來(lái)連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的多聚體，它也含有一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和 C結(jié)構(gòu)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任意一項(xiàng)的多聚體，它是四聚體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的多聚體，其中每一蛋白單元為SEQIDN0.2定義的蛋白并且另外含有突變N23T。
11.一種編碼權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的蛋白或多聚體的核酸。
12.—種表達(dá)系統(tǒng)，其含有權(quán)利要求11的核酸。
13.一種用于親和層析的基質(zhì)，其中多個(gè)含有權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白的配體已偶聯(lián)于固相載體上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的基質(zhì)，其中所述的配體含有一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求6-10中任意一項(xiàng)的多聚體。
15.根據(jù)13或14的基質(zhì)，所述的其中配體已通過(guò)硫醚鍵偶聯(lián)于載體上。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任意一項(xiàng)的基質(zhì)，其中所述的載體是一種天然的聚合物質(zhì)， 例如多糖。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)的基質(zhì)，其提供了對(duì)選自由IgG、IgA和IgM組成的組，優(yōu)選IgG的免疫球蛋白的選擇性結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任意一項(xiàng)的基質(zhì)，在通過(guò)間歇式堿洗的兩次或更多次分離過(guò)程中，其中，所述的配體具有高于親本蛋白分子的結(jié)合容量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的基質(zhì)，其中所述的堿洗用NaOH來(lái)進(jìn)行，并且其濃度最高為大約 1M，例如大約為0. 5M。
20.一種分離免疫球蛋白，例如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的突變體蛋白或多聚體或權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)的基質(zhì)。
21.一種層析方法，其中通過(guò)吸附于權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的突變體蛋白或多聚體或權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)的基質(zhì)來(lái)從液體中分離至少一種靶化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白-結(jié)合蛋白，其中至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變?yōu)槌斯劝滨０坊蛱於彼嶂獾陌被?，與親本分子相比該突變?cè)趐H值最高達(dá)13-14時(shí)賦予了增加的化學(xué)穩(wěn)定性。蛋白可例如獲自能夠與免疫球蛋白分子的除互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之外的其它區(qū)域結(jié)合的蛋白，諸如蛋白A，且優(yōu)選地為葡萄球菌蛋白A的B-結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也涉及一種用于親和性分離的基質(zhì)，其含有作為偶聯(lián)于固相載體的配體免疫球蛋白-結(jié)合蛋白，在其中的蛋白配體中至少有一個(gè)天冬酰胺殘基已突變?yōu)槌斯劝滨０分獾陌被帷?br> 文檔編號(hào)B01J20/24GK102516372SQ20111040785
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者S·霍伯 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司