專利名稱：一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)檢驗和臨床分析技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法。
背景技術(shù)：
兒茶酚胺都是重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。兒茶酚胺含有鄰苯二酚基苯結(jié)構(gòu)，又名鄰苯二酚胺，包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺，主要分布于交感神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。兒茶酚胺是細(xì)胞體內(nèi)傳播神經(jīng)沖動的重要遞質(zhì)，具有重要的生理功能，與神經(jīng)活動、行為以及大腦皮層的醒覺和睡眠節(jié)律都有關(guān)系。例如，腎上腺素是哺乳動物和人類中樞神經(jīng)重要的信息傳遞物質(zhì)，是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺遞質(zhì)。在生物體內(nèi)， 腎上腺素控制著神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行一系列的神經(jīng)化學(xué)過程及生物反應(yīng)。在應(yīng)激狀態(tài)、內(nèi)臟神經(jīng)刺激和低血糖等情況下，腎上腺髓質(zhì)釋放腎上腺素進(jìn)入血液循環(huán)，促進(jìn)糖原分解并升高血糖，促進(jìn)脂肪分解，引起心跳加快。腎上腺素代謝障礙會引起其含量變化，從而導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。因此，準(zhǔn)確測定生物介質(zhì)中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，對基礎(chǔ)研究和臨床診斷都有重要的意義。目前，離體檢測兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，常用三羥基吲哚法、乙二胺縮合法、熒光法、 放射酶學(xué)法、高效液相色譜法、電分析化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、化學(xué)發(fā)光分析法和色質(zhì)聯(lián)用法。檢測兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的生物介質(zhì)一般為血液、唾液、尿液和羊水等。這些生物樣本中，兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量較低，一般在200-500pg/mL。另一方面，這些生物樣本中含有單胺氧化酶和氧位轉(zhuǎn)甲基酶，兒茶酚胺的胺基和兩個鄰位的酚羥基易被單胺氧化酶和氧位轉(zhuǎn)甲基酶降解。例如，尿樣中的兒茶酚胺被單胺氧化酶作用，去氨基后代謝為香草扁桃酸、高香草酸和3-甲氧基-4羥基苯乙二醇等。因此，在分析檢測前，常常對生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，去蛋白或加入蛋白阻隔劑。例如，常在血液中加入蛋白脲，以阻止兒茶酚胺以去氨基形式被代謝，其后再富集、提純、分離生物樣品中的兒茶酚胺。兒茶酚胺的提取、分離常采用液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。液-液萃取又稱溶劑萃取或抽提。用溶劑分離和提取液體混合物中的組分的過程。在液體混合物中加入與其不相混溶(或稍相混溶)的選定的溶劑，利用其組分在溶劑中的不同溶解度而達(dá)到分離或提取目的。但液液分離存在特異性差及耗時多等缺點，在分離提純上也有缺點。固相萃取技術(shù)基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進(jìn)行富集、 分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程。SPE是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理。較常用的方法是使液體樣品通過吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑洗脫被測物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出；或同時吸附雜質(zhì)和被測物質(zhì)，再使用合適的溶劑選擇性洗脫被測物質(zhì)。SPE裝置由SPE小柱(常用C18小柱)和輔件構(gòu)成。 提取、分離兒茶酚胺類物質(zhì)通常使用C18小柱液固。例如，測定尿液和血液中柳丁氨醇，使用C18小柱提取后用高效液相色譜檢測。雖然SPE小柱有許多優(yōu)點(如有機(jī)溶劑用量少、安全、高效等)，但在使用C18小柱洗脫時，SPE固相提純存在柱壓大、流速慢和時間長等缺點。這極可能導(dǎo)致不穩(wěn)定、易降解的兒茶酚胺在分離提純過程中大量降解，并且影響最終的檢測結(jié)果。由于液液萃取法和固相萃取法存在上述技術(shù)缺點，導(dǎo)致兒茶酚胺在分離提純過程大量分解，故有效的富集方法對于兒茶酚胺含量的準(zhǔn)確測量有著舉足輕重的作用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，該方法采用磁性納米顆粒表面的磺化殼聚糖來穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，利用磁性納米顆粒的磁分離功能，從生物介質(zhì)中分離和洗滌兒茶酚胺，過程簡單快速、成本低廉、富集率高。技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法， 其特征在于，該方法包括以下步驟10.制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟101、 102 和 103 101.制備磁性納米顆粒，該步驟包括步驟1011、1012和1013 1011.將摩爾比為2 1的Fe3+和Fe2+投料用濃度為2mol/L鹽酸溶液超聲攪拌溶解三氯化鐵，將鹽酸和三氯化鐵形成的混合溶液加入至反應(yīng)釜中，通入氮氣攪拌，形成三氯化鐵鹽酸溶液；再用濃度為2mol/L的鹽酸溶液超聲溶解硫酸亞鐵，形成硫酸亞鐵鹽酸溶液；將硫酸亞鐵鹽酸溶液與三氯化鐵鹽酸溶液混合攪拌，形成混合鐵鹽溶液；1012.將質(zhì)量百分比濃度為12. 5%的四甲基氫氧化銨水溶液加入步驟1011制備的混合鐵鹽溶液中，用蠕動泵攪拌，同時通入氮氣；然后進(jìn)行磁分離洗滌，得到黑色沉淀；1013.進(jìn)行氧化和表面修飾首先，用2mol/L的鹽酸溶液稀釋步驟1012制得的黑色沉淀，并調(diào)節(jié)PH值為3，超聲攪拌直至pH值穩(wěn)定；其后，將鹽酸溶液稀釋黑色沉淀后所形成的溶液加入反應(yīng)釜中進(jìn)行油浴加熱攪拌，反應(yīng)體系溫度為90°C，同時用空氣泵鼓入空氣， 進(jìn)行氧化反應(yīng)lh_5h，然后磁分離洗滌，從而制得磁性納米顆粒；102.制備表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟 1021、1022 和 1023 1021.用蒸餾水稀釋步驟101制備的位于反應(yīng)釜中磁性納米顆粒，形成磁性納米顆粒膠體溶液，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)該磁性納米顆粒膠體溶液的pH值為2. 7，超聲攪拌直至PH值穩(wěn)定；1022.按照磁性納米顆粒與2，3- 二巰基丁二酸的摩爾比1_1. 5，稱取2，3_ 二巰基丁二酸，將2，3- 二巰基丁二酸超聲溶解于二甲基亞砜溶液中，然后將溶解了 2，3- 二巰基丁二酸的二甲基亞砜溶液加入步驟1021制得的pH值為2. 7的磁性納米顆粒膠體溶液中，攪拌反應(yīng)lh-5h ；1023.步驟1022的攪拌反應(yīng)結(jié)束后，對步驟1022中溶有2，3_ 二巰基丁二酸和二甲基亞砜溶液的磁性納米顆粒膠體溶液進(jìn)行磁分離，形成含表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒的混合反應(yīng)溶液；用四甲基氫氧化銨水溶液調(diào)節(jié)該混合反應(yīng)溶液的PH為 10，超聲直至PH穩(wěn)定為10 ；然后將該混合反應(yīng)溶液的pH值調(diào)回為7，進(jìn)行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液；
103.先包覆后磺化，制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液該步驟包括步驟1031、1032和1033 1031.按照殼聚糖與鐵的重量比為2-8，在40-80°C的恒溫下，將殼聚糖溶解在體積比為-10%的醋酸水溶液中，攪拌至澄清，形成殼聚糖溶液；用水稀釋步驟1023制得的表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，形成表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液；1032.啟動攪拌機(jī)，將步驟1031制備的殼聚糖溶液加入步驟1031制備的表面包裹 2，3_ 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液中，持續(xù)攪拌a!-20h;然后磁分離、 用水洗滌后，加水磁分離16h-Mh ；將上層水倒掉，取出下層黑色粒子，在90-120°C烘干該黑色粒子6-12小時，該黑色粒子為表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒；1033.將步驟1032制備的表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒加入質(zhì)量百分濃度為 90-98%的硫酸溶液中，然后用攪拌機(jī)攪拌該硫酸溶液2-8小時后，用無水乙醇萃取一次， 再加入無水乙醇靜置6-20小時，吸出上清液后，向下層奶白色乳狀液體中加入重量百分濃度為10%的氫氧化鈉溶液，再用重量百分濃度為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6-9之間，形成磺化溶液；將該磺化溶液加水稀釋后，用離心機(jī)分離，下層絮狀物加水超聲溶解，得到表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液；20.穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，包括步驟201、202和203 201.用渦旋儀將步驟1033制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液渦旋，并超聲10-60min ；202.將生物介質(zhì)樣品溶液加入離心管，并加入100 μ L的步驟201制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，避光渦旋l-5min，超聲5-20min后再靜置10-60min， 形成待測混合溶液；203.將步驟202制得的待測混合溶液離心10_60min，轉(zhuǎn)速為9000_16000r/min，下層所沉積的黑色顆粒為富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒；30.洗脫步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒首先，將步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒進(jìn)行磁分離和水洗滌； 然后，使用洗脫劑于富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒中，用渦旋儀避光渦旋l_5min，用超聲儀超聲3-20min，靜置10_60min后，用離心機(jī)離心10_60min，轉(zhuǎn)速為9000_16000r/min，上清液進(jìn)樣含有洗脫的兒茶酚胺。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.利用磁性納米顆粒的磁分離功能，從生物介質(zhì)中分離和洗滌兒茶酚胺，過程簡單快速、成本低廉、富集率高。傳統(tǒng)的液固提取方法，使用二苯基硼酸(DPBA)和C18固相萃取柱。在C18柱表面填充二苯基硼酸來富集兒茶酚胺。在堿性條件下，DPBA-乙醇胺酯理解成帶負(fù)電的二苯基硼酸和乙醇胺，二苯基硼酸與兒茶酚胺上的鄰羥基形成帶負(fù)電的穩(wěn)定復(fù)合物且固著在C18柱上，富集率達(dá)到95%。本發(fā)明源于納米粒子表面的負(fù)電荷與兒茶酚胺的NH3+作用，這樣靜電吸附可實現(xiàn)富集，同時抑制以去氨基形式被代謝。磁性納米粒子富集兒茶酚胺原理在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下，溶液中的兒茶酚胺以NH3+-R形式存在；同時磁性納米顆粒表面帶大量的負(fù)電荷，二者主要通過靜電作用吸附，達(dá)到富集目的。本發(fā)明的方法利用磁性納米顆粒 HS03-CS_DMSA@MNPs 富集 NE、E 和 DA 的效率分別為 98. 7士3. 1%, 100. 0士2. 7%和97.0士4.3%，均高出傳統(tǒng)的液固提取方法的95%富集率。同時，相比傳統(tǒng)的液固提取方法，本發(fā)明的方法過程簡單快速、成本低廉。2.生物介質(zhì)中的兒茶酚胺穩(wěn)定性高。兒茶酚胺被富集的作用基團(tuán)不同，二苯基硼酸(縮寫DPBA)方法兒茶酚胺分子上的鄰羥基被作用，而磁性納米顆粒富集的作用部位是兒茶酚胺上的氨基。事實上，在生物樣本中，兒茶酚胺主要是以去氨基形式被代謝，即被單胺氧化酶作用代謝。如在尿樣中，兒茶酚胺去氨基代謝為香草扁桃酸(VMA)、高香草酸 (HVA)和3-甲氧基-4羥基苯乙二醇(HMPG)等。所以常常在分析檢測前去蛋白或加入蛋白阻隔劑。例如，蛋白脲常被加入血液中以阻止兒茶酚胺以去氨基形式被代謝。因此，按照本發(fā)明提供的方法，當(dāng)兒茶酚胺上的氨基通過靜電吸附作用固定在納米顆粒表面，兒茶酚胺被單胺氧化酶代謝的幾率相對減少，穩(wěn)定了生物樣本中的兒茶酚胺。表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒富集兒茶酚胺分子的穩(wěn)定性可達(dá)40小時以上。3.使用磁分離作為提純分離方法，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的提純富集兒茶酚胺方法有固相萃取法(SPE)和液液萃取法(LLE)。SPE提純過程使用萃取小柱時，后柱壓大、流速慢。液-液萃取(LLE)存在特異性差、耗時長和分離提純的純度不高等缺點。這些缺點對不穩(wěn)定易分解的兒茶酚胺分離帶來很多不便，且影響最終檢測結(jié)果。本發(fā)明使用的磁性納米顆粒具備尺寸小、比表面積大、懸浮穩(wěn)定性好、在外磁場作用下的可磁導(dǎo)向性運輸?shù)奶攸c，在物質(zhì)的富集和分離方面有著重要的優(yōu)勢。在富集和洗脫過程以磁分離的形式實現(xiàn)分離，省時且整個過程可避光。采用磁分離，從而克服了固相萃取法和液液萃取法缺點， 有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。


圖1是本發(fā)明試驗中合成的磁性納米顆粒(MNPs)的透射電鏡圖。圖2是圖1中磁性納米顆粒(MNPs)的粒徑分布圖。圖3是本發(fā)明試驗中合成的表面包覆2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSA0 MNPs)的透射電鏡圖。圖4是圖3中表面包覆2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSAOMNPs)的粒徑分布圖。圖5是本發(fā)明試驗中合成的表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)的透射電鏡圖。圖6是圖5中表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)的粒徑分布圖。圖7是本發(fā)明試驗中合成的三種磁性納米顆粒表面的kta電勢隨不同pH的變化曲線圖。圖中，矩形代表磁性納米顆粒(MNPs)，圓形代表表面包覆2，3_ 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSAOMNP s)，三角形代表表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒 (HS03-CS-DMSAiMNPs)。其中，kta電勢為零是等電點，表明顆粒表面無凈電荷。圖8是室溫條件下，富集于表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)的兒茶酚胺洗脫率隨時間的變化曲線，橫坐標(biāo)表示時間，單位h，縱坐標(biāo)表示脫附效率。其中，圓形代表對兒茶酚胺中的去甲腎上腺素(NE)的洗脫率，矩形代表對兒茶酚胺中的腎上腺素(E)的洗脫率，三角形代表對兒茶酚胺中的多巴胺(DA)的洗脫率。
圖9是100 μ L3. Og/L的表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@ MNPs)富集溶液中不同濃度的兒茶酚胺的富集率曲線，橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位ng/ mL，縱坐標(biāo)表示結(jié)合效率。其中，圓形代表對兒茶酚胺中的腎上腺素(E)的洗脫率，矩形代表對兒茶酚胺中的去甲腎上腺素(NE)的洗脫率，三角形代表對兒茶酚胺中的多巴胺(DA) 的洗脫率。圖10是人類唾液經(jīng)表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs) 富集，洗脫劑洗提后的高效液相色譜圖。其中，縱坐標(biāo)表示強(qiáng)度，單位微安，橫坐標(biāo)表示滯留時間，單位min。圖中位于上方的曲線表示濃度為lOOOng/ml的去腎上腺、腎上腺和多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰，位于下方的曲線表示唾液的色譜峰，其中有多巴胺的色譜峰。圖11是人類血液經(jīng)表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs) 富集，洗脫劑洗提后的高效液相色譜圖。其中，縱坐標(biāo)表示強(qiáng)度，單位微安，橫坐標(biāo)表示滯留時間，單位min。其中有多巴胺的色譜峰。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明。本發(fā)明使用的三種磁性納米粒子均以 Y-Fe2O3為納米核，分別是裸γ-F^O3粒子(縮寫為MNPs)、DMSA包裹的γ-!^2O3粒子(縮寫為DMSAOMNPs)和磺化殼聚糖(縮寫為CS)包裹的Y-Fii2O3粒子(縮寫為HS03-CS-DMSA@ MNPs)。本發(fā)明的一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，包括以下步驟10、20和 30。10.制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟101、 102 和 103。101.制備磁性納米顆粒，該步驟包括步驟1011、1012和1013。1011.將摩爾比為2 1的Fe3+和Fe2+投料用濃度為2mol/L鹽酸溶液超聲攪拌溶解三氯化鐵，將鹽酸和三氯化鐵形成的混合溶液加入至反應(yīng)釜中，通入氮氣攪拌，形成三氯化鐵鹽酸溶液；再用濃度為2mol/L的鹽酸溶液超聲溶解硫酸亞鐵，形成硫酸亞鐵鹽酸溶液。三氯化鐵中的Fe3+和硫酸亞鐵中的!^e2+的摩爾比為2 1。將硫酸亞鐵鹽酸溶液與三氯化鐵鹽酸溶液混合攪拌，形成混合鐵鹽溶液。1012.將質(zhì)量百分比濃度為12. 5%的四甲基氫氧化銨水溶液加入步驟1011制備的混合鐵鹽溶液中，用蠕動泵攪拌，同時通入氮氣；然后進(jìn)行磁分離洗滌，得到黑色沉淀。1013.進(jìn)行氧化和表面修飾首先，用2mol/L的鹽酸溶液稀釋步驟1012制得的黑色沉淀，并調(diào)節(jié)PH值為3，超聲攪拌直至pH值穩(wěn)定；其后，將鹽酸溶液稀釋黑色沉淀后所形成的溶液加入反應(yīng)釜中進(jìn)行油浴加熱攪拌，反應(yīng)體系溫度為90°C，同時用空氣泵鼓入空氣， 進(jìn)行氧化反應(yīng)lh_5h，然后磁分離洗滌，從而制得磁性納米顆粒。步驟101采用化學(xué)共沉淀法方法制備磁性納米顆粒四氧化三鐵(化學(xué)分子式 狗304)，反應(yīng)體系的濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、Fe2YFe3+的摩爾比值、堿溶液的加入時間和速度均對磁性納米顆粒的粒徑、形態(tài)、結(jié)構(gòu)及性能有很大影響。新制備的磁性納米顆粒四氧化三鐵，不穩(wěn)定，在溶液中容易被氧化。因此，在酸性條件下，把磁性納米顆粒四氧化三鐵氧化成穩(wěn)定的磁性納米顆粒可以有效解決磁性納米顆粒四氧化三鐵的穩(wěn)定性問題。本發(fā)明采用在酸性條件下通入空氣的方法對新制備的磁性納米顆粒四氧化三鐵進(jìn)行氧化。步驟1011 以及下面各步驟中提及的反應(yīng)釜可以是玻璃反應(yīng)釜。102.制備表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟 1021、1022 和 1023。1021.用蒸餾水稀釋步驟101制備的位于反應(yīng)釜中磁性納米顆粒，形成磁性納米顆粒膠體溶液，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)該磁性納米顆粒膠體溶液的pH值為2. 7，超聲攪拌直至PH值穩(wěn)定。1022.按照磁性納米顆粒與2，3-二巰基丁二酸的摩爾比1-1. 5，稱取2，3_ 二巰基丁二酸，將2，3- 二巰基丁二酸超聲溶解于二甲基亞砜溶液中，然后將溶解了 2，3- 二巰基丁二酸的二甲基亞砜溶液加入步驟1021制得的pH值為2. 7的磁性納米顆粒膠體溶液中，攪拌反應(yīng)lh-5h。1023.步驟1022的攪拌反應(yīng)結(jié)束后，對步驟1022中溶有2，3_ 二巰基丁二酸和二甲基亞砜溶液的磁性納米顆粒膠體溶液進(jìn)行磁分離，形成含表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒的混合反應(yīng)溶液；用四甲基氫氧化銨水溶液調(diào)節(jié)該混合反應(yīng)溶液的PH為 10，超聲攪拌直至PH穩(wěn)定為10 ；然后將該混合反應(yīng)溶液的pH值調(diào)回為7，進(jìn)行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液。在步驟102中，根據(jù)對兒茶酚胺的吸附要求，選用2，3-二巰基丁二酸(縮寫為 DMSA)作為分散劑，修飾在磁性納米顆粒的表面，有利于磁性液體的穩(wěn)定性。103.先包覆后磺化，制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液該步驟包括步驟1031、1032和1033。1031.按照殼聚糖與鐵的重量比為2-8，在40-80°C的恒溫下，將殼聚糖溶解在體積比為-10%的醋酸水溶液中，攪拌至澄清，形成殼聚糖溶液；用水稀釋步驟1023制得的表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，形成表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液。1032.啟動攪拌機(jī)，將步驟1031制備的殼聚糖溶液加入步驟1031制備的表面包裹 2，3_ 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液中，持續(xù)攪拌a!-20h;然后磁分離、 用水洗滌后，加水磁分離16h-Mh ；將上層水倒掉，取出下層黑色粒子，在90-120°C烘干該黑色粒子6-12小時，該黑色粒子為表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒。1033.將步驟1032制備的表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒加入質(zhì)量百分濃度為 90-98%的硫酸溶液中，然后用攪拌機(jī)攪拌該硫酸溶液2-8小時后，用無水乙醇萃取一次， 再加入無水乙醇靜置6-20小時，吸出上清液后，向下層奶白色乳狀液體中加入重量百分濃度為10%的氫氧化鈉溶液，再用重量百分濃度為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6-9之間，形成磺化溶液；將該磺化溶液加水稀釋后，用離心機(jī)分離，下層絮狀物加水超聲溶解，得到表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液。在步驟103中，基于表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒表面裸露的羧基，將高分子材料殼聚糖修飾到磁性納米顆粒表面?；腔瘹ぞ厶前驳拇判约{米顆粒的合成通過殼聚糖的包覆和殼聚糖包覆磁性納米顆粒的磺化兩步反應(yīng)來實現(xiàn)。表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒是本發(fā)明的特色。殼聚糖包覆在表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒表面的機(jī)理是磁性納米顆粒中的羧基與殼聚糖單體中的氨基作用。純高聚物狀態(tài)的殼聚糖磺化的機(jī)理如下在質(zhì)量百分濃度為90-98%的硫酸溶液中，常出現(xiàn)一級電離，電離成H+和-0S03H_，其中H+與殼聚糖的氨基很容易成陽離子，而-0S03H_又與殼聚糖氨基陽離子成鹽，在該硫酸存在下，此鹽很容易脫去一分子水，最后形成N上取代的磺酸根。但究竟是先磺化再包覆還是先包覆再磺化，這是本發(fā)明合成路徑的關(guān)鍵問題。本發(fā)明改進(jìn)了現(xiàn)存的殼聚糖表面包裹納米顆粒的合成方法，采用先包覆殼聚糖，再進(jìn)行磺化，最后合成了表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒。本發(fā)明先將殼聚糖磺化，再包覆納米顆粒。用醋酸溶液溶解殼聚糖，而后磺化；但磺化后的殼聚糖成果凍膠體狀，不易溶解。反復(fù)多次超聲溶解后，將澄清的磺化殼聚糖與表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒溶液混合攪拌4h，但所得磁性納米顆粒不能實現(xiàn)預(yù)期的富集作用。原因為兩點一，殼聚糖在醋酸溶液中的溶解行為時基于其脫乙酰作用，但磺化了的殼聚糖脫乙酰水平降低。雖在醋酸溶液中基本溶解，但對于納米級別的粒子，這種溶解度是不夠的，導(dǎo)致磺化殼聚糖未包覆到表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒上；二、殼聚糖磺化的基團(tuán)是氨基，而它包覆到表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒表面也是基于磁性納米顆粒中的羧基與殼聚糖單體中的氨基作用。前一步的磺化將殼聚糖高聚物上活潑的氨基己磺化，沒有剩余足夠的氨基作用到表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒上，導(dǎo)致磺化殼聚糖不能包覆上納米顆粒。本發(fā)明選擇先包覆后磺化。首先優(yōu)化殼聚糖與鐵的用量比需；若殼聚糖太過量，之后反復(fù)磁分離都不能除去剩余的，則這些殼聚糖會在干燥過程中將納米顆粒集結(jié)成塊，超聲也回不到均勻狀態(tài)，不能進(jìn)行下一步的磺化；若鐵過量，殼聚糖不能完全包覆納米顆粒， 功能基團(tuán)不能充分地聯(lián)結(jié)到顆粒表面，降低納米顆粒對兒茶酚胺的富集效率。包覆了殼聚糖的納米顆?；腔襟E也是整個合成的關(guān)鍵步驟。因為磁性納米顆粒的核是四氧化三鐵， 易被磺化使用的硫酸溶解。所以整個磺化步驟使用的儀器溶劑都必須確保無水狀態(tài)，一旦有水，濃硫酸被稀釋至稀硫酸，納米顆粒就被消解。同時，磺化過程中的攪拌速度必須要快， 最好能實現(xiàn)邊超聲邊攪拌，因為濃硫酸會有碳化作用，納米顆粒集結(jié)成塊不能均勻被磺化。 以上方法制備的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液均勻穩(wěn)定，在對兒茶酚胺的富集作用中也有良好表現(xiàn)。20.穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，包括步驟201、202和203。201.用渦旋儀將步驟1033制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液渦旋，并超聲10-60min。202.將生物介質(zhì)樣品溶液加入離心管，并加入100 μ L的步驟201制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，避光渦旋l-5min，超聲5-20min后再靜置10-60min， 形成待測混合溶液。203.將步驟202制得的待測混合溶液離心10_60min，轉(zhuǎn)速為9000_16000r/min，下
層所沉積的黑色顆粒為富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒。在步驟20中，兒茶酚胺在弱酸性條件下才能穩(wěn)定存在，其離解常數(shù)為8. 5 9. 5。 當(dāng)pH = 6. 0-7. 0時，兒茶酚胺分子在水溶液中電離生成NH3+-R。這時，表面包覆功能基團(tuán)的磁性納米顆粒表面存在大量的負(fù)電荷，主要通過靜電作用吸附兒茶酚胺，可能有殼聚糖的銨基團(tuán)間的氫鍵和聚合物鏈間的分子間作用力。30.洗脫步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒。
首先，將步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒進(jìn)行磁分離和水洗滌； 然后，使用洗脫劑于富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒中，用渦旋儀避光渦旋l_5min，用超聲儀超聲3-20min，靜置10_60min后，用離心機(jī)離心10_60min，轉(zhuǎn)速為9000_16000r/min，上清液進(jìn)樣含有洗脫的兒茶酚胺。在步驟30中，結(jié)合本發(fā)明磁性納米顆粒富集兒茶酚胺的實驗原理，洗脫實驗有以下三個策略加入強(qiáng)電解質(zhì)以離子替換；調(diào)節(jié)溶液PH值，改變磁性納米顆粒的表面電荷和改變?nèi)芤旱臉O性。洗滌固定在表面包覆磺化殼聚糖的磁性納米顆粒表面的兒茶酚胺，利用 PH值、溶液組成、極性不同于富集時的溶液(即洗脫劑)，打破上述納米顆粒與兒茶酚胺之間的靜電吸附平衡，析出」L茶酚胺。針對不同的生物介質(zhì)，使用不同的洗脫劑。對于洗脫從尿液或者羊水的生物介質(zhì)中富集的兒茶酚胺，使用的洗脫劑以水為溶劑，無機(jī)酸為溶質(zhì)。無機(jī)酸是鹽酸、硝酸和磷酸中的任意一種或者任意組合。對于洗脫從血液、唾液和腦脊液的生物樣品中富集的兒茶酚胺，使用的洗脫劑以有機(jī)極性溶劑和水的混合溶液為溶劑，以有機(jī)酸為溶質(zhì)。有機(jī)酸是二甲基亞砜、乙二醇、甲酸、乙酸和三氯乙酸中的任意一種或者任意組合。進(jìn)一步，在所述的步驟30之后，進(jìn)行液相色譜電化學(xué)檢測步驟使用液相色譜將兒茶酚胺與兒茶酚胺的代謝物等干擾物質(zhì)的色譜峰分離，并使用電化學(xué)檢測器進(jìn)行檢測， 用外標(biāo)法對洗脫的兒茶酚胺進(jìn)行定量檢測，檢測中的色譜條件為色譜柱C18色譜柱；流動相10-60mM檸檬酸，15-100mM磷酸二氫鈉，I-IOmM庚烷磺酸鈉；0. 05-0. 5mM 乙二胺四乙酸，體積比5. 0-7. 0%的乙腈，氫氧化鈉調(diào)pH = 3. 5-5. 5 ；流速為 0. 5-2. OmL/min ；柱溫為25_40°C ；進(jìn)樣量2-20 μ L ；電化學(xué)檢測器的工作電壓為0. 35-0. 7V ；操作時溫度20°C -25°C。下面通過試驗來說明采用本技術(shù)方案的效果。1.試驗試劑硫酸亞鐵溶液(FeSO4 ·7Η20)、三氯化鐵溶液(FeCl3 ·6Η20)、二甲基亞砜(DMSO)、濃鹽酸(HCl)、檸檬酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉均為分析純(AR)；四甲基氫氧化銨((CH3)4NOH) 純度為25% ；2，3_ 二巰基丁二酸(DMSA)純度彡99% ；標(biāo)準(zhǔn)品多巴胺(DA)、去甲腎上腺素 (NE)、腎上腺素(E)均為Sigma產(chǎn)品；乙腈、甲醇、殼聚糖為色譜純(CS)；乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-2Na)、磷酸二氫鈉、高氯酸、檸檬酸、三氯乙酸為分析純；庚烷磺酸鈉為HPLC專用試劑、分析純；實驗用水為三蒸水。2.試驗儀器試驗中使用的儀器均可以由市場購買。本試驗中使用的儀器包括超聲波清洗器， 由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)。透析袋，由上海泰伯經(jīng)營產(chǎn)品部銷售。電熱真空干燥箱， 由上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)。離心機(jī)，由德國Eppendorf公司生產(chǎn)。電子分析天平， 由奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)。透射電子顯微鏡(TEM)，由日本JEOL公司生產(chǎn)。kta電勢分析儀，由貝克曼公司生產(chǎn)?？諝獗茫烧憬瓕崢I(yè)有限公司生產(chǎn)。高效液相色譜系統(tǒng)，由日本島津LC-20AD高效液相色譜儀和島津L-ECD-6A電化學(xué)檢測器組成，該高效液相色譜系統(tǒng)包括 LC-20AD 雙泵，SIL-20AC 自動進(jìn)樣器，CT0-20A 柱溫箱和 Diamonsi C18 (150X4. 6mm， 5ym)不銹鋼柱。數(shù)據(jù)分析使用隨機(jī)附帶的島津高效液相色譜軟件包。實驗使用的色譜柱為 VP-ODS Dikma C18 (5 μ m，250mmX 4. 6mm)，流動相的 PH值用 Orion model SA 720PH計測定(Orion Research Incorporated, USA)。3.色譜條件流動相;35mM檸檬酸，45mM磷酸二氫鈉，6mM庚烷磺酸鈉；0. 25mM EDTA, 7.0% (ν/ ν)乙腈，NaOH調(diào)pH = 4. 15 ；流速為1. OmL/min ；柱溫為30°C ；電化學(xué)檢測器工作電壓為 0. 7V ；進(jìn)樣量20 μ L0測定操作在25°C進(jìn)行。4.試驗方法穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，該方法包括以下步驟10、20和30 10.制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟101、 102 和 103 101.制備磁性納米顆粒，該步驟包括步驟1011、1012和1013 1011.將摩爾比為2 1的!^3+和!^2+投料用200mL濃度為2mol/L鹽酸溶液超聲攪拌溶解54. 05g三氯化鐵，將鹽酸和三氯化鐵形成的混合溶液加入至3L反應(yīng)釜中，通入氮氣攪拌，形成三氯化鐵鹽酸溶液；再用50mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液超聲溶解27. 80g 硫酸亞鐵，形成硫酸亞鐵鹽酸溶液；將硫酸亞鐵鹽酸溶液與三氯化鐵鹽酸溶液混合攪拌，形成混合鐵鹽溶液；1012.將1. 25L質(zhì)量百分比濃度為12. 5%的四甲基氫氧化銨水溶液90s加入步驟 1011制備的混合鐵鹽溶液中，用蠕動泵攪拌，同時通入氮氣；然后進(jìn)行磁分離洗滌一次，得到黑色沉淀；1013.進(jìn)行氧化和表面修飾首先，稱取步驟1012制備黑色沉淀重量的一半，用水稀釋至5L，此時該溶液的濃度約為2g/L，然后用2mol/L的鹽酸溶液稀釋該溶液，并調(diào)節(jié)pH 值為3，超聲攪拌直至pH值穩(wěn)定；其后，將鹽酸溶液稀釋黑色沉淀后所形成的溶液加入反應(yīng)釜中進(jìn)行油浴加熱攪拌，反應(yīng)體系溫度為90°C，同時用空氣泵鼓入空氣，進(jìn)行氧化反應(yīng)5h， 然后磁分離洗滌一次，從而制得磁性納米顆粒；102.制備表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟 1021、1022 和 1023 1021.用蒸餾水稀釋步驟101制備的位于反應(yīng)釜中磁性納米顆粒，形成濃度為 1.2g/L的磁性納米顆粒膠體溶液，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)該磁性納米顆粒膠體溶液的pH值為2. 7，超聲攪拌直至pH值穩(wěn)定；1022.將1. 365g的2，3_ 二巰基丁二酸超聲溶解于50mL 二甲基亞砜溶液中，然后將溶解了 2，3- 二巰基丁二酸的二甲基亞砜溶液加入步驟1021制得的pH值為2. 7的磁性納米顆粒膠體溶液中，攪拌反應(yīng)B ；1023.步驟1022的攪拌反應(yīng)結(jié)束后，對步驟1022中溶有2，3_ 二巰基丁二酸和二甲基亞砜溶液的磁性納米顆粒膠體溶液進(jìn)行磁分離一次，形成含表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒的混合反應(yīng)溶液；用四甲基氫氧化銨水溶液調(diào)節(jié)該混合反應(yīng)溶液的 PH為10，超聲攪拌直至pH穩(wěn)定為10 ；然后將該混合反應(yīng)溶液的pH值調(diào)回為7，進(jìn)行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液；103.先包覆后磺化，制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液該步驟包括步驟1031、1032和1033 1031.在60°C的恒溫下，將1. 2g的殼聚糖溶解在60mL體積比為1 %的醋酸水溶液中，攪拌至澄清，形成殼聚糖溶液；用水稀釋步驟1023制得的表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，形成1. 5g/L的表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液；1032.啟動攪拌機(jī)，將步驟1031制備的殼聚糖溶液加入200mL步驟1031制備的表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液中，持續(xù)攪拌4h ；然后磁分離、用水洗滌兩次后，加水至1L，磁分離Mh ；將上層水倒掉，取出下層黑色粒子，在100°C烘干該黑色粒子12小時，該黑色粒子為表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒；1033.將步驟1032制備的表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒加入30mL質(zhì)量百分濃度為98%的硫酸溶液中，然后用攪拌機(jī)攪拌該硫酸溶液3小時后，用無水乙醇萃取一次，再加入無水乙醇靜置12小時，吸出上清液后，向下層奶白色乳狀液體中加入IOmL重量百分濃度為10 %的氫氧化鈉溶液，再用重量百分濃度為5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6-9之間，形成磺化溶液；將該磺化溶液加水稀釋后，用離心機(jī)分離，下層絮狀物加水超聲溶解，得到表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液；20.穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，包括步驟201、202和203 201.用渦旋儀將步驟1033制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液渦旋，并超聲20min ；202.將ImL的lOOng/mL生物介質(zhì)樣品溶液加入離心管，并加入100 μ L的步驟201 制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，避光渦旋lmin，超聲5min后再靜置 20min,形成待測混合溶液；203.將步驟202制得的待測混合溶液離心20min，轉(zhuǎn)速為16000r/min，下層所沉積的黑色顆粒為富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒；30.洗脫步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒首先，將步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒進(jìn)行磁分離和水洗滌； 然后，使用洗脫劑于富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒中，用渦旋儀避光渦旋lmin，用超聲儀超聲5min，靜置20min后，用離心機(jī)離心20min，轉(zhuǎn)速為16000r/min，上清液進(jìn)樣含有洗脫的兒茶酚胺。5.試驗結(jié)果采用透射電鏡表征了經(jīng)上述步驟制得的磁性納米顆粒(MNPs)、表面包裹2， 3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSAOMNPs)和表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒 (HS03-CS-DMSAiMNPs)三種磁性納米顆粒的形貌，如圖1_圖6所示。經(jīng)粒徑分布計算軟件統(tǒng)計，磁性納米顆粒直徑大小為7. 6 士4. 7nm，表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒直徑大小為9. 1 士4. Onm，表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒直徑大小為10. 0士5. 8nm。這表明磁性納米顆粒和表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒的修飾并沒有明顯改變磁性納米顆粒的粒徑。由圖7可知，磁性納米顆粒(MNPs)電位在pH值較低時為正，在pH值較高轉(zhuǎn)為負(fù)；磁性納米顆粒(MNPs)的等電點(IEP)為5.0。表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSAiMNPs)在pH = 3-10的范圍內(nèi)，Zeta電位都為負(fù)，且隨pH的增加，其負(fù)電位的絕對值越來越大。這說明雖然2，3-二巰基丁二酸(DMSA)與磁性納米顆粒(MNPs)的聯(lián)結(jié)是基于-COOH*!^的螯合作用，仍有硫醇基團(tuán)和一部分羧基裸露在納米顆粒表面。隨表面包裹磺化殼聚糖，磁性納米顆粒的^ta電位在pH值較低時為正，在pH值較高轉(zhuǎn)為負(fù)； 表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)的IEP為4. 2。這表明表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒表面DMSA的羧基或硫醇基被殼聚糖的氨基的全部鍵合；未被磺化的殼聚糖氨基裸露在表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)表面。此外，表面包裹殼聚糖和2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(縮寫為CS-DMSA@MNPs) 的IEP為8. 6，表面包裹殼聚糖的磁性納米顆粒(縮寫為CSOMNPs)的IEP (9. 6)，這是由于作為中間聯(lián)結(jié)的磁性納米顆粒(縮寫為DMSA)的部分未與納米顆粒鍵合的羧基或硫醇基， 抵消了部分殼聚糖氨基的正電荷?；腔氲幕撬峄黠@降低了納米顆粒表面的電位，導(dǎo)致 IEP 遞減，即 CSiMNPs > CS-DMSAiMNPs > HSO3-CS-DMSAiMNPSo當(dāng)pH > 6. 0時，磁性納米顆粒(MNPs)、表面包裹2，3_ 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒(DMSAOMNPs)和表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒(HS03-CS-DMSA@MNPs)三種磁性納米顆粒的kta電勢均為負(fù)值，即表面都帶負(fù)電荷；且負(fù)電勢絕對值的大小為 MNPs < DMSAiMNPs < HSO3-CS-DMSAiMNPSo 由于表面磺化引入磺酸，HS03-CS-DMSA@ MNPs的靜電吸附兒茶酚胺的能力較之DMSAOMWs和MNPs更為突出，如表1所示。以下提及的富集率和洗脫率分別為添加磁性納米顆?；蛳疵搫┖笊锨逡褐心繕?biāo)分子與標(biāo)準(zhǔn)溶液目標(biāo)分子的濃度差與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的比值。MNPs和DMSAOMNPs的富集率不到80%， HS03-CS-DMSAiMNPs表現(xiàn)出最高的富集率，對去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、多巴胺 (DA)的富集率均達(dá)到98%以上。這是由于當(dāng)pH> 6.0時，兒茶酚胺分子在水溶液中電離生成NH3+-R(pKb = 8. 5 9. 5)，故納米顆粒表面越呈電負(fù)性，二者越易靜電吸引。表IpH = 7. 0時，所制備的三種磁性納米顆粒富集兒茶酚胺的富集率
權(quán)利要求
1. 一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟101、102和103 制備磁性納米顆粒，該步驟包括步驟1011、1012和1013 .1011.將摩爾比為2:1的!^3+和!^2+投料用濃度為2mol/L鹽酸溶液超聲攪拌溶解三氯化鐵，將鹽酸和三氯化鐵形成的混合溶液加入至反應(yīng)釜中，通入氮氣攪拌，形成三氯化鐵鹽酸溶液；再用濃度為2mol/L的鹽酸溶液超聲溶解硫酸亞鐵，形成硫酸亞鐵鹽酸溶液；將硫酸亞鐵鹽酸溶液與三氯化鐵鹽酸溶液混合攪拌，形成混合鐵鹽溶液；.1012.將質(zhì)量百分比濃度為12.5%的四甲基氫氧化銨水溶液加入步驟1011制備的混合鐵鹽溶液中，用蠕動泵攪拌，同時通入氮氣；然后進(jìn)行磁分離洗滌，得到黑色沉淀；.1013.進(jìn)行氧化和表面修飾首先，用2mol/L的鹽酸溶液稀釋步驟1012制得的黑色沉淀，并調(diào)節(jié)PH值為3，超聲攪拌直至pH值穩(wěn)定；其后，將鹽酸溶液稀釋黑色沉淀后所形成的溶液加入反應(yīng)釜中進(jìn)行油浴加熱攪拌，反應(yīng)體系溫度為90°C，同時用空氣泵鼓入空氣， 進(jìn)行氧化反應(yīng)1 h —5h，然后磁分離洗滌，從而制得磁性納米顆粒；制備表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括步驟1021、 1022 和 1023 .1021.用蒸餾水稀釋步驟101制備的位于反應(yīng)釜中磁性納米顆粒，形成磁性納米顆粒膠體溶液，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)該磁性納米顆粒膠體溶液的PH值為2. 7，超聲攪拌直至pH 值穩(wěn)定；.1022.按照磁性納米顆粒與2，3-二巰基丁二酸的摩爾比1一 1. 5，稱取2，3- 二巰基丁二酸，將2，3- 二巰基丁二酸超聲溶解于二甲基亞砜溶液中，然后將溶解了 2，3- 二巰基丁二酸的二甲基亞砜溶液加入步驟1021制得的pH值為2. 7的磁性納米顆粒膠體溶液中，攪拌反應(yīng)Ih—5h ；.1023.步驟1022的攪拌反應(yīng)結(jié)束后，對步驟1022中溶有2，3-二巰基丁二酸和二甲基亞砜溶液的磁性納米顆粒膠體溶液進(jìn)行磁分離，形成含表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒的混合反應(yīng)溶液；用四甲基氫氧化銨水溶液調(diào)節(jié)該混合反應(yīng)溶液的PH為10，超聲直至PH穩(wěn)定為10 ；然后將該混合反應(yīng)溶液的pH值調(diào)回為7，進(jìn)行定容透析，得到表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液；.103.先包覆后磺化，制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液該步驟包括步驟 1031、1032 和 1033 .1031.按照殼聚糖與鐵的重量比為2—8，在40-80°C的恒溫下，將殼聚糖溶解在體積比為1%-10%的醋酸水溶液中，攪拌至澄清，形成殼聚糖溶液；用水稀釋步驟1023制得的表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液，形成表面包裹2，3- 二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液；.1032.啟動攪拌機(jī)，將步驟1031制備的殼聚糖溶液加入步驟1031制備的表面包裹2， 3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液的稀釋液中，持續(xù)攪拌2 h -20 h;然后磁分離、 用水洗滌后，加水磁分離16 h —24 h;將上層水倒掉，取出下層黑色粒子，在90-120°C烘干該黑色粒子6-12小時，該黑色粒子為表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒；.1033.將步驟1032制備的表面包覆殼聚糖的磁性納米顆粒加入質(zhì)量百分濃度為 90-98%的硫酸溶液中，然后用攪拌機(jī)攪拌該硫酸溶液2-8小時后，用無水乙醇萃取一次，再加入無水乙醇靜置6-20小時，吸出上清液后，向下層奶白色乳狀液體中加入重量百分濃度為10%的氫氧化鈉溶液，再用重量百分濃度為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6-9之間，形成磺化溶液；將該磺化溶液加水稀釋后，用離心機(jī)分離，下層絮狀物加水超聲溶解，得到表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液；\20.穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，包括步驟201、202和203 \201.用渦旋儀將步驟1033制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液渦旋，并超聲10-60min ；\202.將生物介質(zhì)樣品溶液加入離心管，并加入100μ L的步驟201制得的表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，避光渦旋l-5min，超聲5-20min后再靜置10-60min，形成待測混合溶液；\203.將步驟202制得的待測混合溶液離心10-60min，轉(zhuǎn)速為9000-16000r/min，下層所沉積的黑色顆粒為富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒；洗脫步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒首先，將步驟203制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒進(jìn)行磁分離和水洗滌；然后， 使用洗脫劑于富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒中，用渦旋儀避光渦旋l_5min，用超聲儀超聲3-20min，靜置10_60min后，用離心機(jī)離心10_60min，轉(zhuǎn)速為9000_16000r/min，上清液進(jìn)樣含有洗脫的兒茶酚胺。
2.按照權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，在所述的步驟30之后，進(jìn)行液相色譜電化學(xué)檢測步驟使用液相色譜將兒茶酚胺與干擾物質(zhì)的色譜峰分離，并使用電化學(xué)檢測器進(jìn)行檢測，用外標(biāo)法對洗脫的兒茶酚胺進(jìn)行定量檢測，檢測中的色譜條件為色譜柱C18色譜柱；流動相10-60mM檸檬酸，15-100 mM磷酸二氫鈉，1_10 mM庚烷磺酸鈉；0. 05-0. 5 mM乙二胺四乙酸，體積比5. 0-7. 0 %的乙腈，氫氧化鈉調(diào)pH=3. 5-5. 5 ；流速為 0. 5-2. OmL/min ；柱溫為25-40°C;進(jìn)樣量2-20 μ L ；電化學(xué)檢測器的工作電壓為0. 35-0. 7 V ；操作時溫度20° C — 25° C。
3.按照權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，所述的步驟30中使用的洗脫劑以水為溶劑，無機(jī)酸為溶質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，所述的無機(jī)酸是鹽酸、硝酸和磷酸中的任意一種或者任意組合。
5.按照權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，所述的步驟30中使用的洗脫劑以有機(jī)極性溶劑和水的混合溶液為溶劑，以有機(jī)酸為溶質(zhì)。
6.按照權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，其特征在于，所述的有機(jī)酸是二甲基亞砜、乙二醇、甲酸、乙酸和三氯乙酸中的任意一種或者任意組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中兒茶酚胺的方法，該方法包括以下步驟步驟10.制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液，該步驟包括制備磁性納米顆粒、制備表面包裹2，3-二巰基丁二酸的磁性納米顆粒膠體溶液和制備表面包裹磺化殼聚糖的磁性納米顆粒膠體溶液。步驟20.穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺。步驟30.洗脫步驟20制得的富集了兒茶酚胺的磁性納米顆粒。該方法采用磁性納米顆粒表面的磺化殼聚糖來穩(wěn)定和富集生物介質(zhì)中的兒茶酚胺，利用磁性納米顆粒的磁分離功能，從生物介質(zhì)中分離和洗滌兒茶酚胺，過程簡單快速、成本低廉、富集率高。
文檔編號B01J20/30GK102553536SQ20111043022
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者喬婷, 王爽, 鄧慧華, 金晶, 陸祖宏 申請人:東南大學(xué)