專利名稱：一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種吸附介質(zhì)及其制備方法，特別是涉及一種以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質(zhì)分離的膨脹床吸附介質(zhì)及制備方法，屬于層析分離中膨脹床吸附分離蛋白質(zhì)技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物分離技術(shù)是生物工程技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，改進(jìn)生物分離技術(shù)，低成本、高收率、 高效率地純化目標(biāo)產(chǎn)物，以及有效地控制有害雜質(zhì)的含量，是生物活性物質(zhì)能否轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袑?shí)用價(jià)值和競爭力的產(chǎn)品的首要問題。膨脹床吸附(expanded bed adsorption, EBA)是一種新型的蛋白質(zhì)分離操作技術(shù)，形成于20世紀(jì)90年代，近年來在生物工程領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。膨脹床操作可將離心、初步分離及濃縮過程集成為一個(gè)單元操作，從而簡化了蛋白質(zhì)分離的步驟，并可以提高目的蛋白的收率，減少操作時(shí)間。吸附介質(zhì)性能的好壞直接影響分離效果，開發(fā)出性能良好的吸附劑基質(zhì)，是該項(xiàng)技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。既要易于流化，又要使分離效果接近于固定床，必須確保吸附劑顆粒在膨脹床內(nèi)能夠適度膨脹，并穩(wěn)定分級，停留在各自特定的位置，因此需要對膨脹床吸附劑進(jìn)行特殊的設(shè)計(jì)，譬如密度、粒徑及其分布、功能基團(tuán)種類及其數(shù)量等。目前常用的膨脹床吸附介質(zhì)多為GE Healthcare公司提供的Mreamline系列介質(zhì)，采用石英砂作增重內(nèi)核，外層為交聯(lián)瓊脂糖，外觀球形，粒徑在100-300μπι之間。但其昂貴的價(jià)格制約了它在國內(nèi)的應(yīng)用，另外，Mreamline系列樹脂仍然存在著流速操作范圍偏窄的不足。為了提高EBA的處理能力，開發(fā)高密度、高吸附容量的膨脹床吸附劑是必然趨勢。構(gòu)建合適化學(xué)結(jié)構(gòu)的配基，高選擇性地捕獲目標(biāo)產(chǎn)物，而顆粒等雜質(zhì)則被帶出床層，對于擴(kuò)張床吸附層析過程來說，是非常重要的。金屬螯合親和層析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC)，是一項(xiàng)常用的親和層析分離技術(shù)。該方法一般將 Cu2+、Zn2\ Ni2+等通過螯合劑亞氨基二乙酸交聯(lián)到色譜填料上，利用蛋白質(zhì)表面的組氨酸、 色氨酸、半胱氨酸等能和金屬離子發(fā)生特殊的相互作用的原理，從而對蛋白質(zhì)加以分離。由于IMAC具有吸附容量大，選擇性及通用性較好，易于再生，成本低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一，也是基因工程中對融合蛋白表達(dá)純化的最常見的一種手段?；旌夏Ｊ轿綄游?mixed-mode chromatography)是近年開發(fā)的生物分離新方法，其功能配基同時(shí)含有疏水基團(tuán)和離子交換基團(tuán)，兼具疏水作用和靜電相互作用， 可以通過靜電相吸來強(qiáng)化吸附或靜電排斥來協(xié)助解吸，具有廣闊的應(yīng)用前景(BURTON S C，et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2001，49 :275)。同時(shí)， 配基密度通常比較高，具有典型的耐鹽吸附性能，對目標(biāo)蛋白有很強(qiáng)的捕獲能力，可以從較低濃度的體系中富集目標(biāo)蛋白，特別適合于生物對象初分離的要求(GH0SE S, et al. Biotechnology Progress, 2005， 21:498. BURTON S C, et al. Biotechnology andBioengineering, 1997, 56: 45)。將膨脹床吸附和混合模式吸附層析有機(jī)地結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)混合模式膨脹床吸附，可以充分發(fā)揮二者的優(yōu)勢，達(dá)到低原料要求、高處理量和高選擇性的分離目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)及其制備方法，以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質(zhì)分離的膨脹床吸附介質(zhì)及制備方法，達(dá)到金屬螯合親和配基和疏水作用配基協(xié)同作用，提高對料液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附分離效率及選擇性，形成一種高效集成化蛋白質(zhì)分離方法，有效促進(jìn)蛋白質(zhì)的規(guī)?；蛛x純化。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)，介質(zhì)的組成中基質(zhì)為殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球，配基為經(jīng)苯甲醛活化后引入的苯基和環(huán)氧氯丙烷活化后再偶聯(lián)的亞氨基二乙酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1. 一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)，其特征在于，介質(zhì)的組成中基質(zhì)為殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球，配基為經(jīng)苯甲醛活化后引入的苯基和環(huán)氧氯丙烷活化后再偶聯(lián)的亞氨基二乙酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)，其特征在于， 所述的殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球的骨架為殼聚糖，增重劑為不銹鋼粉，增重劑占濕球的質(zhì)量百分比為69Γ40%，殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球的粒徑為5(Γ300 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)，其特征在于， 所述的配基為苯基和亞氨基二乙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)，其特征在于， 所述的配基密度為20-160 μ mol / ml介質(zhì)。
5.一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)的制備方法，其特征在于該方法包括如下過程首先將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的殼聚糖溶液與不銹鋼粉、PEG2000充分混合，PEG2000和不銹鋼粉在混合物中的質(zhì)量百分含量分別為3%和69Γ40%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然后加入0. 12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih后將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH) V(無水乙醇)=1 1)的混合液中靜置2h，用二甲苯、無水乙醇、去離子水充分洗滌，篩分得到粒徑5(Γ300 μ m的殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球作為基質(zhì)；其次將復(fù)合微球、甲醇、苯甲醛混合，苯甲醛添加的體積量為復(fù)合微球體積的0. 3^1倍，60°C下200rpm搖床中反應(yīng)纊16h，再加入硼氰化鈉室溫反應(yīng)12h，抽濾，用去離子水洗滌后得苯甲醛化基質(zhì)；然后將苯甲醛化基質(zhì)、0. 2mol/L的NaOH 水溶液、2、倍基質(zhì)微球體積的環(huán)氧氯丙烷混合，50°C反應(yīng)他，抽濾、洗滌，得環(huán)氧基活化基質(zhì)；最后將環(huán)氧基活化基質(zhì)、lmol/L的Na2CO3溶液、廣2倍環(huán)氧基活化基質(zhì)質(zhì)量的亞氨基二乙酸混合，使體系PH值始終保持在10，在70°C下200rpm搖床中反應(yīng)8 16h，抽濾，水洗至中性，得到以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質(zhì)分離的膨脹床吸附介質(zhì)。
全文摘要
一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質(zhì)及其制備方法，涉及一種吸附介質(zhì)及其制備方法?；|(zhì)為殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球，配基為經(jīng)苯甲醛活化后引入的苯基和環(huán)氧氯丙烷活化后再偶聯(lián)的亞氨基二乙酸。采用反相懸浮交聯(lián)法，制備殼聚糖/不銹鋼粉復(fù)合微球作為空白基質(zhì)；采取兩種配基分開設(shè)計(jì)的方法，先將微球基質(zhì)C2位苯甲醛化，構(gòu)建一個(gè)疏水相互作用配基，再用環(huán)氧氯丙烷活化基質(zhì)C6位羥基，再和亞氨基二乙酸偶聯(lián)，得到以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質(zhì)分離的膨脹床吸附介質(zhì)。本發(fā)明所研制的新型膨脹床吸附介質(zhì)，同時(shí)具有金屬螯合親和配基和疏水作用配基，提高對料液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附分離效率及選擇性，可用于蛋白質(zhì)的規(guī)?；蛛x純化。
文檔編號B01J20/24GK102553537SQ201110440588
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者朱建星, 王紅艷 申請人:沈陽化工大學(xué)