專利名稱：酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固相萃取柱的制備方法，尤其涉及一種酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法。
背景技術(shù)：
酚類環(huán)境雌激素作為制備環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯塑料的添加劑，進(jìn)入生物體內(nèi)可造成內(nèi)分泌失調(diào)，危害生物體生殖機(jī)能或引發(fā)惡性腫瘤，提高與激素相關(guān)的癌癥并發(fā)率，其生物雌激素效應(yīng)與環(huán)境毒性已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。最新研究表明，O. I μ g/L甚至更低量級的酚類環(huán)境雌激素可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物效應(yīng)，干擾生物體中內(nèi)源性激素的分泌，其低劑量效應(yīng)研究已成為當(dāng)前酚類環(huán)境雌激素研究的一個(gè)重要方向。鑒于此，開展痕量酚類環(huán)境雌激素的富集凈化與檢測技術(shù)研究有益于促進(jìn)衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步。由于酚類環(huán)境雌激素樣品基質(zhì)復(fù)雜、種類繁多、含量甚微(pg級)，因此樣品的富集凈化技術(shù)成為其分析監(jiān)測中的關(guān)鍵步驟。目前，酚類環(huán)境雌激素樣品預(yù)處理的常用方法包括液液萃取和固相萃取。固相萃取比液液萃取富集效率高、消耗有機(jī)溶劑少、操作簡單和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的固相萃取小柱多采用C18、改性二氧化硅、三氧化二鋁等顆粒作為填料，對酚類環(huán)境雌激素的富集效果及選擇性較差。因此，設(shè)計(jì)對酚類環(huán)境雌激素具有高選擇性和高富集倍數(shù)的固相萃取小柱對于其富集凈化與檢測技術(shù)的進(jìn)步具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers, MIPs)主要是利用分子印跡技術(shù)制備的具有高親和性和高選擇性的可以識別和結(jié)合目標(biāo)分子的特定受體。MIPs依靠形狀、大小和化學(xué)功能基的分布對模板分子進(jìn)行識別，具有專一選擇性，因其制備方法多樣、工藝相對容易控制、特異選擇性強(qiáng)、具有結(jié)構(gòu)和功能的可預(yù)期性、可調(diào)控性、可裁剪性而被廣泛用于樣品中酚類環(huán)境雌激素的分離富集。R. Zhu等報(bào)道了(R. Zhu, W. H. Zhao, M. J. Zhai, et al. , Anal. Chim. Acta 2010，658，209.)，以雙酚 A 為模板分子、二氧化硅為載體的用于富集分離污水中雙酚A的納米級分子印跡聚合物。Y. S. Ji等報(bào)道了 (Y. S. Ji, J. J. Yin, Z. G. Xu, et al. , Anal Bioanal Chem. 2009, 395, 1125.), 以磁性納米四氧化三鐵為載體，以雙酚A為模板分子，在外磁場作用下可以實(shí)現(xiàn)快速、有效的固液分離的納米四氧化三鐵磁性分子印跡聚合物。目前，關(guān)于酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法。本發(fā)明制備工藝簡單、專一選擇性強(qiáng)、富集效率高；所制備的酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱對水樣和食品樣品中殘留的痕量酚類環(huán)境雌激素具有很高的選擇性和極強(qiáng)的富集能力，并且可以顯著降低基質(zhì)效應(yīng)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法，該方法包括以下步驟
(I)將10(T500mg酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與5 20mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩 5 30min后,超聲5 30min至混合均勻,移至聚丙烯等材質(zhì)的固相萃取小柱中，裝填均勻后， 兩端分別用篩板封堵。(2)將10(T500mg傳統(tǒng)固相萃取填料與5 20mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩5 30min后， 超聲5 30min至混合均勻，移至步驟I的固相萃取小柱中，裝填均勻后，頂端用篩板封堵，用 5"20mL酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用5 20mL純有機(jī)溶劑上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)。(3)將步驟2的固相萃取小柱用惰性氣體吹掃除去殘留的有機(jī)溶劑，然后3(T90°C 真空干燥廣24小時(shí)，制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所制備的酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱，具有制備工藝簡單、專一選擇性強(qiáng)、富集效率高的優(yōu)點(diǎn)，并將其應(yīng)用于富集生活飲用水及食品中殘留的痕量酚類環(huán)境雌激素，能達(dá)到較高的富集倍數(shù)并可有效的降低基質(zhì)效應(yīng)。


圖I是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，得到6種酚類環(huán)境雌激素的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖， 圖中，(I)雙酚A ; (2)己烯雌酚；(3)己烷雌酚；(4) 4-叔辛基酚；(5)戊酸雌二醇；(6) 4-壬基酚。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法，包括以下步驟
I、將10(T500 mg酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與5 20 mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩 5^30 min后,超聲5 30 min至混合均勻，移至聚丙烯等材質(zhì)的固相萃取小柱中，裝填均勻后，兩端分別用篩板封堵。酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物優(yōu)選為粉末狀。酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物可以通過以下步驟制備得到
(1)、制備高磁含量單分散的四氧化三鐵/聚合物復(fù)合微球采用化學(xué)共沉淀法制備得到納米四氧化三鐵微粒，并以油酸進(jìn)行表面修飾，然后采用懸浮聚合法制備得到高磁含量單分散的四氧化三鐵/聚合物復(fù)合微球；
(2)、制備模板分子與氨基功能試劑的復(fù)合反應(yīng)液在60°C條件下，在甲醇體系中，模板分子與功能基經(jīng)氫鍵作用力相互結(jié)合，形成模板分子與氨基功能基團(tuán)的復(fù)合反應(yīng)液；
(3)、制備氨基化納米四氧化三鐵磁性分子印跡復(fù)合材料步驟(I)和步驟(2)所得產(chǎn)物經(jīng)開環(huán)反應(yīng)對材料進(jìn)行表面功能化修飾，最終得到具有核殼結(jié)構(gòu)的氨基化納米四氧化三鐵磁性分子印跡復(fù)合材料。純有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一種，進(jìn)一步優(yōu)選為甲醇。2、將10(T500mg傳統(tǒng)固相萃取填料與5 20mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩5 30min后， 超聲5 30min至混合均勻，移至步驟(I)的固相萃取小柱中，裝填均勻后，頂端用篩板封堵， 用5 20mL酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用5 20mL純有機(jī)溶劑上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)。傳統(tǒng)固相萃取填料可以是C18、改性二氧化硅、三氧化二鋁和PSA中的至少一種，進(jìn)一步優(yōu)選為粉末狀C18。酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與傳統(tǒng)固相萃取填料的質(zhì)量比為1:1-1:5。酸性有機(jī)溶劑可以是甲酸、乙酸和三氟乙酸中的至少一種與甲醇的混合溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為甲酸與甲醇的混合溶液；甲酸與甲醇的體積比為1:5-1:20。純有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一種，進(jìn)一步優(yōu)選為甲醇。3、將步驟2的固相萃取小柱用惰性氣體吹掃除去殘留的有機(jī)溶劑，然后3(T90°C 真空干燥廣12小時(shí)，制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱。本發(fā)明所制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的性能評價(jià)通過對實(shí)際樣品的檢測對酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的性能進(jìn)行評價(jià)。采用不同比例的甲醇-水溶液和甲酸-甲醇溶液對固相萃取柱進(jìn)行清洗，分別對淋洗和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，并與普通SPE柱富集凈化效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明本發(fā)明所制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱對目標(biāo)分析物的富集倍數(shù)為50-500倍，酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱在使用15次之后，對樣品中殘留的痕量酚類環(huán)境雌激素仍具有高的選擇性和富集能力，其回收率大于92. 5%ο下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步說明，使本發(fā)明的優(yōu)勢和有益效果更加突出，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例I
酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備
(1)將IOOmg酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與IOmL純有機(jī)溶劑混合，振蕩IOmin后超聲IOmin至混合均勻，移至聚丙烯等材質(zhì)的固相萃取小柱中，兩端分別用篩板封堵；
(2)將500mg傳統(tǒng)固相萃取填料與IOmL純有機(jī)溶劑混合,振蕩IOmin后超聲IOmin至混合均勻，移至步驟(I)所得固相萃取小柱中，裝填均勻后頂端用篩板封堵，用IOmL酸性有機(jī)溶劑上柱清洗,然后用IOmL純有機(jī)溶劑上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)；
(3)將步驟(2)所得固相萃取用惰性氣體吹掃除去殘留的有機(jī)溶劑，30°C真空干燥12 小時(shí)，制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱。酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的性能評價(jià)
(I)先后用5mL水和甲醇對酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活化，之后將 500mL河水過濾后上樣，流速為I. OmL/min,用6mL甲醇與水(1:10 V/V)的混合溶液淋洗， 再用IOmL甲醇與甲酸(I: 10 V/V)的混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯抵两?，用甲醇溶解并定容至lmL，采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UFLC-MS/MS)進(jìn)行分析。(2)先后用5mL水和甲醇對酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱進(jìn)行活化，之后將5mL經(jīng)蛋白沉淀的全血樣品上樣,流速為I. OmL/min,用6mL甲醇與水(I: 10 V/V)的混合溶液淋洗，再用IOmL甲醇與甲酸(I: 10 V/V)的混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯抵两?，用甲醇溶解并定容至ΙΟΟ?，采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UFLC-MS/MS)進(jìn)行分析。實(shí)施例21操作步驟同實(shí)施例1，實(shí)施例Γ8原料物質(zhì)、原料配方及制備條件參數(shù)見表I。表I :本發(fā)明實(shí)施例f 10原料組分及制備參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將10(T500mg酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與5 20mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩 5 30min后,超聲5 30min至混合均勻,移至聚丙烯等材質(zhì)的固相萃取空柱中，裝填均勻后， 兩端分別用篩板封堵；(2)將10(T500mg傳統(tǒng)固相萃取填料與5 20mL純有機(jī)溶劑混合，振蕩5 30min后，超聲5 30min至混合均勻，移至步驟I的固相萃取小柱中，裝填均勻后，頂端用篩板封堵，用 5"20mL酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用5 20mL純有機(jī)溶劑上柱清洗，以除去酸性物質(zhì)；(3)將步驟2的固相萃取小柱用惰性氣體吹掃除去殘留的有機(jī)溶劑，然后3(T90°C真空干燥f 12小時(shí)，制得酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)和(2)中，所述純有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述純有機(jī)溶劑優(yōu)選為甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述傳統(tǒng)固相萃取填料可以是C18、改性二氧化硅、三氧化二鋁和PSA中的至少一種；所述酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物與傳統(tǒng)固相萃取填料的質(zhì)量比為1:1-1: 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述傳統(tǒng)固相萃取填料進(jìn)一步優(yōu)選為粉末狀C18。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述酸性有機(jī)溶劑可以是甲酸、乙酸和三氟乙酸中的至少一種與甲醇的混合溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述酸性有機(jī)溶劑進(jìn)一步優(yōu)選為甲酸與甲醇的混合溶液；甲酸與甲醇的體積比為1:5-1:20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酚類環(huán)境雌激素分子印跡固相萃取柱的制備方法，該方法依次將酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物100-500mg與傳統(tǒng)固相萃取填料100-500mg分別與5-20mL純有機(jī)溶劑混合均勻，依次移入固相萃取空柱中，并用篩板封堵兩端，裝填均勻后用酸性有機(jī)溶劑上柱清洗，然后用純有機(jī)溶劑沖洗，并用惰性氣體吹掃除去殘余有機(jī)溶劑，干燥即得。本發(fā)明制備方法簡單，具有與酚類環(huán)境雌激素分子印跡聚合物本身匹配的特殊性，所制備的固相萃取柱對酚類環(huán)境雌激素具有很高的選擇性和回收率，并且可以明顯降低基質(zhì)效應(yīng)。
文檔編號B01D15/22GK102580353SQ20121004195
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月23日
發(fā)明者趙永綱, 金米聰, 陳曉紅 申請人:寧波市疾病預(yù)防控制中心