專利名稱：基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法
基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微流控技術、電化學檢測和自組裝技術等技術領域，具體地說，是一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法。
背景技術：
微流控技術出現(xiàn)于上世紀80年代初，是一個集合了工程學、物理學、化學、生物技術、微型制造技術的新興領域。微流控技術通過在幾厘米見方的芯片上，有效精準控制流體的行為，從而實現(xiàn)對一些被測物的測定和分析。其中，在芯片上進行樣品采集、預處理、分離、檢測等一系列完整的實驗過程被成為“芯片上的實驗室”(lab-on-a-chip)。微流控技術具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點。但目前對分離體系、檢測體系、芯片上如何引入實際樣品分析等諸多問題的有關研究還十分薄弱。 它的發(fā)展依賴于多學科交叉的發(fā)展。在新近發(fā)展的微流控芯片檢測體系中，電化學是其中非常重要的方法之一。電化學是研究發(fā)生在兩相界面處且伴隨電荷轉移現(xiàn)象的一門學科，基于電化學原理建立某一化學反應與電流響應的關系，通過測量如電位、電流、電導或電量等物理量，求得物質的含量或考量。因為簡單的結構、較低的成本、高靈敏度、制備容易等多優(yōu)點，電化學檢測在微流控領域的應用開啟了一個蓬勃發(fā)展的新領域，吸引了眾多交叉學科研究者的關注。迄今，大多數基于電化學檢測的微流控芯片都著重微通道的設計，對于微電極的應用也比較單一，微電極的設計制備等方面仍有很大的發(fā)展空間。本發(fā)明提出將自組裝技術應用在微流控芯片上，這使很多傳統(tǒng)電化學檢測手段都可在微流控芯片上得以實現(xiàn)，將極大的擴展微流控芯片的應用范圍。自組裝SAM (Self-assembled monolayers)技術是指分子在氫鍵、靜電引力、范德華力和官能團疏水親脂作用等弱作用力推動下，自發(fā)形成具有特殊結構和形狀的分子集合體的過程。譬如基于“巰基-金屬/金屬氧化物”而形成的單分子層膜結構體系能在金屬或氧化物表面形成穩(wěn)定的自組裝膜。作為一種新型技術，自組裝技術可以在分子水平上設計分子的結構，獲得優(yōu)異性能和特殊功能，因其具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，在電化學分析領域得到了巨大的應用。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計方法，通常包括以下幾個步驟(1)設計制備電極模板及與之相對應的微通道模板；(2)通過微流控通道，將化學或生物分子通過自組裝技術，固定在微電極表面，形成自組裝層修飾微電極；(3)通過微通道通入分析物，與修飾微電極接觸并反應；(4)通過微通道通入測試溶液，并利用電化學方法對修飾電極進行檢測。一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，通過微通道控制流體途徑和覆蓋面積，將能夠形成自組裝膜的特征物自組裝在電極上，再利用電化學檢測手段對其進行檢測；所述的特征物為具有選擇性的有機分子配體、DNA/RNA分子、核酸適配體、酶、抗體 /抗原、蛋白質分子等，及以上物質經過化學、生物修飾的相關特征物；所述的自組裝，其方法包括常用的化學吸附法、凈涂法和溶劑揮發(fā)法等。其中， 化學吸附法主要是利用含有巰基官能團的化合物在金、銀、鉬等一些惰性金屬以及一些如 Al203、Ti02、Fe2O3等氧化物上的化學吸附。在本發(fā)明中具有良好的應用效果。所述的電化學檢測為所有常見電化學方法。所述的微流控多通道芯片，由緊密結合在一起的電極基底和設有微通道的模板 (若三電極體系采用相同材料，則可有自組裝模板以及測試模板兩塊模板)兩部分組成。所述的微通道模板與微流控模板的材質相同即可，其基質由下述任意一種基質制成單晶硅、無定形硅、玻璃、金屬和有機聚合物，其中有機聚合物包括環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。所述的微通道模板，在不影響微流控通道的情況下，其形狀可以任意設計。通常， 模板可修剪為長4 6cm,寬4 6cm,高O. 3 Icm的矩形,但并不局限于此。所述的微通道模板，設計為圓形、“一”字型、折型等多種形狀，可根據測試需要設計，不同形狀覆蓋不同電極，實現(xiàn)單電極或多電極的自組裝及測試。所述的微通道模板，對微流控通道的尺寸無特別嚴格要求，通常，通道的寬度一般不超過2_，厚度一般不超過3mm?？筛鶕枰m當增加或縮小通道尺寸。所述的電極基底也由基板組成，由下述任意一種基質制成單晶娃、無定形娃、玻璃、導電玻璃、金屬和有機聚合物，其中導電玻璃可以為氧化銦錫導電玻璃(ITO)或氧化氟錫導電玻璃(FTO)，有機聚合物包括環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氯乙烯樹脂(PVC)等。所述的電極基底，在不影響微流控通道的情況下，電極基底的形狀可以不固定。通常，電極基底形狀應與微流控通道模板形狀保持一致，可修剪為長4 6cm，寬4 6cm，高 O. 3 Icm的矩形,但并不局限于此。所述的電極基底，可采用三電極體系或雙電極體系，其中，三電極為工作電極、參比電極和輔助電極(也稱為“對電極”)。雙電極為工作電極和輔助電極(也稱為“對電極”)。所述的電極基底，電極的制備可通過薄膜技術或厚膜技術實現(xiàn)。薄膜技術包括基于光刻，蒸鍍以及物理濺射等技術，厚膜技術包括絲網印刷技術和旋涂技術。本發(fā)明采用三電極體系，即工作電極、參比電極和輔助電極(也稱為“對電極”)。 電極的制備可通過薄膜技術或厚膜技術實現(xiàn)。薄膜技術包括基于光刻，蒸鍍以及物理濺射等技術，厚膜技術即絲網印刷技術。所述的采用雙/三電極體系可以采用同一種材料(比如金、鉬等貴金屬)或者不同材料(如工作電極和對電極采用貴金屬材料，參比電極采用銀或碳)。三電極體系中，當參比電極和對電極與工作電極采用相同材料(如都采用金電極)時，若自組裝也有可能發(fā)生在參比電極和對電極上，需要采用兩塊模板(自組裝膜版和測試模板)配合使用。—種基于自組裝技術的電化學-微流控芯片具有多電極，由微電極模板和微通道模板兩部分組成。其中，微通道模板可根據微電極的形狀設計。所述的微電極為三電極體系。工作電極為金材料，參比電極為碳材料，輔助電極 (對電極)為鉬材料。電極的制作采用蒸鍍法，按照提前制備的掩膜進行蒸鍍得到。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明結合了以上三項技術的優(yōu)勢，提出將自組裝技術應用于微流控芯片，這極大的拓展了微流控芯片的應用領域，其分析物可以是從金屬離子和氣體的原子或小分子物質到生物物質，包括酶和抗體或者抗原等大分子。同時，微流控芯片具有樣品消耗量小的優(yōu)點，而自組裝膜通常會涉及到很多昂貴的物質，應用微流控方法可以顯著降低成本，這又使得自組裝技術在實際中的即時應用成為可能。

圖I為基于自組裝技術的電化學微流控芯片原理圖；圖2為實施例中所應用的8電極圖；2a為8微電極模板，2b為微電極組成；圖3為實施例中使用的4種微流控通道模板圖；3a為8電極微通道模板，3b為6 電極微通道模板，3c. 2電極微通道模板，3d.單電極微通道模板；圖4為微流控通道模板圖的側視圖；4a為8電極微通道模板+微電極自組裝模板， 4b為8電極微通道模板+微電極自組裝模板的縱視圖，4c為8電極微通道模板+微電極測試模板，4d為8電極微通道模板+微電極測試模板的縱視圖；圖5為微金電極在O. 5M H2SO4溶液中的循環(huán)伏安圖；圖6為自組裝L-半胱氨酸的微電極與Cu2+離子配位后，針對不同掃描速率的循環(huán)伏安圖；圖7為自組裝DNA的微電極與目標DNA雜交后，氧化峰電流值與目標DNA濃度的關系圖。
具體實施方式以下提供本發(fā)明一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法的具體實施方式
。請參見附圖1，2a，2b，3a，3b，3c，3d，4a，4b，4c，4d，5，6，7。以下實施例中應用的多電極微流控芯片為8電極微流控芯片，通過不同的微流控通道模板，可以實現(xiàn)任意多電極或單電極的應用。其中，微流控通道模板為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，電極板材料為氧化銦錫導電玻璃(ITO)。以下的實施例均基于三電極體系工作電極為金材料，參比電極為碳材料，輔助電極(對電極)為鉬材料。電極的制作采用蒸鍍法，按照提前制備的掩膜進行蒸鍍得到。實施例I利用自組裝L-半胱氨酸檢測溶液中的Cu2+離子濃度。L-半胱氨酸(L-CySteine)是自然界20種重要氨基酸之一，具有良好的電化學活性。同時，L-半胱氨酸分子中含有極活潑的疏基(-SH)，易于通過形成Au-S鍵吸附于金電極表面，形成自組裝膜。另據多篇文獻報道，L-半胱氨酸對于Cu2+離子具有非常好的配位作用，從而產生選擇性電信號。 本實驗通過微通道使L-半胱氨酸自組裝在金電極表面，再對含有Cu2+離子的待測溶液進行電化學檢測。本實驗采用8電極芯片和8電極微通道。電極的清洗在微通道中通入O. 5M H2SO4溶液，對金電極進行-O. 2 I. 5V范圍內的循環(huán)伏安掃描，實現(xiàn)對金電極表面的清潔。自組裝過程向微通道通入含有IOmM L-半胱氨酸的O. 05M磷酸緩沖溶液，自組裝 30分鐘。自組裝完成后，通入超純水，將未鍵合的L-半胱氨酸沖洗掉。富集過程在微通道中通入含有5 X 10_6M Cu2+的pH 5. 5磷酸緩沖溶液中，富集15 分鐘。富集結束后，用空白PH 5. 5磷酸緩沖溶液沖洗通道以及電極。測試過程向微通道中通入空白pH 5.5磷酸緩沖溶液，對8枚電極進行 O. 6 -O. 3V的循環(huán)伏安掃描測試。掃描速率分別為O. 005V，0. 010V，0. 013V，0. 015V， O. 018V, O. 020V, 0. 023V, 0. 025V。如圖所示，可見一對明顯的氧化還原峰，來自于Cu2+離子的氧化還原。自組裝電極的再生微通道中通入O. IM HClO4溶液，電壓O. 5V靜止30秒即可實現(xiàn)再生。實施例2利用自組裝的巰基DNA探針檢測其特征序列，利用亞甲基藍(MB)作為指示劑。在DNA電化學生物傳感器中，已知序列的單鏈DNA分子(記為DNA探針)被固定在電極上，按照堿基互補配對原理，選擇性地識別樣品中的目標DNA (cDNA)序列，通過電化學方法檢測雜交過程。本實驗采用MB作為指示劑，因為MB對單鏈DNA (ssDNA)中的鳥嘌呤具有特殊的親和力，并且它與鳥嘌呤的相互作用使電子傳遞體減少，導致峰電流降低；但當雜交形成雙鏈DNA(dsDNA)時，電極表面不再有游離的鳥嘌呤與MB結合，峰電流又顯著增加。 因此，可以通過這種選擇性識別單、雙鏈DNA的原理來達到對特征DNA序列的檢測。本實驗利用自組裝法，將修飾了巰基(-SH)的ssDNA探針修飾在金電極表面。與 cDNA序列雜交后，用MB進行標記，通過電化學方法進行檢測。本實驗使用8電極芯片，采用 6電極微通道模板進行DNA自組裝、標記和電化學測試，采用單電極微通道模板進行雜交。ssDNA 探針5’ -SH-(CH2) 6-CAAGCTCTTCTTCAGGCC_3’cDNA 目標序列5，-GGC CTG AAG AAG AGC TTG-3，電極的清洗在微通道中通入O. 5M H2SO4溶液，對金電極進行-O. 2 I. 5V范圍內的循環(huán)伏安掃描，實現(xiàn)對金電極表面的清潔。自組裝過程向6電極微通道模板中通入I μ mol/L ssDNA探針序列的溶液 (50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L NaCl，pH 7. 2)，自組裝I. 5小時。自組裝完成后，依次通入電極沖洗液(50mmol/L Tris-HCl，20mmol/LNaCl，pH7. 2)和超純水，將未鍵合的DNA分子沖洗掉。再向微通道模板中通入lmmol/LMCH水溶液，固定30分鐘后，分別用電極沖洗液和超純水沖洗通道及電極。雜交過程將25 μ mol/L 目標序列 cDNA 的儲備液用 50mmol/L Tris-HCl, 20mmol/ LNaCl (DNA 固定液)緩沖液將其分別稀釋成0. 01 μ mol/L, O. 05 μ mol/L, O. 25 μ mol/L,0.5 μ mol/L，I. O μ mol/L等濃度。加上空白緩沖液對照組，共6組。采用單電極微通道模板，分別將待測6種溶液通入微通道中，與自組裝ssDNA的電極表面接觸，雜交I小時。雜交結束后，用空白緩沖溶液沖洗通道以及電極。標記過程使用6電極微通道模板，向其中通入新配置的20 μ mol/L MB溶液(pH 7. 2)。富集15分鐘后，用Tris-HCl溶液(pH 7. 2)清洗電極和微通道。測試過程使用6電極微通道模板，在空白Tris-HCl溶液(pH7. 2)中DPV法檢測，掃描電位-O. 5 0V，脈沖振幅為10mV，脈沖寬度為20ms，脈沖周期為O. 2s，記錄氧化峰電流值。其中 O (a), O. 01 μ mol/L (b), O. 05 μ mol/L (c), O. 25 μ mol/L (d), O. 5 μ mol/L (e,
1.O μ mol/L (f)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍內。
權利要求
1.一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計方法，具體步驟為(I)設計制備電極模板及與之相對應的微通道模板；(2)通過微流控通道，將化學或生物分子通過自組裝技術，固定在微電極表面，形成自組裝層修飾微電極；(3)通過微通道通入分析物，與修飾微電極接觸并反應；(4)通過微通道通入測試溶液，并利用電化學方法對修飾電極進行檢測。
2.一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于， 通過微通道控制流體途徑和覆蓋面積，將能夠形成自組裝膜的特征物自組裝在電極上，再利用電化學檢測手段對其進行檢測。
3.如權利要求2所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的特征物為具有選擇性的有機分子配體、DNA/RNA分子、核酸適配體、 酶、抗體/抗原、蛋白質分子，及以上物質經過化學、生物修飾的相關特征物。
4.如權利要求2所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的自組裝，其方法包括化學吸附法、凈涂法和溶劑揮發(fā)法。
5.如權利要求2所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的微流控多通道芯片，由緊密結合在一起的電極基底和設有微通道的模板兩部分組成。
6.如權利要求5所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的微通道模板與微流控模板的材質相同即可，其基質由下述任意一種基質制成單晶硅、無定形硅、玻璃、金屬和有機聚合物，其中有機聚合物包括環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)；所述的微通道模板，其形狀可任意設計；本專利實施例中模板修剪為長4 6cm，寬4 6cm,高O. 3 Icm的矩形；所述的微通道模板，設計為圓形、“一”字型、折型等多種形狀；所述的微通道模板，通道的寬度不超過2_，厚度不超過3_。
7.如權利要求5所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的電極基底也由基板組成，由下述任意一種基質制成單晶硅、無定形硅、玻璃、導電玻璃、金屬和有機聚合物，其中導電玻璃為氧化銦錫導電玻璃(ITO)或氧化氟錫導電玻璃(FTO)，有機聚合物包括環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC) 和聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氯乙烯樹脂(PVC)；所述的電極基底，電極基底的形狀可任意設計；電極基底形狀應與微流控通道模板形狀保持一致，本專利實施例中修剪為長4 6cm,寬4 6cm,高O. 3 Icm的矩形；所述的電極基底，制備通過薄膜技術或厚膜技術來實現(xiàn)。
8.如權利要求2所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的基于自組裝技術的電化學-微流控芯片具有多電極，由微電極模板和微通道模板兩部分組成。
9.如權利要求8所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的微電極為雙/三電極體系，電極的制備材料不固定，可根據需要進行選擇。本專利實施例中采用的工作電極為金材料，參比電極為碳材料，輔助電極為鉬材料；電極的制備通過薄膜技術或厚膜技術來實現(xiàn)；薄膜技術包括基于光刻，蒸鍍以及物理派射技術。
10.如權利要求9所述的基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的制備方法，其特征在于，所述的雙/三電極體系采用同一種材料或者不同材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于自組裝技術的電化學檢測-微流控多通道芯片的設計及制備方法，并根據此方法設計制備了微流控芯片；本發(fā)明提出將自組裝技術與電化學檢測相結合，并應用于微流控領域，實現(xiàn)對多類物質的高效低耗檢測。本方法通常包括以下幾個步驟(1)設計制備電極模板及與之相對應的微通道模板；(2)通過微流控通道，將化學或生物分子通過自組裝技術，固定在微電極表面，形成自組裝層修飾微電極；(3)通過微通道通入分析物，與修飾微電極接觸并反應；(4)通過微通道通入測試溶液，并利用電化學方法對修飾電極進行檢測。本發(fā)明中設計并制備的微流控芯片具有多電極體系，可以根據需要制備相應模板，進行單電極或多電極的自組裝及電化學檢測。
文檔編號B01L3/00GK102580800SQ20121005226
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權日2012年3月1日
發(fā)明者丁義麗, 柴燕, 牛湘衡, 藍閩波, 袁慧慧, 趙紅莉, 陳晨 申請人:華東理工大學