專利名稱：親和層析基質(zhì)及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及層析領(lǐng)域。在ー些特定實(shí)施方式中本發(fā)明提供了涉及親和層析的基質(zhì)及方法。
背景技術(shù)：
層析方法一般用于從混合物中分離和/或純化目標(biāo)分子如蛋白質(zhì)、核酸和多糖。親和層析具體包括使混合物通過連有特異性配體(即特異性結(jié)合配偶體)的基質(zhì)，以使目標(biāo)分子結(jié)合于其上。通過接觸配體，目標(biāo)分子結(jié)合到基質(zhì)上并因此從混合物中保留下來。相比于其他類型的層析，親和層析提供了ー些優(yōu)點(diǎn)。它提供了ー種高特異性、快速、經(jīng)濟(jì)和高產(chǎn)率的純化方法。在一個應(yīng)用中親和層析可被用于純化如單克隆抗體的蛋白質(zhì)。比如IgG亞型抗體可通過結(jié)合有A蛋白或G蛋白的基質(zhì)而得到親和純化(Boyle and Reis, 1987,Biotechnology 5 :697 ;Hermanson et al.，1992， Immobilized Affinity LigandTechniques, Academic Press ;美國專利公開 2006/0134805 號)。連接蛋白質(zhì)配體的方法過去已被描述，如將A蛋白和G蛋白連接到固體支持物例如層析介質(zhì)上，參見，例如 Hermanson et al. 1992, Immobilized Affinity LigandTechniques, Academic Press ;美國專利 5，874，165 號；3, 932，557 號；4, 772，635 號；4，210，723 號；5，250，6123 號；歐洲專利申請 EP I 352 957 A1,W0 2004/074471。典型地，這種介質(zhì)是用反應(yīng)官能團(tuán)(“活化基團(tuán)”)如環(huán)氧化物(表氯醇)、氰(溴化氰CNBr)，N，N-ニ琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)、醛或活化的羧酸(如N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)酷、羰基ニ咪唑(CDI)活化酷)來活化的。這些活化基團(tuán)能直接連接到基礎(chǔ)基質(zhì)，如CNBr，或者它們也可以是“接頭”或間隔分子的一部分，典型地是碳、氧和氮原子的直鏈，如在接頭丁ニ醇ニ縮水甘油醚(ー種常用的環(huán)氧化物偶聯(lián)劑)中發(fā)現(xiàn)的碳和氧的十元鏈。在偶聯(lián)條件下再將活化介質(zhì)與蛋白質(zhì)配體相平衡。一旦偶聯(lián)反應(yīng)完成，徹底洗滌介質(zhì)。對于A蛋白，通常每毫升介質(zhì)可負(fù)載4-6毫克蛋白質(zhì)(配體密度)，形成IgG的最大靜態(tài)容量(Qs)為40g/L。蛋白質(zhì)配體密度決定了靜態(tài)容量。靜態(tài)容量給出了能在層析分離中應(yīng)用的蛋白質(zhì)容量的上限。一般動態(tài)容量或者說負(fù)載容量(Qd)在一定的介質(zhì)中與靜態(tài)容量相關(guān)。一種適合于連接到瓊脂糖支持物上的重組形式的A蛋白也已被描述。重組形式的蛋白質(zhì)被工程化以具有半胱氨酸末端，參見，例如美國專利6，399，750號；GE HealthcareProduct Literature for r-Protein A Sepharose Fast Flow, Mabselect andMabselect及ra 。運(yùn)用該種重組A蛋白，IgG的靜態(tài)容量已能達(dá)到55_70g/L。然而，應(yīng)用該種重組A蛋白的ー個局限是其必須經(jīng)基因工程化以包含選擇性偶聯(lián)官能團(tuán)，由此導(dǎo)致的耗時和昂貴。另ー種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的策略是“接頭輔助偶聯(lián)”。接頭輔助偶聯(lián)與以下要詳述的配體輔助偶聯(lián)相反，它的特點(diǎn)是依賴于ー個包含了配體(即待純化靶分子的特異結(jié)合配偶體)和有助于將配體偶聯(lián)到固體支持物上的適當(dāng)連接官能團(tuán)的單分子。這種技術(shù)包括將官能團(tuán)(如帶電的胺)工程化設(shè)計(jì)為能偶聯(lián)目標(biāo)蛋白質(zhì)配體的接頭或間隔區(qū)。這些體系中的接頭也含有將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到接頭上的活化基團(tuán)。接頭首先連接到固體支持物，再與蛋白質(zhì)接觸。因此單分子接頭同時起著將蛋白質(zhì)共價連接到基質(zhì)和非共價地與蛋白質(zhì)相互作用的功能。這提供了在偶聯(lián)反應(yīng)前/中實(shí)體的預(yù)先連接。這ー技術(shù)已用于將聚糖偶聯(lián)到膜表面以進(jìn)行膜印跡凝膠電泳(美國專利5，543，054號；Charkoudian et al.,1995, Analytical Letters, 28 :1055)。另ー個接頭輔助偶聯(lián)的實(shí)例是市售產(chǎn)品Affi-Gel 15 (BioRad，Hercules, CA)。Affi-Gel 15 是ー種瓊脂糖支持物，經(jīng)NHS活化的羧酸作為其接頭臂的一部分含有帶正電的官能團(tuán)。此帶正電的官能團(tuán)是ー個仲胺。該胺在PH7. 4時被質(zhì)子化并允許偶聯(lián)等電點(diǎn)(Pl)小于6的蛋白質(zhì)。Affigel基質(zhì)和其他由接頭輔助偶聯(lián)產(chǎn)生的此類配體有局限性，由于連接基團(tuán)(帶正電)是蛋白質(zhì)偶聯(lián)接頭的一部分，使得兩種官能團(tuán)的比率固定在I : I。另ー個在美國專利5，260，373號中描述的帶電接頭臂是將A蛋白偶聯(lián)到瓊脂糖上包含了精氨酸的短接頭臂用于輔助蛋白質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖支持物上。精氨酸接頭用NHS活化并攜帯有正電荷。然而結(jié)果顯示，相比于無接頭輔助的偶聯(lián)，IgG結(jié)合容量僅有少量改進(jìn)。另外上面所述的I : I比率問題仍然存在。最近的美國專利申請10/928，731號描述了 A蛋白通過接頭結(jié)合到固體支持物上。在發(fā)酵和組織培養(yǎng)上，應(yīng)用同比放大的方法己能同時提高體積和靶分子濃度，如單克隆抗體的生產(chǎn)。產(chǎn)品濃度超過lg/L也不足為奇。這些產(chǎn)品在投入市場前需要經(jīng)過純化。因此，需要ー種具有提高的結(jié)合容量以提供良好的產(chǎn)品產(chǎn)率，并且經(jīng)濟(jì)而易于制造的層析基質(zhì)。本發(fā)明以下描述的多種實(shí)施方式滿足了這些以及其他需求。

發(fā)明內(nèi)容
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制造親和層析基質(zhì)的方法，其中所述基質(zhì)包含固體支持物和至少ー種蛋白質(zhì)配體，并且其中所述方法包括a)使締合基團(tuán)接觸所述固體支持物以使締合基團(tuán)與固體支持物反應(yīng)山)活化所述固體支持物(如添加活化基團(tuán))；c)使所述蛋白質(zhì)配體接觸所述固體支持物以使該蛋白質(zhì)配體結(jié)合到固體支持物上并與a)中的締合基團(tuán)相互作用。在ー些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種親和層析基質(zhì)，其包含a)固體支持物山)結(jié)合到所述固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)単獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，在固體支持物上所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體相互作用。在另ー些實(shí)施方式中，本發(fā)明給出了ー種從混合物中純化靶分子的方法，其包括I)在第一組條件下使所述混合物與親和層析基質(zhì)接觸，以使靶分子結(jié)合到基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，其中親和層析基質(zhì)包含a)固體支持物；b)結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)単獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，在固體支持物上所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體 相互作用；2)改變I)所述的條件以使靶分子不再結(jié)合在基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，以純化目標(biāo)物質(zhì)。任選地，可在步驟I和2之間使用諸如磷酸鹽緩沖液、水、以及下文提及的補(bǔ)充緩沖液等恰當(dāng)?shù)南礈煸噭┻M(jìn)行ー個或數(shù)個洗滌步驟。在步驟I之前基質(zhì)也可先用合適的緩沖液進(jìn)行平衡。其他實(shí)施方式中，本發(fā)明給出了ー種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法，其包括a)使締合基團(tuán)接觸固體支持物以使締合基團(tuán)與固體支持物進(jìn)行反應(yīng)；b)活化固體支持物；c)使蛋白質(zhì)配體接觸固體支持物，以使蛋白質(zhì)配體結(jié)合到固體支持物上并與a)中的締合基團(tuán)相作用。在進(jìn)ー步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種將A蛋白偶聯(lián)到瓊脂糖支持物上的方法，其包括a)使帶電物質(zhì)接觸瓊脂糖支持物以使帶電物質(zhì)與瓊脂糖支持物共價反應(yīng)；b)用活化基團(tuán)活化瓊脂糖支持物；c)使A蛋白接觸瓊脂糖支持物，以使A蛋白共價結(jié)合到固體支持物上，并非共價地與a)中的帶電物質(zhì)相互作用。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種親和層析基質(zhì)，其包含a)瓊脂糖支持物；b)共價結(jié)合到瓊脂糖支持物上的A蛋白；c)共價地結(jié)合到固體支持物上并非共價地與A蛋白相互作用的帶電物質(zhì)。在另ー些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種瓊脂糖珠，其包含至少10g/L蛋白質(zhì)配體，這些配體結(jié)合在瓊脂糖珠表面上。蛋白質(zhì)配體可作為親和配體如A蛋白、G蛋白，也可作為靶分子如目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)配體可不通過任何居于其間的接頭分子，而是通過活化的官能團(tuán)以如共價結(jié)合的方式結(jié)合到固體支持物上。蛋白質(zhì)配體也可非共價地同一個或數(shù)個締合基團(tuán)相互作用，這些締合基團(tuán)通過不同的共價鍵共價結(jié)合到固體支持物上，其間或有或無接頭分子的作用。因此在ー些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了非接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種非接頭輔助的，能偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體。在一些實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體単獨(dú)地通過共價鍵偶聯(lián)到固體支持物上。在其它實(shí)施方式中蛋白質(zhì)配體通過被活化的官能團(tuán)，在居于其間的接頭分子作用下，以如共價結(jié)合的方式結(jié)合到固體支持物上。蛋白質(zhì)配體也可非共價地與ー個或數(shù)個締合基團(tuán)相互作用，所述締合基團(tuán)不通過接頭分子便共價結(jié)合到固體支持物上。因此在ー些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了非接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)，以及有接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)，以及偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體，其中締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體的某部分群體是通過接頭偶聯(lián)到固體支持物上的。蛋白質(zhì)配體的某群體可通過接頭偶聯(lián)到固體支持物上，或者締合基團(tuán)的某群體可通過接頭偶聯(lián)到固體支持物上。在一些實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體均具有通過不同的接頭偶聯(lián)到固體支持物上的群體。在其他一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種接頭輔助的締合基團(tuán)，通過例如共價鍵的方式偶聯(lián)到固體支持物上。這種締合基團(tuán)也可在無接頭分子的情況下，與共價偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體以例如非共價的形式相互作用。本發(fā)明的其余目的和優(yōu)點(diǎn)一部分將通過之后的描述闡明，有些通過描述就能明確地獲知，或者可通過實(shí)踐本發(fā)明而認(rèn)識到。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)尤其將通過之后的權(quán)利要求書所指出的要素和結(jié) 合而被認(rèn)識和達(dá)到。應(yīng)當(dāng)理解，之前的一般性介紹和接下來詳細(xì)的描述僅是示例性的和解釋性的，并不是對請求保護(hù)的發(fā)明的限制。


圖I示出含A蛋白的不同親和層析介質(zhì)的動態(tài)及靜態(tài)容量。圖2比較了使用本發(fā)明的方法，當(dāng)用和不用締合基團(tuán)和配體輔助A蛋白進(jìn)行偶聯(lián)時，不同親和層析介質(zhì)的結(jié)合容量。圖3示出使用和未使用中間鹽緩沖液洗滌時，測定的洗脫池中CHO細(xì)胞蛋白(CHOP)的水平，以及結(jié)合到介質(zhì)上的宿主細(xì)胞蛋白的水平，所述介質(zhì)上含有不同量的締合基團(tuán)。IgG的回收率都類似， 90%-95%。圖4a示出通過進(jìn)行中間鹽洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了 A蛋白的介質(zhì)時，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖4b示出通過進(jìn)行中間鹽洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了 A蛋白的介質(zhì)時，洗脫池中DNA的水平的降低。圖5示出用不同pH和鹽濃度的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了 A蛋白的介質(zhì)時，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖6a示出用含有丙氨酸或甜菜堿的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了 A蛋白的介質(zhì)時，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖6b示出用含有不同氨基酸的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了 A蛋白的介質(zhì)時，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。
具體實(shí)施例方式將配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)(如配體輔助偶聯(lián))到諸如層析介質(zhì)的預(yù)成型的固體支持物上的方法，其中所述活化劑和締合基團(tuán)通過単獨(dú)的和不同的反應(yīng)連接到固體支持物上，并且其中所述活化劑和締合基團(tuán)在共價連接到固體支持物上的反應(yīng)之前并未連接，所述活化劑共價結(jié)合蛋白質(zhì)配體，而所述締合基團(tuán)非共價地與蛋白質(zhì)配體的作用加速了蛋白質(zhì)配體和活化劑間共價鍵的形成。所述的方法可包括a)使締合基團(tuán)與固體支持物反應(yīng)山)活化固體支持物；c)將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。一些實(shí)施方式中締合基團(tuán)與蛋白質(zhì)配體均可共價連接到固體支持物上，但不能互相共價結(jié)合，除非通過固體支持物。締合基團(tuán)和活化劑都可共價結(jié)合到固體支持物的外表面。蛋白質(zhì)配體可共價連接到已結(jié)合在固體支持物上的活化劑。締合基團(tuán)可通過與蛋白質(zhì)配體間比如非共價作用來促進(jìn)蛋白質(zhì)配體與活化劑之間共價鍵的形成，活化劑是共價結(jié)合在固體支持物的外表面的。也考慮蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)都可結(jié)合到固體支持物上可及的內(nèi)表面和孔。應(yīng)當(dāng)理解步驟a)和b)可按任何順序進(jìn)行。因此在ー些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了可用于將締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的兩步反應(yīng)。獨(dú)立進(jìn)行步驟a)_c)有ー些優(yōu)點(diǎn)，包括選擇締合基團(tuán)、蛋白質(zhì)配體和固體支持物的靈活性，并可通過控制締合基團(tuán)相對于蛋白質(zhì)配體的比例來優(yōu)化所需親和層析反應(yīng)的條件。這不同于前面所述將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法，例如接頭輔助偶聯(lián)，后者必將導(dǎo)致蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)的比例達(dá)到I : I。在過去描述的方法中，活化劑與締合基團(tuán)在被結(jié)合到固體支持物前會互相共價連接，或者直接摻入固體支持物中作為形成所述固體支持物的聚合反應(yīng)的一部分。這些方法缺乏靈活性，也不能對配體密度進(jìn)行優(yōu)化。其他ー些方法如隨機(jī)偶聯(lián)或多點(diǎn)連接取決于蛋白質(zhì)配體中的任何胺基。多點(diǎn)連接缺乏靈活性，不能控制蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)包括應(yīng)用兩種或多種不同的締合基團(tuán)和/或兩種或多種不同的蛋白質(zhì)配體。而另ー些優(yōu)點(diǎn)包括嚴(yán)密控制配體密度以優(yōu)化動態(tài)容量、靜態(tài)容量或其二者。其它優(yōu)點(diǎn)還在于限制了基質(zhì)上非特異性結(jié)合的不需要的雜質(zhì)的量。非特異性結(jié)合是過去已有的方法的特殊問題，它依賴于用結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)配體的物質(zhì)如包含胺基的物質(zhì)涂敷固體支持物。本發(fā)明提供的配體濃度控制避免了這些以前描述的方法中所發(fā)現(xiàn)的高非特異性結(jié)合水平。因此通過不聯(lián)合締合基團(tuán)和活化劑結(jié)合到固體支持物上的反應(yīng)，本發(fā)明能更好地控制活化劑和締合基團(tuán)的濃度比例，進(jìn)而更好地控制和修正用于分離靶蛋白質(zhì)的層析條件，如pH、緩沖液鹽濃度。因此本發(fā)明的一些實(shí)施方式預(yù)期了各種蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)的比例，包括蛋白質(zhì)配體濃度超過締合基團(tuán)時的比例，以及締合基團(tuán)濃度超過蛋白質(zhì)配體濃度時的比例。本發(fā)明的不同實(shí)施方式還預(yù)期使用了多種不同的締合基團(tuán)。本發(fā)明的不同實(shí)施方式預(yù)期了多種不同的能用于活化固體支持物的活化劑。同樣，預(yù)期多種不同的蛋白質(zhì)配體也可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式中。在本文中，蛋白質(zhì)配體是指結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)，它適合于特異性地結(jié)合目標(biāo)靶分子。蛋白質(zhì)可以包括全長蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì)的片斷或亞基、多肽、或蛋白質(zhì)的肽段。在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了將高濃度蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法。相比于以前描述的ー些方法，這轉(zhuǎn)而可提高靶分子的結(jié)合容量，如靜態(tài)容量(Qs)和動態(tài)容量(Qd)。例如使用以前的方法，典型地每ml固體支持物僅能負(fù)載4-6mg的n_A蛋白 即來源于葡萄球菌A的A蛋白)。而采用本發(fā)明的方法,姆ml固體支持物能負(fù)載7-100mg的A蛋白。在一些實(shí)施方式中固體支持物上能負(fù)載超過10mg/ml的A蛋白。在其它實(shí)施方式中固體支持物上至少能裝載8mg/ml。本發(fā)明的一些實(shí)施方式雖未重組改變A蛋白，如添加一半胱氨酸殘基，也未依賴于接頭輔助偶聯(lián)，但也都提高了靜態(tài)和動態(tài)容量。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括使至少ー種能與固體支持物反應(yīng)的締合基團(tuán)與固體支持物接觸。固體支持物可以是已經(jīng)形成的，如聚合支持物，它可與至少ー種締合基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。另ー些實(shí)施方式中，固體支持物沒有預(yù)形成，如非聚合的，從而將締合基團(tuán)添加到化學(xué)組分中，所述化學(xué)組分隨后與摻入的締合基團(tuán)反應(yīng)形成固體支持物。固體支持物和締合基團(tuán)間的反應(yīng)可導(dǎo)致其間共價鍵的形成。于是締合基團(tuán)可共價結(jié)合到固體支持物的外表面，也可結(jié)合到可及的內(nèi)表面，如孔。也考慮了涉及締合基團(tuán)的非共價相互作用，如離子相互作用、疏水相互作用、范德華カ和氫鍵。例如締合基團(tuán)可非共價地與帶電分子(如共價連接于固體支持物的聚合物)相互作用。締合基團(tuán)也可與蛋白質(zhì)配體相作用。因此固體支持物被活化后，蛋白質(zhì)配體能共價地結(jié)合到固體支持物上，并且非共價地與締合基團(tuán)相互作用。這樣非共價相互作用促進(jìn)蛋白質(zhì)配體共價結(jié)合到固體支持物上。在一些實(shí)施方式中締合基團(tuán)可直接與固體支持物反應(yīng)而不需要任何居間的或連接的分子。另ー些實(shí)施方式中締合基團(tuán)可作為ー種混合物提供，第一群締合基團(tuán)與固體支持物直接反應(yīng)，第二群締合基團(tuán)通過一個或多個接頭分子間接地與固體支持物反應(yīng)。另外接頭分子的活化作用可引起締合基團(tuán)的改變，至少將一些締合基團(tuán)摻入接頭分子中，也允許ー些締合基團(tuán)直接與固體支持物反應(yīng)，比如通過共價結(jié)合。由于某些化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)，設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)配體非共價相互作用的締合基團(tuán)可能會與活化基團(tuán)反應(yīng)，因此最終是通過包含締合基團(tuán)和活化基團(tuán)的接頭臂，而將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。然而這些活化反應(yīng)改變了固體支持物和締合基團(tuán)，造成蛋白質(zhì)偶聯(lián)位點(diǎn)的分散。這些位點(diǎn)中的一群包含了通過締合基團(tuán)而連接到固體支 持物上的活化基團(tuán)(比如經(jīng)CNBr活化的腫胺)。第二群締合基團(tuán)可能存在于包含了直接連接到底部基質(zhì)的活化基團(tuán)和未改性的締合基團(tuán)的偶聯(lián)位點(diǎn)上(比如具有未改性的仲胺的經(jīng)CNBr活化的底部基質(zhì))。這是“接頭輔助偶聯(lián)”(僅可能存在一群偶聯(lián)位點(diǎn))和“配體輔助偶聯(lián)”(存在至少兩個可變的群的偶聯(lián)位點(diǎn))差異的ー個例子。由于締合基團(tuán)與活化基團(tuán)在類型、量和反應(yīng)性上可獨(dú)立地變化，可應(yīng)用更寬范圍的偶聯(lián)條件和結(jié)構(gòu)。考慮了所有締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體間的非共價相互作用。與蛋白質(zhì)配體的非共價相互作用可包括例如離子相互作用、疏水相互作用、范德華力或氫鍵介導(dǎo)的相互作用。在一個實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體之間的相互作用是離子相互作用。比如帶正電的締合基團(tuán)可結(jié)合到固體支持物上。然后，固體支持物即以化學(xué)官能性活化，這將促進(jìn)蛋白質(zhì)配體化學(xué)結(jié)合到固體支持物上，如通過共價結(jié)合。包含蛋白質(zhì)配體溶液的pH值可被調(diào)節(jié)，以使蛋白質(zhì)攜帶同固體支持物相連接的締合基團(tuán)的電荷所互補(bǔ)的電荷，比如至少ー個負(fù)電荷或ー個凈負(fù)電荷。與固體支持物結(jié)合的帶正電締合基團(tuán)與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)之間的相互作用將促進(jìn)蛋白質(zhì)配體鍵合到已被活化的固體支持物上，同以前的方法相比還將提高結(jié)合容量。這些帶電物質(zhì)可以是離子，或帶凈電荷的分子。選擇合適的緩沖條件以將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是完全在能力范圍內(nèi)的。適合的緩沖液包括任何不含胺的緩沖液，如碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液。緩沖液的鹽濃度取決于所用的締合基團(tuán)。例如鹽濃度可在5nM-100mM之間。當(dāng)利用帶電物質(zhì)時，鹽濃度至少為5nM但低于O. 1M，至少為5nM但低于O. 01M，至少為5nM但低于O. 001M。在一些實(shí)施方式中鹽濃度可為O. OlM0當(dāng)利用疏水性種類時需要較高的鹽濃度。此時鹽濃度可大于O. 001M，大于O. 01M，大于O. 1M。實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為0°C到99°C的范圍。在一些實(shí)施方式中實(shí)施本方法的溫度低于60°C，低于40°C，低于20°C，低于10°C。在一些實(shí)施方式中實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為4°C。在其他一些實(shí)施方式中實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為20°C。締合基團(tuán)本發(fā)明中所用適合的締合基團(tuán)包括如離子性物質(zhì)的帶電物質(zhì)，以及如疏水性物質(zhì)的不帶電物質(zhì)。所述締合基團(tuán)可改性固體支持物，如直接共價結(jié)合固體支持物。離子性物質(zhì)的恰當(dāng)實(shí)例可包括季胺、叔胺、仲胺、伯胺、磺酸、碳酸、或其任意組合。疏水性物質(zhì)的恰當(dāng)實(shí)例可包括苯基、丁基、丙基、或其任意組合。同樣考慮可使用混合模式的物質(zhì)，如帶電物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的混合物。締合基團(tuán)也可與蛋白質(zhì)配體相互作用。因此締合基團(tuán)與蛋白質(zhì)配體的相互作用可以包括混合物的相互作用，例如離子性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)。締合基團(tuán)可通過使固體支持物上的官能團(tuán)和締合基團(tuán)上的官能團(tuán)的反應(yīng)而被共價偶聯(lián)到固體支持物。合適的官能團(tuán)包括，但不僅限于胺、羥基、巰基、羧基、亞胺、醛、酮、烯、炔、偶氮、腈、環(huán)氧化物、氰和被活化的羧酸基團(tuán)。例如瓊脂糖珠包含的羥基可與如縮水甘油三甲基氯化銨這樣的帶正電締合基團(tuán)的環(huán)氧化物官能團(tuán)反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到只要使用至少ー種雙功能締合基團(tuán)，多種締合基團(tuán)就可偶聯(lián)到固體支持物。因此締合基團(tuán)可先后被偶聯(lián)到固體支持物上，或者可単獨(dú)地直接偶聯(lián)到固體支持物上。 蛋白質(zhì)配體和革巴分子任何蛋白質(zhì)配體可應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)踐中，只要它是目標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的配偶體。蛋白質(zhì)配體的實(shí)例可包括A蛋白、G蛋白、抗體的Fe受體、激素或生長因子的受體。蛋白質(zhì)配體可以是免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或它們的片段。片段可包括保留了結(jié)合靶抗原表位、和/或結(jié)合Fe受體、和/或A蛋白和/或G蛋白的能力的免疫球蛋白片段。蛋白質(zhì)配體可以是Fe分子或其片段，F(xiàn)ab或其類似物，ー種酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，酪氨酸激酶如MAP、Src、Lck，一種底物如谷胱甘肽。蛋白質(zhì)配體可以是ー個蛋白質(zhì)標(biāo)簽，如帶有ー個或多個組氨酸的多肽。蛋白質(zhì)配體可以是融合蛋白如Embrel 。蛋白質(zhì)配體可以是結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸，如轉(zhuǎn)錄因子、逆轉(zhuǎn)錄酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、螺旋酶。在本發(fā)明的方法中假如靶分子是ー個受體，其配體如生長因子可作為蛋白質(zhì)配體。當(dāng)靶分子為ー免疫球蛋白如IgG或包含至少ー個Fe區(qū)段部分的IgG片段，蛋白質(zhì)配體就可為A蛋白、G蛋白或其功能性片段。其功能性片段包括保留了結(jié)合Fe區(qū)域、或IgG的Fe片段的能力的A蛋白片段或G蛋白片段。蛋白質(zhì)配體可以是ー個天然存在的分子或工程化的分子。在一些實(shí)施方式中需要基因改造天然存在的蛋白質(zhì)配體以促進(jìn)其結(jié)合到固體支持物上或?qū)⑵涠ㄏ虻焦腆w支持物上或兼具這二者功能。因此，依賴所用的締合基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將帶電基團(tuán)、或疏水性基團(tuán)、或此二者工程化到蛋白質(zhì)配體中。這些改變可在蛋白質(zhì)配體的任何位置進(jìn)行。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)配體是A蛋白時，如果使用n-A蛋白(天然存在)，本發(fā)明提供了大于50mg/ml的靜態(tài)結(jié)合容量Qs,如果使用r-Α蛋白(重組A蛋白)則提供了大于65mg/ml的靜態(tài)結(jié)合容量Qs。重組A蛋白可包括除末端半胱氨酸外的修飾。當(dāng)固體支持物在溶液中提供時，如珠，合適的蛋白質(zhì)配體濃度是O. 05-700 μ mol/ml固體支持物、O. l-100ymol/ml固體支持物。靶分子可包括特異地結(jié)合到所選蛋白質(zhì)配體上的任何分子。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)配體是A蛋白或G蛋白時，靶分子可包括IgG亞類的免疫球蛋白。靶分子的具體實(shí)例包括單克隆抗體。同樣考慮保留了結(jié)合所選蛋白質(zhì)配體的能力的免疫球蛋白片段。靶分子也可以是融合蛋白，包括Fe融合蛋白，如Embrel 。固體支持物和活化劑任何多孔材料均可用作固體支持物。作為實(shí)例而非限制，多孔材料可采用膜、珠、凝膠、盒、柱、芯片、滑片板或單塊。多孔材料可包括有機(jī)或無機(jī)分子或其組合，也可包括一種或數(shù)種適合于反應(yīng)(如與締合基團(tuán)、活化劑或兩者形成共價鍵)進(jìn)行的官能團(tuán)(如羥基)。多孔材料可包括親水性化合物、疏水性化合物、疏油性化合物、親油性化合物或其任意組合。多孔材料可包括聚合物或共聚物。合適的多孔材料的實(shí)例包括但不僅限于聚醚砜、聚酰胺如瓊脂糖、纖維素、多糖、聚四氟こ烯、聚砜、聚酯、聚偏氟こ烯、聚丙烯、碳氟化合物如聚(四氟こ烯-共-全氟(烷基こ烯醚)、聚碳酸酷、聚こ烯、玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(B,惡唑酮)、聚苯こ烯、陶瓷、尼龍和金屬。固體支持物可用恰當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團(tuán)來活化。合適的化學(xué)官能團(tuán)包括氰如溴化氰，醛，環(huán)氧化物，經(jīng)活化的羧酸如N-羥基琥珀酰亞胺酷，或其任意組合物。或者，當(dāng)締合基團(tuán)是伯胺、仲胺或叔胺時，締合基團(tuán)能被表氯醇或雙功能環(huán)氧化物活化。接頭在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了可通過居間接頭偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)和/或蛋白質(zhì)配體。此接頭包含至少ー個偶聯(lián)到連接部分的官能團(tuán)。連接部分可包括任何能被偶聯(lián)到官能團(tuán)的分子。因此連接部分可以包括任何烷基、鏈烯基或炔基。連接部分可包含有1-30個碳原子的碳鏈。在一些實(shí)施方式中接頭可包含超過30個碳原子。連接部分可包含至少ー個雜原子如氮、氧和硫。連接部分可包含支鏈、直鏈或環(huán)狀鏈。連接部分可被兩個或多個官能團(tuán)所取代。ー個特定實(shí)施方式中接頭可包含下列通過羥基連接到瓊脂糖的基團(tuán)CH2CH2N (CH2CH3) 2CH2CH (OH) CH2O (CH2) 40CH2CH (0) CH2。純化靶分子的方法在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了從混合物中純化靶分子的方法。靶分子可以是任何分子，其帶有特異性結(jié)合配偶體，該特異性結(jié)合配偶體可偶聯(lián)到固體支持物上。靶分子的實(shí)例包括蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白)。免疫球蛋白可以是多克隆抗體或單克隆抗體或其功能片段。功能片段可包括任何包含可變區(qū)的免疫球蛋白的片段，其仍然特異性結(jié)合其抗原，同時保持了特異性結(jié)合偶聯(lián)于固體支持物的蛋白質(zhì)配體的能力。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括a)在第一組條件下使包含靶分子的混合物接觸本發(fā)明(本文所描述)的固體支持物，以使靶分子特異性結(jié)合蛋白質(zhì)配體，偶聯(lián)于固體支持物；b)改變條件以使靶分子不再結(jié)合在親和配體上。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括改變步驟a)和b)之間的pH值。在一些實(shí)施方式中進(jìn)行步驟b)的pH比步驟a)的pH更呈酸性。因此步驟a)可在中性pH (例如pH6-8)進(jìn)行，而步驟b)可在酸性pH (如ρΗ1_6)進(jìn)行。另ー些實(shí)施方式中本方法包括改變緩沖液的鹽濃度。因此在ー個實(shí)施方式中步驟a)可使用高鹽濃度，如大于O. 1M，和/或步驟b)可使用低鹽濃度,如小于O. 1M。另ー些實(shí)施方式中步驟a)可使用低鹽濃度,如小于O. 1M，和/或步驟b)可使用高鹽濃度。在其它實(shí)施方式中步驟a)和步驟b)之間的緩沖液pH值和/或鹽濃度均可改變。I.層析基質(zhì)的中間洗滌
在一些實(shí)施方式中本發(fā)明也提供了洗滌層析基質(zhì)以除去非特異結(jié)合的雜質(zhì)，由此得到更純凈的終產(chǎn)物的方法?；|(zhì)可包括本領(lǐng)域任何公知的層析基質(zhì)。例如層析基質(zhì)可以是ー種親和基質(zhì)。親和基質(zhì)可以是本文所描述的任何親和基質(zhì)，包括通過配體輔助偶聯(lián)制作的親和基質(zhì)。該方法可包括在靶分子結(jié)合到層析基質(zhì)上以后進(jìn)行一次中間洗滌。一般地，非特異性吸附的雜質(zhì)可包括除靶分子或產(chǎn)物之外的任何組分。非特異性結(jié)合的雜質(zhì)的例子可包括蛋白質(zhì)、DNA、脂類、內(nèi)毒素、病毒顆粒，及其他小分子包括酚紅、蛋白胨、泊洛沙姆、氨基酸。中間洗滌試劑可包括平衡緩沖液，或與進(jìn)料液(即含有未純化樣品的溶液)有相似pH和鹽濃度的緩沖液,進(jìn)ー步包含a)提高濃度的鹽(如氯化鈉、氯化銨、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸銨等)，或b) 不同的pH值(更低或更高)，或c)a)和b)的組合，或d)添加剤，如表面活性劑(如吐溫)、氨基酸及其衍生物、或有機(jī)溶質(zhì)(如こニ醇)。與PBS這樣的洗滌溶液相比，該中間洗滌可降低某些種類的非特異性結(jié)合2-5倍。在一些實(shí)施方式中，與眾所周知的PBS之類的洗滌溶液相比，可降低某些種類的非特異性結(jié)合超過5倍。在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了洗滌親和基質(zhì)以除去非特異性結(jié)合種類的方法，包括使具有弱堿性PH(如7. 3-7. 5)以及添加鹽濃度為O-IM的緩沖液接觸親和基質(zhì)。因此，緩沖液可以是PBS或任何其他合適的緩沖液，并進(jìn)一歩添加額外的鹽。在一些實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是O. 15M到1M。在其它實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是O. 25M到1M。在另ー些實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是O. 25M到O. 5M。在一些實(shí)施方式中鹽濃度大于O. 0001M但低于O. 8M。其他實(shí)施方式中的緩沖液，如PBS或任何其他合適的緩沖液，具有酸性pH(如6. 5)且添加鹽濃度小于1M、大于O. 0001M(如O. 4M)。在其它實(shí)施方式的緩沖液具有弱堿性pH值(如7. 3-7. 5)。一些實(shí)施方式中洗漆緩沖液可包含ー種或多種帶電氨基酸。洗漆緩沖液可包含氨基酸或烷基化氨基酸，包括甜菜堿、L-丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、和賴氨酸。氨基酸或烷基化氨基酸的濃度可為O. 25M到O. 5M。一些實(shí)施方式中氨基酸或烷基化氨基酸濃度小于O. 5M但大于O. OOOlM0其它實(shí)施方式中氨基酸或烷基化氨基酸濃度的范圍是從O. 0001M到1M。中間洗滌緩沖液所用的合適的氨基酸包括但不僅限于甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及氨基酸衍生物如η-甲基甘氨酸和三甲基β-丙氨酸。在一些實(shí)施方式中，中間沖滌緩沖液包括添加氨基酸或氨基酸衍生物的緩沖液，所述緩沖液具有弱酸性PH值，如pH范圍在6. 0-6. 99。實(shí)施例實(shí)施例I :使用季銨類配體、溴化氰和n-A蛋白(14/mg/ml)進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography, 51 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare,Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。根據(jù)下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)如陽離子反應(yīng)在IOOmL的75%重量的縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC)和3. 3g的50%重量的氫氧化鈉中加入IOOmL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。再將這些珠過濾并用三個200mL體積的Milli-Q 水(Millipore 公司，Billerica, MA)進(jìn)行洗漆。珠(IOmL)經(jīng)過濾后置于20mL IM的Na2CO3中平衡。再將樣品與第二個每毫升こ腈含O. 5g CNBr的罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。一旦溶液冷卻，將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振蕩儀上(> IOOrpm)。2分鐘后再將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振蕩儀上(> IOOrpm)。允許珠反應(yīng)4分鐘,然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的O. 012M的NaHCO3進(jìn)行洗滌并過濾。再將過濾的珠餅(IOmL)加入到含有140mg n-A蛋白(14mg/mL)的IOmL的O. 012MNaHC03。珠在室溫振蕩過夜。接著用O. 2M NaHCO3洗滌并過濾。將珠餅加入20mL O. 2M NaHCO3中的O. 5M氨基こ醇中。30分鐘后用O. 2MNaHC03,含O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉(ρΗ4· 5)，最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。靜態(tài)和動態(tài)容量的測定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例2 :使用季銨類配體、溴化氰和n-A蛋白(17. 8mg/ml)進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography,51 : 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare,Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。依下述方法使瓊脂糖顆粒與帶正電的締合基團(tuán)如陽離子反應(yīng)在IOOmL的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨)(GTMAC)和3. 3g的50%重量氫氧化鈉中加入IOOmL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后過濾珠，并用三個200mL體積的 Milli-Q 水(Millipore 公司，Billerica, MA)進(jìn)行洗漆。珠(IOmL)經(jīng)過濾后置于20mL IM的Na2CO3中平衡。再將樣品與每毫升こ腈含O. 5gCNBr的第二個罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。溶液冷卻后，將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。2分鐘后再向珠加入I. 5mL的CNBrこ腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的O. 012M的NaHCO3進(jìn)行洗滌并過濾。再將過濾的珠餅(IOmL)加入到含有285mg n-A蛋白(17. 8mg/mL)的16mL O. 012M NaHCO3中。珠在室溫振蕩過夜。接著用O. 2M NaHCO3洗滌并過濾。將珠餅加入20mL O. 2MNaHC03中的O. 5M氨基こ醇中。30分鐘后用O. 2M NaHCO3、含O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉(pH4. 5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其靜態(tài)和動態(tài)容量的測定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例3 :使用季銨類配體、溴化氰和r-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography, 51 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare,Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。依下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)如陽離子反應(yīng)在IOOmL的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC)和3. 3g的50%重量氫氧化鈉中加入IOOmL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后過濾珠并用三個200mL體積的Milli-Q水進(jìn)行洗滌。珠(IOmL)經(jīng)過濾后置于20mL IM的Na2CO3中平衡。再將樣品與每毫升ZJ青含0. 5g CNBr的第二個罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。一旦溶液冷卻，立即將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。2分鐘后再向珠加入I. 5mL的CNBrこ腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘,然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0. 012M的NaHCO3洗滌并過濾。再將過濾的珠餅(IOmL)加入到含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的IOmL 0. 012MNaHC03溶液中。珠在室溫振蕩過夜。接著用0. 2M NaHCO3洗滌珠并過濾。將珠餅加入20mL 0. 2M NaHCO3中的0. 5M氨基こ醇中。30分鐘后用O. 2MNaHC03、含O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉溶液(ρΗ4· 5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其靜態(tài)和動態(tài)容量的測定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例4 :不使用季胺類配體，用溴化氰和n-A蛋白(17. 8mg/ml)進(jìn)行無配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方 法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography, 51 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare,Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。然后過濾珠并用三個200mL體積的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。
珠(IOmL)經(jīng)過濾后置于20mL IM的Na2CO3中平衡。將樣品與每毫升こ腈含O. 5gCNBr的第二個罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。溶液冷卻后，將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。2分鐘后再向珠加入I. 5mL的CNBrこ腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的O. 012M的NaHCO3洗滌并過濾。將過濾的珠餅(IOmL)加入到含有285mgn-A蛋白(17.8mg/mL)的16mL O. 012M NaHCO3溶液中。珠在室溫振蕩過夜。接著用O. 2MNaHCO3洗滌并過濾。將珠餅加入20mL O. 2MNaHC03中的O. 5M氨基こ醇。30分鐘后用O. 2MNaHCO3、含O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉溶液(pH4. 5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其動態(tài)和靜態(tài)容量的測定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例5 :不使用季胺類配體，用溴化氰和r-A蛋白進(jìn)行無配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography, 51 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare,Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。然后過濾珠并用三個200mL體積的Milli-Q 水(Millipore公司，Billerica,MA)進(jìn)行洗漆。珠(IOmL)經(jīng)過濾后置于20mL IM的Na2CO3中平衡。再將樣品與每毫升こ腈含O. 5g CNBr的第二個罐一起置于冰上進(jìn)行冷卻。溶液冷卻后，將I. 5mL的CNBrこ腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。2分鐘后再向珠加入I. 5mL的CNBrこ腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(> IOOrpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的O. 012M的NaHCO3進(jìn)行洗滌并過濾。再將過濾的珠餅(IOmL)加入到IOmL含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的O. 012M NaHC03。珠在室溫振蕩過夜。接著用O. 2MNaHCO3洗滌珠并過濾。將珠餅加入20mL O. 2M NaHCO3中的O. 5M氨基こ醇。30分鐘后用O. 2M NaHCO3、含O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉溶液(pH4. 5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其動態(tài)和靜態(tài)容量的測定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例6 :使用季銨類配體、丁ニ醇ニ縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過去已被描述的方法(Porathand Fornstedt, 1970, J. Chromatography, 51 479)將瓊脂糖珠(Sepharose 4B) (GE Healthcare, Piscataway NJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。按照下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽離子)反應(yīng)在40g的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨)(GTMAC)、IOmLMilli-Q水和I. 67g的50%重量氫氧化鈉中加入50mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后過濾珠并用三個IOOmL體積的Milli-Q 水(Millipore公司，Billerica,MA)進(jìn)行洗漆。珠樣品用下述方法進(jìn)行滴定以測定季銨配體密度。將珠(50mL，濾餅)添加到含有15mL 4. 6M NaOH的罐中。漿化混合物，然后加入19. 5mL的丁ニ醇ニ縮水甘油醚(BUDGE)。該混合物在35°C振蕩2小時。再將顆粒用750mLMilli-Q 水(Millipore 公司，Billerica，MA)洗滌，用 250mL 的 IOmM NaHCO3 平衡。BUDGE活化步驟后立即將IOmL珠濾餅加入IOmL含30g/L濃度n_A蛋白的IOmMNaHCO3的溶液中。使珠在雜交儀中37 °C旋轉(zhuǎn)2小吋。2小時后用30mL Milli-Q 水(Millipore公司，Billerica,MA)洗漆珠。再將珠濾餅(IOmL)加入一盛有由ImL巰基こ醇、9mL具有0. 2M NaHCOjPO. 5MNaCl的緩沖液組成的IOmL溶液的罐中。漿化混合物并在室溫旋轉(zhuǎn)過夜。再將珠用30mL的下列緩沖液洗滌0. IM Tris緩沖液(pH8)，添加了 0. 15MNaCl的 0. IM Tris 緩沖液(pH8), 50mM 醋酸(ρΗ4· 5)，含 O. 002%疊氮化鈉的 PBS (ρΗ7. 4)。用前、述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測定(Pierce, Rockford, IL)以n_A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的A蛋白配體密度見下表I。實(shí)施例7 :使用季銨類配體、丁ニ醇ニ縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)實(shí)施例7中的珠與實(shí)施例6中的一祥,差別在于加入締合基團(tuán)。根據(jù)下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽離子)反應(yīng)在25g的75%重量GTMAC，25mLMilli-Q 水，和I. 67g的50%重量氫氧化鈉中加入50mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后過濾珠并用三個IOOmL體積的Milli-OS^jC (Millipore公司， Billerica, MA)進(jìn)行洗滌。之后所有的步驟(BUDGE活化和A蛋白偶聯(lián))都與實(shí)施例6 —樣。然后，用前述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測定(Pierce，Rockford，IL) Wn-A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的A蛋白配體密度見下表I。實(shí)施例8 :使用季銨類配體、丁ニ醇ニ縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)實(shí)施例8中的珠與實(shí)施例6中的一祥，差別在于加入締合基團(tuán)。按照下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽離子)反應(yīng)在IOg的75%重量GTMAC，40mLMilli-Q 水(]\^11丨？0代公司，8丨1161^0&，嫩)，和1.678的50%重量氫氧化鈉中加入50111し珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(> IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后過濾珠并用三個IOOmL體積的Milli-Q 水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。之后所有的步驟(BUDGE活化和A蛋白偶聯(lián))都與實(shí)施例6—祥。用前述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測定(Pierce, Rockford, IL)以n_A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的A蛋白配體密度見下表I。表I.實(shí)施例6-8中的介質(zhì)特性總結(jié)
締合配體密度靜態(tài)容量A蛋白配體
(μπιοΙ/mL)(g/L)密度(g/L)
_實(shí)施例 __20-40 __71__15_
_實(shí)施例 __10-20__68__14_
_實(shí)施例 8__5-10__64__12 _
Q-Sepharose FF170-180
Mabselect559實(shí)施例9 :使用季銨類配體、表氯醇和n-A蛋白在CPG上進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)可控孔度玻璃(CPG)(Millipore 公司，Billerica，MA)LCA_CPG 1000A 用于使用締合基團(tuán)輔助將A蛋白偶聯(lián)到CPG上。將LCA-CPG(IOmL)加入到IOmL含50%重量的縮水甘油基三甲基氯化銨。反應(yīng)在30°C輕微振蕩(く IOOrpm)進(jìn)行過夜。然后用50mLMilli-Q 水(Millipore公司，Billerica，MA)洗滌CPG并過濾形成一干餅。再將CPG加入到35mL含表氯醇(6%重量)的水溶液中，在30°C輕微振蕩2分鐘。然后用100mLMilli-Q 水(Millipore公司，Bi I lerica, MA)洗漆珠,然后過濾形成一干餅。將珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL濃度的n-A蛋白的0. OlM NaHCO3中。偶聯(lián)反應(yīng)在35°C輕微振蕩進(jìn)行過夜。再用IOOmL Milli-Q 水(Millipore公司，Billerica, MA)洗漆珠并過濾形成一干餅。然后將珠加入到IOmL O. IM Tris緩沖液中的IM氨基こ醇，pH8。反應(yīng)I小時后用各50mL的O. 2MNaHCO3，添加了 O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉(pH4. 5)洗滌珠，最后用磷酸鹽緩沖液洗滌珠。按前述方法測定靜態(tài)容量，結(jié)果示于表2。締合基團(tuán)濃度用元素分析法測定。實(shí)施例10 :不使用季銨類配體和表氯醇，在CPG上進(jìn)行n-A蛋白的配體偶聯(lián) 可控孔度玻璃(CPG)(Millipore 公司，Bi I lerica，MA) ProS 印 5-CH01000A 用于不使用締合基團(tuán)輔助將A蛋白偶聯(lián)到CPG上。將5-CH0珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL濃度n-A蛋白的O. OlM NaHCO3中。偶聯(lián)反應(yīng)在35°C輕微振蕩進(jìn)行過夜。然后用IOOmLMilli-Q 水(Millipore公司，Billerica, MA)洗漆珠并過濾形成一干餅。然后將珠加入到IOmLO. IMTris緩沖液中的IM氨基こ醇，pH8。反應(yīng)I小時后用各50mL的O. 2MNaHC03，添加了O. 5M NaCl的O. IM醋酸鈉(pH4. 5)洗滌珠，最后用磷酸鹽緩沖液洗滌珠。按前述方法測定靜態(tài)容量，結(jié)果示于表2。締合基團(tuán)濃度用元素分析法測定。表2.實(shí)施例9和10的介質(zhì)特性的總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種親和層析基質(zhì)，其包含a)固體支持物；b)結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，其中所述的締合基團(tuán)非共價地與所述的蛋白質(zhì)配體相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的固體支持物是珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的珠是瓊脂糖珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的締合基團(tuán)是帶電物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的帶電物質(zhì)帶有正電荷。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的帶電物質(zhì)帶有負(fù)電荷。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的締合基團(tuán)是疏水性的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)配體選自A蛋白和G蛋白。
9.一種從混合物中純化靶分子的方法，該方法包括 1)使混合物在第一組條件下與親和層析基質(zhì)接觸，以使所述靶分子結(jié)合到所述基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，其中所述的親和層析基質(zhì)包含a)固體支持物；b)結(jié)合到所述固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，其中所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體相互作用；以及 2)改變I)的條件，使所述靶分子不再結(jié)合到所述基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，以純化目標(biāo)物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的靶分子是免疫球蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的靶分子是融合蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的融合蛋白是Fe融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其進(jìn)一步包括中間洗滌步驟以除去雜質(zhì)，該步驟包括在步驟I)之后、步驟2)之前，使洗滌緩沖液接觸瓊脂糖支持物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的雜質(zhì)包括小分子、蛋白質(zhì)、核酸或其任意組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液包含酸性pH值、鹽或兩者。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的pH值范圍為5-6.99。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液的pH值范圍為5.0-8. O。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液具有堿性pH值，并包含大于O. 0001M 但小于 O. 8M 的 NaCl。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的pH為7.4。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液包含氨基酸或烷基化氨基酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的氨基酸或烷基化氨基酸選自L-丙氨酸、甜菜堿、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸和賴氨酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的氨基酸是帶電氨基酸。
24.一種親和層析基質(zhì)，其包含a)瓊脂糖支持物；b)共價結(jié)合到所述瓊脂糖支持物上的A蛋白；和c)帶電物質(zhì)，其單獨(dú)地共價結(jié)合固體支持物并非共價地與A蛋白相互作用。
25.一種瓊脂糖珠，其包含至少10g/L結(jié)合在所述瓊脂糖珠表面上的A蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種親和層析基質(zhì)及其制備和使用方法。本發(fā)明提供了將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法。本發(fā)明還提供了親和層析基質(zhì)，和用親和層析基質(zhì)純化靶分子的方法。
文檔編號B01J20/30GK102626610SQ20121012158
公開日2012年8月8日 申請日期2007年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者J·烏瑪納, J·查庫迪恩, N·索伊斯, 卞南英, 王陳 申請人:Emd密理博公司