專利名稱：一種蛋白a吸附介質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及抗體吸附技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白A吸附介質(zhì)。
背景技術(shù)：
蛋白A來源于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁，全稱為金黃色葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱蛋白A或SPA。天然蛋白A的基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成，共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約42kd,包含E、D、A、B、C和X (從氨基端至羧基端)共六個(gè)結(jié)構(gòu)域。眾所周知，由于蛋白A能選擇性吸附人或哺乳動(dòng)物的抗體(主要為IgG、也包括部分的IgA和IgM)，因而被廣泛應(yīng)用于抗體純化、醫(yī)學(xué)診斷及臨床治療等多個(gè)領(lǐng)域。在臨床治療方面，以蛋白A為配體的蛋白A吸附介質(zhì)被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，以及用于降低腎移植患者的抗體水平等，并取得了較好的療效。目前在國外市場(chǎng)上應(yīng)用的蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品(將蛋白A吸附介質(zhì)填裝于柱 體中制成)主要有Prosorba和Immunosorba兩種,均為Fresenius Medical Care公司生產(chǎn)。由于蛋白A免疫吸附柱在臨床治療過程中屬于體內(nèi)應(yīng)用(屬于三類醫(yī)療器械)，對(duì)人體具有潛在危險(xiǎn)，因而必須對(duì)其安全性、有效性進(jìn)行嚴(yán)格控制。但由于蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌后會(huì)部分或完全失去抗體吸附性能，目前的蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品均未進(jìn)行最終滅菌，這無疑增加了產(chǎn)品的安全性風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致必須對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)過程進(jìn)行更為嚴(yán)格的控制(即無菌生產(chǎn)工藝)，使工藝流程更為復(fù)雜。事實(shí)上，目前尚未有能夠耐受熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可耐受熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)，以解決蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品不能進(jìn)行產(chǎn)品最終滅菌的問題。本發(fā)明所述的蛋白A吸附介質(zhì)是一種可耐受121. 50C >20分鐘熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)，它是由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配體構(gòu)成，所述配體是具有如序列表中SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的重組蛋白A，并且由以下步驟制備
a、將固相載體材料按質(zhì)量比I:1. 5與O. 2M高碘酸鈉溶液混勻，15_25°C振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到填料；
b、于步驟a所得的填料中加入含具有如序列表中SEQID NO. I所示的氨基酸序列的重組蛋白A的硼酸鹽緩沖液，使每克填料對(duì)應(yīng)的重組蛋白A質(zhì)量不低于10mg，15-25°C振搖反應(yīng)8小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到合成填料；
C、于步驟b所得的合成填料中按質(zhì)量比I :1. 5加入含1%硼氫化鈉的PBS溶液，15-250C振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈后即得。根據(jù)本發(fā)明所述蛋白A吸附介質(zhì)的進(jìn)一步特征，所述固相載體材料是瓊脂糖凝膠微球。


圖I是重組蛋白A制備過程中各樣品的SDS-PAGE電泳圖，泳道I是超聲破碎細(xì)胞并離心后獲得的沉淀；泳道2是超聲破碎細(xì)胞并離心后獲得的上清；泳道3是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，自上而下依次為97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和14kd ;泳道4為鈷離子螯合親和層析純化的穿流峰；泳道5為最終獲得的重組蛋白A ;泳道6和7為鈷離子螯合親和層析純化的洗脫液；泳道8為經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌總蛋白。圖2是編號(hào)為①的蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌前后的血漿吸附試驗(yàn)的洗脫液的SDS-PAGE電泳圖，泳道I是熱壓滅菌前的吸附介質(zhì)的洗脫液；泳道2、3、4分別是熱壓滅菌后的吸附介質(zhì)在循環(huán)1、2、3的洗脫液；泳道5是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，自上而下依次為97kd、66kd、44kd、29kd、20kd和 14kd。圖3是編號(hào)① ④的蛋白A吸附介質(zhì)在熱壓滅菌前后的抗體吸附量。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，這并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。一、重組蛋白A的制備
通過以下方法獲得重組蛋白A的基因編碼序列
1、直接合成全序列(SEQID NO. 2)；
2、合成構(gòu)成重組蛋白A的重復(fù)單元的編碼序列(SEQID NO. 3)，在該序列兩端分別有一個(gè)AccI的酶切位點(diǎn)，由于AccI的識(shí)別序列是非回文序列，因此含重復(fù)單元編碼序列的DNA片段經(jīng)該酶酶切后，可保證首尾相連地連接起來，獲得含若干個(gè)重復(fù)單元編碼序列的DNA片段(Nilsson B, et al. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcalprotein A. Protein Engineering, vol. 1,1987, pl07_113),再從中挑選出具有全序列(SEQ ID NO. 2)的重組蛋白A的基因編碼序列。在獲得重組蛋白A編碼序列的同時(shí)，在該序列兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，通過酶切連接反應(yīng)將其連接入適合于大腸桿菌宿主細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒，并將所獲得的包含重組蛋白A編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、蛋白表達(dá)和純化后獲得重組蛋白A。上述合適的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)包括Ndel、XhoI等，只要能將重組蛋白A編碼序列連接入相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒均可。上述適合于大腸桿菌宿主細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒包括本領(lǐng)域常見的pQE系列(Qiagen公司生產(chǎn))、pET系列(Novagen公司生產(chǎn))等，只要該質(zhì)粒能穩(wěn)定存在于大腸桿菌宿主細(xì)胞，并一定條件下(如添加誘導(dǎo)劑)可表達(dá)其包含的外源基因。上述大腸桿菌菌株包括BL21 (DE3)、JM109、DH5 a、Origami等,只要該菌株能表達(dá)其所包含的存在于表達(dá)質(zhì)粒上的外源基因。上述在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，大腸桿菌中外源基因的表達(dá)部分)。上述蛋白純化方法包括金屬離子螯合層析、親和層析、離子交換層析、分子篩層析等的一種或幾種，只要該方法能獲取純度高于80%的重組蛋白A。
實(shí)施例重組蛋白A的制備
直接合成包含重組蛋白A的重復(fù)單元編碼序列的DNA片段(SEQ ID NO. 3)，經(jīng)NdeI和XhoI酶切后，將上述DNA片段連接入載體本領(lǐng)域公知的載體pUC18，用AccI酶切該載體，將所得小片段進(jìn)行首尾連接，再與載體片段連接，可得含若干個(gè)重復(fù)單元編碼序列的重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定篩選出含本發(fā)明所述的重組蛋白A編碼序列(SEQ ID NO. 2)的重組質(zhì)粒，通過NdeI和XhoI酶切將重組蛋白A編碼序列轉(zhuǎn)移至本領(lǐng)域公知的原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b，得到重組表達(dá)質(zhì)粒。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)，獲得的重組表達(dá)菌株分別接種于10個(gè)三角瓶，每瓶含IL滅菌LB培養(yǎng)基，于37°C振搖培養(yǎng)至0D600=1. 2，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度為O. 5mM,繼續(xù)振搖4小時(shí)后，IOOOOg離心IOmin收集細(xì)菌，濕重約90克；混勻于500mlPBS緩沖液，超聲破碎細(xì)胞后IOOOOg離心IOmin收集上清組分，經(jīng)鈷離子螯合親和層析純化，用180mM咪唑的PBS緩沖液沖洗并收集洗脫液1560ml，加入-20°C預(yù)冷的無水乙醇至乙醇濃度為75%，靜置I小時(shí)以上，IOOOOg離心lOmin，棄上清并將沉淀重溶于IOOml硼酸鹽緩沖液(pH8_9)，獲得重組蛋白A，其濃度以紫外法測(cè)定重組蛋白A (mg/ml) =A275/0. 2139，經(jīng)測(cè)定濃度為12. 5mg/ml。 二、蛋白A吸附介質(zhì)的制備
將重組蛋白A與固相載體偶聯(lián)，以獲得相應(yīng)的吸附介質(zhì)。所述固相載體可以選自瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖或聚乙烯醇等天然或合成高分子材料，應(yīng)具有良好的親水性且本身基本不吸附蛋白質(zhì)。所述重組蛋白A與固相載體偶聯(lián)的方法包括以下步驟
①載體的活化，常見的活化試劑包括環(huán)氧乙烷、環(huán)氧氯丙烷、溴化氰、高碘酸鈉等；
②蛋白質(zhì)通過其氨基和/或巰基與活化基團(tuán)反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。在蛋白配體與載體之間可以加入間隔臂以有利于蛋白配體的偶聯(lián)反應(yīng)和抗體吸附。實(shí)施例蛋白A吸附介質(zhì)的制備
將40克瓊脂糖凝膠S印harose 6FF按質(zhì)量體積比I :1. 5與60ml O. 2M高碘酸鈉溶液混勻，室溫(15-25°C )下200rpm振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水多次洗滌干凈后分為4等份，每份8-10克，加入濃度為10mg/ml的重組蛋白A，使每g填料對(duì)應(yīng)的重組蛋白A質(zhì)量依次為10mg、15mg、20mg、25mg,室溫(15_25°C )下200rpm振搖反應(yīng)8小時(shí),再用水多次洗漆干凈后，按質(zhì)量體積比I :1. 5加入含1%硼氫化鈉的PBS溶液，室溫(15-25°C )下200rpm振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水多次洗滌干凈后得蛋白A吸附介質(zhì)，分別編號(hào)為①②③④。三、吸附介質(zhì)的抗體吸附量測(cè)試
將一定量吸附介質(zhì)填裝于層析柱中，先用PH6-8的緩沖液平衡，以人血漿流經(jīng)吸附介質(zhì)，再用緩沖液沖洗介質(zhì)至無蛋白成分流出，用PH2-3的洗脫液沖洗介質(zhì)，收集洗脫液，以紫外吸收法測(cè)定洗脫液中IgG的濃度,進(jìn)而計(jì)算吸附介質(zhì)的抗體吸附量,單位是mglgG/ml介質(zhì)。四、吸附介質(zhì)的熱穩(wěn)定性測(cè)試
將蛋白A吸附介質(zhì)浸泡于生理鹽水，經(jīng)121.5°C，20min滅菌后，放置恢復(fù)至常溫，按前述方法測(cè)定熱壓滅菌前后吸附介質(zhì)的抗體吸附量。上述蛋白A吸附介質(zhì)經(jīng)熱壓滅菌后，抗體吸附量與熱壓滅菌前相比沒有明顯變化，且仍能進(jìn)行反復(fù)吸附-洗脫循環(huán)，吸附介質(zhì)對(duì)抗體吸附的選擇性也沒有變化。因此，上述蛋白A吸附介質(zhì)可耐受熱壓滅菌。實(shí)施例吸附介質(zhì)的熱穩(wěn)定性測(cè)試
將蛋白A吸附介質(zhì)抽干后，稱取約4g浸泡于生理鹽水，經(jīng)121. 50C，20min滅菌后，恢復(fù)
至常溫備用。分別將未經(jīng)熱壓滅菌(滅菌前)和經(jīng)熱壓滅菌(滅菌后)的吸附介質(zhì)充分抽干后，準(zhǔn)確稱取2. 8克(B卩4. 2ml)，填裝于層析柱中，以IOml PBS平衡后，用20ml人血漿流經(jīng)吸附介質(zhì)，繼續(xù)用PBS沖洗至無蛋白成分流出，用PH2-3的檸檬酸緩沖液沖洗介質(zhì)至抗體完全洗脫，收集洗脫液，即為一次吸附-洗脫循環(huán)。測(cè)定洗脫液在278nm處的吸收值A(chǔ)278,以A278/l. 38為IgG濃度(單位是mg/mL)，進(jìn)而計(jì)算吸附介質(zhì)的抗體吸附量。對(duì)滅菌后的吸附介質(zhì)進(jìn)行3次吸附-洗脫循環(huán)，并測(cè)定每次循環(huán)的抗體吸附量。具體結(jié)果如表I所示，可以看出，經(jīng)熱壓滅菌后，以重組蛋白A為配體的吸附介質(zhì)的抗體吸附量與熱壓滅菌前相比沒 有明顯變化，且仍能進(jìn)行反復(fù)吸附-洗脫循環(huán)；另外，洗脫液的SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)表明經(jīng)熱壓滅菌后的吸附介質(zhì)對(duì)抗體吸附的選擇性也沒有變化，仍以IgG為主。因此，上述蛋白A吸附介質(zhì)能夠耐受121. 50C，20min熱壓滅菌。
權(quán)利要求
1.一種可耐受121. 5°C、20分鐘熱壓滅菌的蛋白A吸附介質(zhì)，其特征在于所述蛋白A吸附介質(zhì)是由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配體構(gòu)成，所述配體是具有如序列表中SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的重組蛋白A，并且由以下步驟制備 a、將固相載體材料按質(zhì)量比I:1. 5與0. 2M高碘酸鈉溶液混勻，15-25°C振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到填料； b、于步驟a所得的填料中加入含具有如序列表中SEQID NO. I所示的氨基酸序列的重組蛋白A的硼酸鹽緩沖液，使每克填料對(duì)應(yīng)的重組蛋白A質(zhì)量不低于10mg，15-25°C振搖反應(yīng)8小時(shí)，用水洗滌干凈，抽干得到合成填料； C、于步驟b所得的合成填料中按質(zhì)量比I :1. 5加入含1%硼氫化鈉的PBS溶液，15-250C振搖反應(yīng)4小時(shí)，用水洗滌干凈后即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述蛋白A吸附介質(zhì)，其特征在于所述固相載體材料是瓊脂糖凝膠微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白A吸附介質(zhì)。本發(fā)明所述的蛋白A吸附介質(zhì)是由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配體構(gòu)成，所述配體是具有如序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的重組蛋白A。本發(fā)明所述的蛋白A吸附介質(zhì)可耐受121.5℃、20分鐘熱壓滅菌，解決了蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品不能進(jìn)行產(chǎn)品最終滅菌的問題。
文檔編號(hào)B01J20/26GK102698717SQ20121014645
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者余波光, 張海珍, 楊正根, 陳校園 申請(qǐng)人:廣州康盛生物科技有限公司