專(zhuān)利名稱(chēng)：基于微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微流控領(lǐng)域，特別提供了一種基于通道微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)是一種經(jīng)典的模式生物,它被廣泛用于現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域。目前秀麗隱桿線蟲(chóng)的培養(yǎng)主要在陣列微孔板中或瓊脂板上進(jìn)行，即將線蟲(chóng)培養(yǎng)于96孔板或瓊脂板，定期更換培養(yǎng)基或?qū)⒕€蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到新的瓊脂板上。雖然線蟲(chóng)培養(yǎng)數(shù)量多，但是試劑和耗材消耗量大；針對(duì)線蟲(chóng)的操作采用手工進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通量低；操作步驟較為繁瑣、復(fù)雜；難以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)線蟲(chóng)整個(gè)生命歷程的追蹤觀察。整體而言，隨著線蟲(chóng)相關(guān)研究的發(fā)展，當(dāng)前的模式生物技術(shù)的發(fā)展遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代生物醫(yī)藥研發(fā)的需要。開(kāi)發(fā)一種新的更為高通量、自動(dòng)化的單線蟲(chóng)培養(yǎng)新平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)技術(shù)的微型化、集成化和成本低廉化是未來(lái)發(fā)展的必然趨勢(shì)，也是藥物評(píng)價(jià)研究的發(fā)展需要。而近幾年發(fā)展起來(lái)的微流控芯片平臺(tái)恰恰可以滿足這些要求，并已成為重要的單線蟲(chóng)研究工具之一。最近，微流控芯片因其與秀麗隱桿線蟲(chóng)尺寸匹配、環(huán)境可控、通量高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、集成化等特征而成為線蟲(chóng)相關(guān)研究的重要平臺(tái)，但仍為實(shí)現(xiàn)從卵開(kāi)始的線蟲(chóng)整個(gè)生命過(guò)程的培養(yǎng)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、通量高的，具體說(shuō)是一種基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)通道微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及長(zhǎng)期培養(yǎng)方法。
本發(fā)明提供了一種微流控芯片，該微流控芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS 軟刻蝕及等離子體不可逆封接技術(shù)構(gòu)建，由上、下兩層組成，上層為用于線蟲(chóng)單卵捕獲及長(zhǎng)期培養(yǎng)的液路層，下層為用于封接的空白PDMS層；
其中，液路層由100 200個(gè)線蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能單元串聯(lián)連接；每個(gè)分析功能單元由線蟲(chóng)卵及藥品入口、線蟲(chóng)培養(yǎng)室組成，每個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室中含有一個(gè)線蟲(chóng)單卵捕獲器；
其中，線蟲(chóng)單卵捕獲器位于線蟲(chóng)培養(yǎng)室的中心軸上；線蟲(chóng)卵及藥品入口通過(guò)進(jìn)樣通道與線蟲(chóng)培養(yǎng)室連接，多個(gè)培養(yǎng)室由一條主通道連接起來(lái)，最后連接到廢液池。
本發(fā)明提供的微流控芯片,所述線蟲(chóng)培養(yǎng)室為橢圓形,長(zhǎng)軸為2mm,短軸為Imm,高度為80 μ m。
本發(fā)明提供的微流控芯片，所述線蟲(chóng)單卵捕獲器的尺寸由線蟲(chóng)卵的大小和流體力學(xué)特征所決定。所述線蟲(chóng)單卵捕獲器前端寬為50 μ m,后端寬為30 μ m ;結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)由由流體力學(xué)決定，線蟲(chóng)單卵捕獲器后端傾斜角度為110°。
本發(fā)明還提供了一種基于所述微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及長(zhǎng)期培養(yǎng)方法，線蟲(chóng)進(jìn)樣及培養(yǎng)方法為利用蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)的方式，將蟲(chóng)卵懸浮液引入線蟲(chóng)培養(yǎng)室；在流體力學(xué)的作用下，每個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室可捕獲單個(gè)卵；在持續(xù)灌入培養(yǎng)液的條件下，卵孵化成幼蟲(chóng)并長(zhǎng)大，線蟲(chóng)培養(yǎng)室的尺寸可使其在整個(gè)生命過(guò)程中自由游動(dòng)。
本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明采用通道設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單，且易于實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換，有利于線蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
(2)采用通道灌流的方式進(jìn)行食物添加及廢液排出，操作簡(jiǎn)單，效率高，有利于線蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
(3)培養(yǎng)室同樣作為線蟲(chóng)單卵捕獲器，且捕獲方式對(duì)蟲(chóng)卵無(wú)損傷，方法簡(jiǎn)單，通量聞。
(4)單個(gè)培養(yǎng)室中培養(yǎng)單個(gè)線蟲(chóng)的設(shè)計(jì)使得每只蟲(chóng)的壽命、運(yùn)動(dòng)行為及生理特征得到實(shí)時(shí)及長(zhǎng)期追蹤，可滿足生物研究的需要。


圖I芯片設(shè)計(jì)圖，從上到下依次為液路層、空白PDMS層；其中I為線蟲(chóng)卵及藥品入口，2為廢液口 ；
圖2單個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室放大圖，其中虛線框中3為線蟲(chóng)單卵捕獲器，箭頭指示液流方丨口」；
圖3線蟲(chóng)單卵捕獲多單元示意圖4線蟲(chóng)單卵捕獲放大圖5捕獲后第I天芯片上線蟲(chóng)(野生型N2)的生長(zhǎng)(LI期)；
圖6捕獲后第3天芯片上線蟲(chóng)(野生型N2)的生長(zhǎng)(L3期)；
圖7捕獲后第5天芯片上線蟲(chóng)(野生型N2)的生長(zhǎng)(L4期)；
圖8捕獲后第7天芯片上線蟲(chóng)(野生型N2)的生長(zhǎng)(Adult期，并產(chǎn)卵)。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片制備用于秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及長(zhǎng)期培養(yǎng)的微流控芯片材料為PDMS聚合物，等離子體不可逆封接，該芯片由兩層，上層為液路層， 下層為用于封接的空白PDMS。
液路層由100 200個(gè)線蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能單元串聯(lián)連接；每個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室為橢圓形，長(zhǎng)軸為2mm，短軸為1mm，高度為80 μ m，(圖2)可捕獲單個(gè)卵，其中線蟲(chóng)單卵捕獲器3(圖2)位于線蟲(chóng)培養(yǎng)室的中心軸上，其尺寸由線蟲(chóng)卵的大小和流體力學(xué)特征所決定；線蟲(chóng)卵及藥品入口 I (圖I)通過(guò)進(jìn)樣通道與線蟲(chóng)培養(yǎng)室連接，多個(gè)培養(yǎng)室由一條主通道連接起來(lái)，最后連接到廢液池2 (圖I)。
使用前事先灌好線蟲(chóng)培養(yǎng)液K Medium。秀麗隱桿線蟲(chóng)野生型蟲(chóng)株N2在瓊脂板上培養(yǎng)至大蟲(chóng)后,進(jìn)行bleach操作將大量卵取出，并使加入到KMedium中形成蟲(chóng)卵懸浮液。
實(shí)施例I
利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖1、2所示，利用蠕動(dòng)泵將線蟲(chóng)卵懸浮液進(jìn)樣到培養(yǎng)室中。芯片共100 200個(gè)單元，各個(gè)單元相互獨(dú)立，進(jìn)樣互不干擾，可達(dá)到單個(gè)培養(yǎng)室都只有單個(gè)卵。
實(shí)施例2
利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，將線蟲(chóng)野生型N2擬合至成蟲(chóng)期后進(jìn)行bleach操作得到大量卵，將卵分散在K Medium中引入芯片中，單個(gè)線蟲(chóng)卵被捕獲在單個(gè)培養(yǎng)室中，如圖3和圖4所示。捕獲后第I天，卵在K Medium培養(yǎng)基中孵化成LI期幼蟲(chóng)，見(jiàn)圖5。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，在第3天長(zhǎng)到L3期，第5天長(zhǎng)到L4期，第7天長(zhǎng)成成蟲(chóng)并產(chǎn)卵。線蟲(chóng)在芯片上生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、產(chǎn)卵等生理行為正常，顯示該芯片微環(huán)境適于線蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)，驗(yàn)證了該平臺(tái)可行性。
權(quán)利要求
1.一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片由上、下兩層組成，上層為液路層，下層為空白PDMS層； 其中，液路層由100 200個(gè)線蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能単元串聯(lián)連接；每個(gè)分析功能單元由線蟲(chóng)卵及藥品入口、線蟲(chóng)培養(yǎng)室組成，每個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室中含有ー個(gè)線蟲(chóng)單卵捕獲器； 其中，線蟲(chóng)單卵捕獲器位于線蟲(chóng)培養(yǎng)室的中心軸上；線蟲(chóng)卵及藥品入口通過(guò)進(jìn)樣通道與線蟲(chóng)培養(yǎng)室連接，多個(gè)培養(yǎng)室由一條主通道連接起來(lái)，最后連接到廢液池。
2.按照權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述線蟲(chóng)培養(yǎng)室為橢圓形，長(zhǎng)軸為2mm,短軸為1mm，高度為80 μ m。
3.按照權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述線蟲(chóng)單卵捕獲器的尺寸由線蟲(chóng)卵的大小和流體力學(xué)特征所決定。
4.按照權(quán)利要求3所述的微流控芯片，其特征在于所述線蟲(chóng)單卵捕獲器前端寬為50 μ m,后端寬為30 μ m ;結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)由流體力學(xué)決定，線蟲(chóng)單卵捕獲器后端傾斜角度為110。。
5.按照權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及等離子體不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。
6.ー種基于權(quán)利要求I所述的微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及培養(yǎng)方法，其特征在于線蟲(chóng)進(jìn)樣及培養(yǎng)方法為利用蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)的方式，將蟲(chóng)卵懸浮液引入線蟲(chóng)培養(yǎng)室；在流體力學(xué)的作用下，每個(gè)線蟲(chóng)培養(yǎng)室可捕獲單個(gè)卵；在持續(xù)灌入培養(yǎng)液的條件下，卵孵化成幼蟲(chóng)并長(zhǎng)大，線蟲(chóng)培養(yǎng)室的尺寸可使其在整個(gè)生命過(guò)程中自由游動(dòng)。
全文摘要
一種基于微流控芯片的秀麗隱桿線蟲(chóng)單卵捕獲及培養(yǎng)方法，該芯片由兩層PDMS組成，上層為液路層，用于線蟲(chóng)單卵捕獲、長(zhǎng)期培養(yǎng)及觀測(cè)；下層為空白PDMS，與上層PDMS封接。該芯片利用微結(jié)構(gòu)捕獲線蟲(chóng)單個(gè)卵，并可在單個(gè)培養(yǎng)室中對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。所述的微流控芯片平臺(tái)的線蟲(chóng)單卵捕獲方法操作簡(jiǎn)單，并易于在線蟲(chóng)整個(gè)壽命周期內(nèi)對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)；該芯片可以實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換及代謝廢物的排出，有利于線蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)，并可對(duì)單個(gè)線蟲(chóng)進(jìn)行行為及成像的長(zhǎng)期觀察。
文檔編號(hào)B01L3/00GK102972351SQ201210439440
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者秦建華, 溫慧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所