專利名稱：重組人胰島素復(fù)合物、其制備方法及包含該復(fù)合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含一種重組人胰島素復(fù)合物。更具體而言，本發(fā)明涉及一種包含重組人胰島素、磷脂及硫酸魚精蛋白的復(fù)合物。本發(fā)明還涉及該復(fù)合物的制備方法以及包含所述復(fù)合物的藥物組合物。
胰島素注射液為治療糖尿病的首選藥物，傳統(tǒng)的給藥途徑是皮下注射，由于吸收較慢，經(jīng)常導(dǎo)致糖尿病病人的飯前高血糖以及飯后低血糖，引起患者加餐，同樣每天的的連續(xù)注射也改變了糖尿病患者的生活。長期注射還會產(chǎn)生一些問題，如抗原抗體反應(yīng)、胰島素抗原性等。因此，尋找胰島素注射給藥的替代途徑已引起國內(nèi)外研究者的注意，胰島素口服、鼻腔、眼睛、舌下、植入及直腸系統(tǒng)等的給藥都已研究過，在眾多胰島素的非注射給藥途徑的研究中，口服制劑被認(rèn)為是最方便、最易被接受的。
自1965年發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為新的藥物載體后，已有人證明含有胰島素的脂質(zhì)體口服后可引起正常小鼠低血糖性休克。Dapergolas等1976年將脂質(zhì)體胰島素給糖尿病大鼠口服5U或12U，3小時后使血糖下降30-60％(Gerry Dapergolas等，Hypoglycaemic Effect ofLiposome-Entrapped Insulin Administered Intragastrically into Rats，TheLancet，第824-827頁，1976年10月16日；以及Gerry Dapergolas等，Penetration of Target Areas in the Rat by Liposome-AssociatedBleomycin，Glucose Oxidase and Insulin，F(xiàn)EBS LETTERS，第63卷第2號，第235-238頁1976)。他們發(fā)現(xiàn)流動性小的脂質(zhì)體比流動性大的脂質(zhì)體更有效。對人類自愿者的研究結(jié)果表明，80U-90U/人使血糖下降并伴隨胰島素免疫活性增加(Gerry Dapergolas等，TheEffect of Liposomal Lipid Composition on the Fate and Effect ofLiposome-Entrapped Insulin and Tubocurarine，Biochemical SocietyTransactions，第5卷，1383-1386頁)。
在以后的很多年中，很多人都在試圖重復(fù)他們結(jié)果。Moufti報告(Oral Ingestion of Insulin LiposomesEffects of the AdministrationRoute，Life Sciences，第28卷，2747-2752頁，1981)，正常大鼠口服胰島素脂質(zhì)體，1小時血糖下降37％，2.5小時血糖下降44％。K.H.Tray等報告(Zur peroralen Verabreichung von Insulin mittelsLiposomen im Tierversuch，Wiener Klinische Wochenschrft，1979年6月)，口服10單位/千克體重胰島素脂質(zhì)體大鼠血糖值下降67％。Stetanov等(1980)使用(PC/CN)脂質(zhì)體口服后，可使糖尿病大鼠血糖明顯下降，3小時內(nèi)達(dá)到最大降糖作用。Patel等(1982)使用更不具流動性的脂質(zhì)體(DSPC/CN/DCP，10∶2∶1)，以導(dǎo)管導(dǎo)入糖尿病狗十二指腸，出現(xiàn)暫短的血糖下降。
但是，口服胰島素脂質(zhì)體也存在著一些問題，例如，脂質(zhì)體的組成和大小、在消化道中的穩(wěn)定性以及吸附速度等，都可能影響胰島素生物利用度(Gregory Gregoriadis，Engineering Liposomes for DrugDeliveryProgress and Problems，TIEBTECH，第13卷，527-537頁，1995年)。一般的胰島素注射劑直接口服吸收只有1％，其余均被胃腸道酶破壞，而不能發(fā)揮藥效作用。通過將胰島素同磷脂形成復(fù)合物后，成功的解決了這一課題，產(chǎn)品的生物利用度超過10％。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所提供的重組人胰島素復(fù)合物包括重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚精蛋白，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，其提供制備重組人胰島素復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟A、原料液的制備(1)重組人胰島素水溶液將注射用水添加至重組人胰島素中，緩慢滴加鹽酸，使pH為3-5，然后攪拌溶解；(2)硫酸魚精蛋白水溶液將注射用水添加至硫酸魚精蛋白中使其溶解；(3)磷脂混懸液在天然大豆磷脂中添加注射用水，充分?jǐn)嚢?，使其呈均勻粘稠的白色乳狀液體，并控制pH為5-7之間，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5；B、在不超過37℃的溫度下對上述制得的磷脂混懸液進(jìn)行多次超聲、間隔連續(xù)超聲處理，使白色乳狀液體轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该饕后w；C、在快速攪拌條件下將重組人胰島素水溶液和硫酸魚精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢瑁缓箪o置至變?yōu)榘咨闋钜后w，并冷卻至室溫，接著按照凍干曲線操作，經(jīng)反復(fù)凍融形成重組人胰島素復(fù)合物球狀顆粒，再加溫形成穩(wěn)定復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，其提供一種包含所述復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
根據(jù)Lipoplexes的思路和胰島素在脂質(zhì)體膜上的復(fù)合技術(shù)，我們設(shè)計了全新的胰島素-魚精蛋白-磷脂復(fù)合物，產(chǎn)生了意想不到的效果。雖然不想囿于任何理論的限制，但我們認(rèn)為在該胰島素-魚精蛋白-磷脂復(fù)合物中，胰島素結(jié)合在磷脂的極性部位上，而魚精蛋白因帶有大量正電荷，與帶有負(fù)電荷的胰島素和磷脂分子具有多價靜電結(jié)合的性質(zhì)，由此起到固定作用，使三者更易形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
因此，本發(fā)明的重組人胰島素復(fù)合物包含重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚精蛋白，它們的重量比為1∶60-100∶1-5。
本發(fā)明的復(fù)合物具有下述優(yōu)越性(1)與包裹藥物脂質(zhì)體比較，藥物形成復(fù)合物后，增加了胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，免受胃腸道蛋白酶的破壞；(2)產(chǎn)品易被胃腸道吸收；(3)能夠?qū)⒁葝u素復(fù)合物制備成凍干粉，有利于口服固體制劑生產(chǎn)；(4)增加貯存穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體和本發(fā)明的復(fù)合物區(qū)別在于前者將溶于介質(zhì)中的藥物包裹在膜層之間；后者將藥物固定在磷脂極性部分形成了一個整體，多個磷脂復(fù)合物分子形成不同于脂質(zhì)體的球狀體，更增加了重組人胰島素的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的藥物組合物包括所述胰島素復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑。所述賦形劑包括但不限于甘露糖醇、微晶纖維素、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
以下將通過實施例以及動物試驗更為詳細(xì)地說明本發(fā)明。實施例1重組人胰島素復(fù)合物的制備稱取重組人胰島素760mg(白色粉末，純度為99％，提供單位通化東寶藥業(yè))，加注射用水15ml振蕩呈混懸液。緩慢逐滴加入0.1mol/L鹽酸，邊加邊在磁力攪拌器上攪拌，直至混懸液完全溶解。測定pH值應(yīng)在4左右。
稱取硫酸魚精蛋白2.28g(白色粉末，提供單位北京化學(xué)試劑公司，含量99％)，加注射用水45ml使之完全溶解。
稱取藥用大豆磷脂60.8g(淡黃色粘稠膏狀物，經(jīng)工藝制備為半透明液體，提供單位上海油脂一廠)，含量98％，加1000ml注射用水，在搗碎容器內(nèi)高速充分?jǐn)嚢?，使磷脂在水溶液中充分混懸，得到均勻的粘稠乳白色液體，測定pH值應(yīng)為5-7。
取磷脂混懸液，置超聲波破碎儀中，以高能量超聲15分鐘，間隔10分鐘，連續(xù)超聲2次，溶液溫度維持在37℃以下，至白色乳狀液轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆虬胪该鞯S色液體。
在快速攪拌條件下，將重組人胰島素水溶液和魚精蛋白水溶液逐漸加入到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢?0分鐘后，靜止60分鐘。半透明溶液再次變成白色乳狀液，表明魚精蛋白、磷脂、重組人胰島素結(jié)合成復(fù)合物。靜止1小時后倒入不銹鋼盤內(nèi)，液體溫度大約20℃。放入凍干機(jī)內(nèi)，快速降溫，1-2℃/分鐘，40分鐘后降到-40℃以下，維持1小時后，再升溫，升溫速度為1-2℃/分鐘，升到37℃，持續(xù)10分鐘后，再次快速降溫。這個程序反復(fù)5次。經(jīng)反復(fù)凍融，使重組人胰島素磷脂復(fù)合物形成類似脂質(zhì)體的球狀顆粒，再經(jīng)3℃保溫30分鐘后，重組人胰島素、魚精蛋白和磷脂形成穩(wěn)定的復(fù)合物。經(jīng)光鏡、電鏡、激光散射儀檢測符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。實施例2重組人胰島素凍干粉的制備取實施例1中制得的重組人胰島素磷脂復(fù)合物60g溶解于1000ml水中形成溶液，然后在攪拌條件下向該溶液中加入甘露醇136g(白色粉末，純度為99％，分析純，提供單位太原制藥廠)逐漸分散溶解。裝入盤內(nèi)凍干。凍干過程30分鐘降溫至-40℃冰凍后逐漸升溫，第4.5小時升至-20℃，維持-20℃至第12.5小時后第二次升溫，第17.5小時升至20℃，維持至第20小時得淡黃色粉末。經(jīng)光鏡、電鏡、激光散射儀檢測符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。實施例3重組人胰島素膠囊制備取根據(jù)實施例2制得的重組人胰島素凍干粉190g、微晶纖維素152g(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)、二氧化硅38g(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)、以及適量的10％PVP(白色粉末，純度98％，提供單位北京化學(xué)試劑公司)。將原料藥與填充輔料過40目篩充分混合，逐滴加入適量10％PVP，經(jīng)充分?jǐn)嚢柚瞥绍洸模^30目的篩網(wǎng)，得到均勻的顆粒粉。然后在真空干燥條件下干燥，20目篩整粒。裝0號膠囊即得。實施例4取大豆磷脂1000mg，加入注射用水20ml，充分振蕩使磷脂在水溶液中形成均勻乳狀懸浮液，用低能量超聲5次，每次30秒，間隔30分鐘，控制穩(wěn)定在30℃以下，得到幾乎完全透明的淡黃色微乳液。取重組入胰島素100mg，加入水8ml，然后緩慢加入0.1N鹽酸使其溶解。
按照以下表1中的量和比例混合上述兩種溶液，充分振蕩混勻后，在液氮中速凍，5分鐘后取出融化。如此反復(fù)凍融5次后，得到胰島素與磷脂的復(fù)合物，并用凝膠電泳法測定胰島素游離率(結(jié)合率)。所得結(jié)果如表1所示。
表1不同磷脂/重組人胰島素比例對結(jié)合率的影響

*兩次測量的平均值根據(jù)實施例1中所述的方法按照以下表2中所示的量制備不同比例的重組人胰島素、硫酸魚精蛋白和磷脂的復(fù)合物。然后用凝膠電泳法測定胰島素游離率(結(jié)合率)，所得結(jié)果如表2所示。
表2

由表1和表的結(jié)果對比可以看出，在磷脂與重組人胰島素的復(fù)合物中添加硫酸魚精蛋白使胰島素的結(jié)合率顯著提高。藥效學(xué)試驗受試藥物實施例2中制得的重組人胰島素凍干粉(以下稱為Ins-O)，每克Ins-O含胰島素量為2.5mg(即2.5mg/g)，每毫克胰島素相當(dāng)于26單位(即26u/mg)根據(jù)所需劑量用蒸餾水配制成不同濃度給藥，給藥體積小鼠0.1ml/10g體重，大鼠1ml/100g體重，家兔5ml/kg體重，犬用熟牛肉夾試藥吞藥。已知陽性對照藥選用市售常規(guī)胰島素(以下稱為R-Ins)，由通化東寶生產(chǎn)，批號為TN006R01(40u/ml)；中效胰島素優(yōu)泌林(以下稱為N-Ins)，Lilly法國S.A.產(chǎn)品，批號為FF9F62C(40u/ml)，進(jìn)口藥品注冊證號X960514；給小鼠和大鼠皮下注射時，要據(jù)所需劑量用生理鹽水稀釋成不同濃度，家兔及比格犬用微量注射器或0.25ml注射器直接吸取皮下注射。動物雄性自發(fā)性型糖尿病NOD小鼠，Wistar雄性大鼠均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物研究所繁育場；新西蘭白兔(雌雄兼用)，體重2.5～3.2kg，購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心；比格犬購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心。
試驗時，小鼠或大鼠每組10只，家兔每組為6～7只，比格犬為8條(交叉使用)。試驗數(shù)據(jù)處理用計算機(jī)Microsoft Excell程序進(jìn)行血糖變化率、血糖曲線下面積(AUC)計算，根據(jù)T-test進(jìn)行顯著性檢驗?？诜亟M人胰島素降血糖的藥效相對利用度(D)，參考文獻(xiàn)方法，根據(jù)藥時曲線血糖下降面積(即曲線上面積，AAC)用下列公式進(jìn)行計算。D%=AACp.oAACs.c.×Doses.c.Dosep.o×100%]]>一、Ins-O對自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠血糖的降低作用自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，禁食2小時后，一組以空白輔料灌胃作為對照組，一組皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作為陽性對照藥組，其余三組分別以6.0、3.0、1.5u/kg劑量的Ins-O灌胃。給藥后動物繼續(xù)禁食，自由飲水(以下同)，分別于給藥前(0min)及給藥后40min(對照組、陽性對照藥組；參考我國藥典R-Ins效價測定血糖法的采血時間，以下同)、120min采血，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值(以下同)，所得的結(jié)果見下表3。
表3、口服重組人胰島素對自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠血糖的影響(Mean±sd，n＝10)

與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；自身比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
以上表3的結(jié)果表明，對照組動物在40、120min血糖相對于0min血糖有所上升，陽性對照藥R-Ins組血糖分別下降47.9％(P＜0.001)和39.7％(p＜0.01)，不同劑量的Ins-O組，在給藥后120min，能使自發(fā)性遺傳性1型糖尿病NOD小鼠血糖明顯下降42.4％、33.5％、31％(P＜0.001或p＜0.01)。二、Ins-O對自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的改善作用4組自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠(10只/組)，禁食2小時各組取0min血后，第一組以輔料空白灌胃作為對照組，第二、三組分別以3.0u/kg、1.5u/kg劑量的Ins-O灌胃，100min時，第四組皮下注射R-Ins(0.5u/kg)作為陽性對照藥組，120min時，所有動物灌胃葡萄糖(2.0g/kg)溶液。分別于給葡萄糖負(fù)荷后30min、60min、120min取血，測定血糖值。所得結(jié)果如表4所示。
表4、口服重組人胰島素對自發(fā)性1型糖尿病NOD小鼠葡萄糖耐量的影響(Mean±sd，n＝10)

與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
由表4的結(jié)果可以看出，對照組動物葡萄糖負(fù)荷后血糖明顯升高；陽性對照組R-Ins(0.5u/kg)血糖明顯下降，葡萄糖負(fù)荷后各時間點血糖分別下降33.9％、40.1％和26.8％(P＜0.001)；兩給藥組(Ins-O 3.0u/kg、1.5u/kg)葡萄糖負(fù)荷后各時間點血糖也明顯下降，下降率分別為5.4％及8.7％、10.4％及17.1％、29.2％及26、8％(P＜0.01)，尤以120min作用明顯。三、Ins-O對正常大鼠降血糖作用的量效關(guān)系正常Wistar雄性大鼠50只，隨機(jī)均分為5組，禁食2小時取0min血后，一組灌胃等體積水作為對照組，一組陽性對照藥組(R-Ins，0.5u/kg，S.C)，其余三組分別以不同劑量的Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)灌胃，于給藥后40min、180min、240min取血測定血糖含量，結(jié)果如表5所示。
表5、口服重組人胰島素對正常小鼠血糖的影響(Mean±sd，n＝10)

與對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；以0min血糖為100％，↓為血糖下降，↑為血糖上升。
表5的結(jié)果顯示，陽性對照藥R-Ins組血糖在給藥后40min明顯降低，下降幅度為0min血糖的37％(P＜0.001)，但在180min、240min，血糖恢復(fù)正常，這體現(xiàn)了常規(guī)胰島素R-Ins起效快、作用持續(xù)時間短的特點；三個不同劑量的Ins-O組在180min、240min血糖均顯著下降，尤以240min作用明顯，血糖下降幅度分別為45.4％、36.5％、19.2％(P＜0.001)，用回歸分析法得出該時間點(240min)血糖下降百分率與給藥劑量相關(guān)的回歸方程Y＝8.8533x+92.92(R2＝0.0867)。這說明Ins-O在1.5u/kg～4.5u/kg劑量范圍內(nèi)，對正常大鼠的降血糖作用呈明顯的量效關(guān)系。四、Ins-O對正常大鼠降血精作用的時效曲線40只正常雄性Wistar大鼠，隨機(jī)均分為4組，禁食2小時后取0min血，對照組以等體積水灌胃，陽性對照藥組皮下注射R-Ins 0.5u/kg，兩組以不同劑量的Ins-O(1.5u/kg、3.0u/kg)灌胃，于給藥后間隔一定時間(30min、60min、120min、240min、360min和480min)采血測定血糖，觀察血糖變化，結(jié)果如下表6所示。并根據(jù)血糖曲線下面積的變化，計算出Ins-O不同時間的相對藥效利用度，結(jié)果如下表7所示。
表6、Ins-對正常大鼠降血糖作用的時效變化(％)血糖變化(％)時間 R-Ins 0.5u/kg Ins-O 1.5u/kg Ins-O 3.0u/kg對照(min.)(s.c.) (p.o.) (p.o.)0 100100 10010030 113.0±8.9 66.0±8.8***93.6±6.6***72.8±9.4***60 84.3±6.4 50.3±16.7***65.0±6.6***45.2±6.5***12064.4±8.6 61.9±14.1 45.7±5.6***27.8±9.3***18071.5±5.4 64.4±5.4*48.1±7.6***33.8±17.2***24076.3±8.1 77.2±7.9 54.0±11.7***39.7±12.2***36071.7±5.3 71.8±8.7 49.5±6.7***39.6±6.5***48075.5±5.7 69.6±11.2 60.2±7.3***53.6±8.8***與對照相比，*P＜0.05，***P＜0.001；n＝10。表7、口服重組人胰島素對正常大鼠血糖降低的時效曲線下面積、曲線上面積及相對藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線上面積)＝對照組AUC-給藥組AUC以上表6和7的結(jié)果顯示，陽性對照藥R-Ins(s.c.)組血糖的谷值在注射后30min，下降幅度為41.4％，120min基本恢復(fù)至正常水平；口服重組人胰島素Ins-O(p.o.)不同劑量組均在口服后30min開始起效，120min或240min為降血糖作用最強(qiáng)點，下降幅度分別為57.2％和32.8％，480min血糖逐步恢復(fù)，表現(xiàn)出了中效胰島素的作用特點。藥效相對利用度在口服后0～4小時為37.5％或39.6％，0～8小時高達(dá)56.7％或65.9％。五、Ins-O對正常家兔降血糖作用的時效曲線及藥效相對利用度三組新西蘭兔，禁食過夜，取0小時血后，對照組用4號導(dǎo)尿管以水灌胃(n＝6)，陽性對照藥組用微量注射器直接吸取中效胰島素優(yōu)泌林(N-Ins，0.5u/kg，n＝7)皮下注射同時以水灌胃，口服重組人胰島素組(Ins-O)以1u/kg劑量灌胃(n＝7)。于給藥1、2、3、4、6、8、10、12、20、28、38小時從耳緣靜脈采血測定血糖水平，給藥后動物繼續(xù)禁食直至試驗結(jié)束，但前12小時同時禁水，以后自由飲水。結(jié)果如下表8所示。
表8、Ins-O對正常家兔降血糖作用時效變化(％)時間 血糖變化(％)(小時) 對照N-Ins 0.5u/kg，s.c. Ins-O 1.0u/kg，p.o0100 100 1001109.0±5.3 64.1±6.8***84.4±8.2***2102.0±6.3 53.9±7.8***73.0±8.9***3101.5±4.8 63.9±13.5***67.5±10.8***4102.1±7.7 78.8±17.7*65.7±7.1***6100.5±9.1 89.6±9.4 59.9±7.0***897.1±7.0 91.4±8.8 58.0±8.0***10 100.3±6.2 93.3±8.7 55.6±8.1***12 102.0±9.2 97.4±8.5 52.4±8.9***20 103.2±9.0 98.5±11.060.8±9.6***28 106.6±10.1 103.0±6.562.3±19.0***38 102.7±17.8 95.5±8.8 74.1±16.5*與對照相比，*P＜0.05，***P＜0.001
由以上表8的結(jié)果可以看出，陽性對照藥組血糖在2小時降至最低，下降幅度為472％，8小時基本恢復(fù)至正常；Ins-O組血糖在1小時已開始下降，12小時降至最低點，下降幅度為48.6％，28小時血糖繼續(xù)維持在較低水平，38小時有所回升。另外，計算Ins-O組在不同時間點的降血糖相對藥效利用度，其結(jié)果見下表9。表9、口服重組人胰島素對家兔血糖降低的時效曲線下面積、曲線上面積及相對藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線下面積)＝對照組AUC-給藥物AUC六、Ins-O對比格犬的降血糖作用8條比格犬試驗前禁食過夜，對照組口服熟牛肉夾輔料，陽性對照藥組皮下注射中效胰島素優(yōu)泌林(N-Ins，0.5u/kg)，同時喂與其它組相等量的熟牛肉，Ins-O組口服熟牛肉夾Ins-O(3.0u/kg)，每次試驗均有對照組、陽性對照藥組、口服重組人胰島素組，共進(jìn)行3次交叉試驗，每次間隔一周。于給藥后0、20、40、60、90、120、180、240、360、480min靜脈采血測定血糖，結(jié)果如下表10所示。
表10、Ins-O對比格犬降血糖作用的時效變化(％)血糖變化(％)時間N-Ins 0.5u/kg， Ins-O 3.0u/kg，(min.)對照s.c. p.o.0 100 100 1002098.5±12.0809±14.8*102.8±4.740102.7±8.762.5±12.4***83.3±13.5*60103.6±7.055.7±8.7***61.3±12.4***90100.8±7.848.8±8.0***53.7±5.4***120 99.7±7.0 48.3±8.6***54.3±7.7***180 95.2±10.249.5±8.6***55.6±10.3***240 98.8±9.8 51.7±10.2***60.9±7.0***360 93.8±7.5 63.9±15.8***56.7±8.2***480 93.4±7.8 103.2±16.4 64.6±11.5***與對照相比，*P＜0.05，***P＜0.001從以上表10的結(jié)果可以看出，陽性對照藥組血糖在給藥后20min已開始下降，90min降至最低，下降幅度為51.6％，480min恢復(fù)至正常；Ins-O組血糖在40min開始下降，90min降至最低點，下降幅度為46.7％，480min血糖逐步回升。另外計算出Ins-0降血糖相對藥效利用度，結(jié)果見下表11。)為13.4％(0～4)和17.3％(0～8小時)。表11、口服重組人胰島素對比格犬血糖降低的時效曲線下面積、曲線上面積及相對藥效利用度(AUC，AAC，D)

AAC(曲線下面積)＝對照組AUC-給藥組AUC實驗小結(jié)及討論實驗選用4種動物模型(1型糖尿病NOD小鼠、正常大鼠、家兔及比格犬)，口服不同劑量的口服重組人胰島素(Ins-0)后，均有明顯的降血糖作用，使自發(fā)性1型NOD小鼠的葡萄糖耐量明顯改善。正常大鼠口服Ins-O(4.5、3.0、1.5u/kg)后，在180及240min時，血糖均顯著下降；240min時血糖下降幅度分別為45.4％、36.5％及19.2％。用回歸分析法證明Ins-O在1.5～4.5u/kg劑量范圍內(nèi)，降血糖作用呈明顯的量效關(guān)系。
正常大鼠、家兔及比格犬口服Ins-O后0.5～1小時起效，但血糖降至谷值及降血糖持續(xù)時間在不同種屬動物間不相一致。大鼠及比格犬血糖下降達(dá)谷值時間分別為2小時及1.5小時，降血糖持續(xù)至8小時后開始恢復(fù)，二者結(jié)果比較接近，但家兔血糖達(dá)谷值時間為12小時，降血糖作用延續(xù)至38小時后開始恢復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種重組人胰島素復(fù)合物，其包括重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚精蛋白，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人胰島素復(fù)合物，其為凍干粉末的形式。
3.制備重組人胰島素復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟A、原料液的制備(1)重組人胰島素水溶液將注射用水添加至重組人胰島素中，緩慢滴加鹽酸，使pH為3-5，然后攪拌溶解；(2)硫酸魚精蛋白水溶液將注射用水添加至硫酸魚精蛋白中使其溶解；(3)磷脂混懸液在天然大豆磷脂中添加注射用水，充分?jǐn)嚢?，使其呈均勻粘稠的白色乳狀液體，并控制pH為5-7之間，其中重組人胰島素、天然大豆磷脂與硫酸魚精蛋白的重量比為1∶60-100∶1-5；B、在不超過37℃的溫度下對上述制得的磷脂混懸液進(jìn)行多次超聲、間隔連續(xù)超聲處理，使白色乳狀液體轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该饕后w；C、在快速攪拌條件下將重組人胰島素水溶液和硫酸魚精蛋白水溶液添加到磷脂半透明溶液中，充分?jǐn)嚢?，然后靜置至變?yōu)榘咨闋钜后w，并冷卻至室溫，接著按照凍干曲線操作，經(jīng)反復(fù)凍融形成重組人胰島素復(fù)合物球狀顆粒，再加溫形成穩(wěn)定復(fù)合物。
4.一種包含胰島素復(fù)合物以及藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述胰島素復(fù)合物包括重量比為1∶60-100∶1-5的重組人胰島素、天然大豆磷脂以及硫酸魚精蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中，所述賦形劑為甘露糖、微晶纖維素、二氧化硅、PVP。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含一種重組人胰島素復(fù)合物，其包含重組人胰島素、磷脂及硫酸魚精蛋白，它們的重量比為1∶60－100∶1－5。本發(fā)明還涉及該復(fù)合物的制備方法以及包含所述復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明的復(fù)合物增加了胰島素在胃腸道的穩(wěn)定性，避免或減少低pH值、胃蛋白酶的破壞，并且能夠確定恒定量效關(guān)系，質(zhì)量可控，而且最終可制成凍干粉和口服膠囊。
文檔編號A61K38/28GK1421246SQ0114004
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者沃維漢 申請人:北京沃華生物科技股份有限公司