具有高耐鹽度的離子交換材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種交聯(lián)的磺化聚合物或者一種用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的的聚合物覆層的交聯(lián)的磺化聚合物以用作為具有高耐鹽度的離子交換材料以將大分子從溶液中分離出來，所述溶液來自于生物源。
【專利說明】具有高耐鹽度的離子交換材料
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種交聯(lián)的磺化聚合物或者一種用包含氨基的交聯(lián)的聚合物覆層的交聯(lián)的磺化聚合物以用作為具有高耐鹽度的離子交換材料以將大分子從溶液中分離出來，所述溶液來自于生物源。
【背景技術(shù)】
[0002]離子交換樹脂的庫倫交互作用是色譜純化工藝中最常見的交互作用。在離子交換樹脂中，離子基團(tuán)如強(qiáng)酸(例如磺酸)、強(qiáng)堿(例如季胺)、弱酸(例如羧酸)和弱堿(例如伯胺或叔胺)優(yōu)選作為基團(tuán)共價地施加到剛性基質(zhì)材料上。這些離子基團(tuán)與待純化的分子的互補的官能團(tuán)交互作用，所述官能團(tuán)因此結(jié)合到離子交換樹脂上。通過離子交互作用被結(jié)合的目標(biāo)分子的洗提通常通過提高洗提劑中的鹽濃度來實現(xiàn)，以至于目標(biāo)分子通過一種或多種相應(yīng)的鹽離子來取代。小于150mmol/L的相對低的鹽濃度通常足以中斷庫倫交互作用并且洗提目標(biāo)分子。
[0003]根據(jù)應(yīng)當(dāng)從中分離出目標(biāo)分子的混合物的起源，鹽濃度已經(jīng)能夠比通常能夠用于洗提的濃度更高。這主要具有如下缺點，即目標(biāo)分子在存在高的鹽濃度時不結(jié)合在離子交換樹脂上。特別地，從生物源、如發(fā)酵溶液、體液或者植物提取物中獲得的溶液，傳導(dǎo)性(電導(dǎo)率；與鹽濃度相對于的參數(shù))對于直接使用離子交換色譜通常是過高的。因此，通常需要不期望的稀釋步驟，以便降低混合物的傳導(dǎo)性(降低鹽濃度)。
[0004]存在許多已知的和可用的離子交換樹脂，所述離子交換樹脂能夠在鹽濃度相對高時結(jié)合物質(zhì)。當(dāng)然，所有迄 今為止已知的離子交換樹脂在氯化鈉的濃度高于250mmol/L的
情況下不再能夠以足夠的吸附容量(BeladungskapazitSt)結(jié)合生物的大分子，例如
胰島素。氯化鈉在這里被僅示例性地被提及；但是原則上也能夠存在處于該摩爾量的其它的鹽。此外迄今為止已知的所使用的離子交換樹脂在pHl至14的整個pH范圍上不是穩(wěn)定的進(jìn)而不是可普遍適用的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此本發(fā)明的目的在于，提供一種用于分離大分子的方法，其中大分子能夠直接從來自于生物源的溶液中分離。此外期望的是，所使用的離子交換材料在pHl至14的整個PH范圍上是穩(wěn)定的。由于其高的耐鹽度，所述離子交換材料應(yīng)當(dāng)實現(xiàn):不必執(zhí)行附加的稀釋步驟以降低鹽濃度。這些方法可能具有如下優(yōu)點，即在純化包含鹽的混合物時，用于附加的稀釋步驟的溶劑的成本和用于處理廢棄物質(zhì)的成本能夠被減小。
[0006]為了實現(xiàn)所提到的目的，本申請?zhí)峁┮环N將交聯(lián)的磺化聚合物用于將大分子從來自于生物源的溶液中分離出來的應(yīng)用，其中交聯(lián)的磺化聚合物包含結(jié)合到其基本構(gòu)架上的磺化的芳香族單元，所述芳香族單元被脂肪族殘基取代或是未被取代的。
[0007]換而言之，本申請涉及一種利用交聯(lián)的磺化聚合物將大分子從來自于生物源的溶液中分離出來的方法，所述磺化的聚合物包含結(jié)合在其基本構(gòu)架上的磺化的芳香族單元，所述磺化的芳香族單元被脂肪族殘基取代或是未被取代的。
[0008]將大分子理解為根據(jù)本發(fā)明的具有大于或等于lOOOOg/mol的摩爾質(zhì)量的分子。尤其優(yōu)選地，大分子是生物分子，例如肽和蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多糖和脂多糖，例如內(nèi)毒素。
[0009]術(shù)語“分離”不僅應(yīng)被理解為從溶液中提取/純化的目標(biāo)分子以及也應(yīng)被理解為從溶液中去除不期望的大分子，以至于目標(biāo)分子保留在被純化的溶液中。
[0010]交聯(lián)的磺化聚合物的基本構(gòu)架能夠是各已知的聚合物基本構(gòu)架，所述聚合物基本構(gòu)架由含烴的重復(fù)單元構(gòu)成。
[0011]將聚合物的基本構(gòu)架理解為聚合物的主鏈，側(cè)鏈形式的子基團(tuán)，如磺化的芳香族單元能夠結(jié)合到所述主鏈上。除了磺化的芳香族單元之外，聚合物也還能夠包含其它的側(cè)鏈，所述其它的側(cè)鏈不算在基本構(gòu)架內(nèi)，而是——如已知的那樣——屬于側(cè)鏈。換而言之，建立聚合物主鏈的且與主鏈的至少兩個其它的至少二價的原子鍵合的所有的原子屬于基本構(gòu)架。結(jié)合在已提到的原子上的單鍵結(jié)合的原子，如氫原子，同樣屬于基本構(gòu)架的原子。在交聯(lián)的磺化聚合物是交聯(lián)的聚苯乙烯的情況下，鍵合的乙烯基單元能夠是基本構(gòu)架并且磺化的苯基團(tuán)能夠是側(cè)鏈。
[0012]將含烴的重復(fù)單元理解為所有下述可考慮的化合物，所述化合物主要由碳和氫構(gòu)成，但是也能夠包含雜原子。重復(fù)單元鍵合到聚合物能夠通過各已知的聚合法實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選是游離的、陽離子的或者陰離子的烯烴聚合。尤其優(yōu)選基本構(gòu)架是聚乙烯構(gòu)架。基本構(gòu)架優(yōu)選是交聯(lián)的基本構(gòu)架，以至于產(chǎn)生交聯(lián)的聚合物。特別是在聚乙烯構(gòu)架的情況下，交聯(lián)通過含乙烯基的單體與包含兩個乙烯基團(tuán)的單體的共聚產(chǎn)生。但是原則上也可以考慮的是，首先 制造具有線性基本構(gòu)架的聚合物。緊接著的交聯(lián)隨后能夠緊隨通過側(cè)鏈中的官能團(tuán)與交聯(lián)反應(yīng)物的反應(yīng)來實現(xiàn)。
[0013]根據(jù)本發(fā)明所使用的交聯(lián)的磺化聚合物優(yōu)選在側(cè)鏈中包含磺酸基團(tuán)。側(cè)鏈在根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的磺化聚合物中是如在下文中詳細(xì)描述的芳香族單元?；腔姆枷阕鍐卧獌?yōu)選通過共價單鍵結(jié)合到基本構(gòu)架上。磺化的芳香族單元此外能夠通過脂肪族殘基來取代。尤其優(yōu)選的是，磺化的芳香族單元通過共價單鍵直接結(jié)合到基本構(gòu)架的原子上。
[0014]在本發(fā)明中將芳香族單元理解為通過脂肪族殘基取代的或者未被取代的單環(huán)或多環(huán)的芳香族環(huán)體系。就本發(fā)明而言，優(yōu)選將芳香族環(huán)體系理解為具有6至60個碳原子的，優(yōu)選6至30個，尤其優(yōu)選6至10個碳原子的芳香族環(huán)體系。這些芳香族環(huán)體系能夠是單環(huán)或者多環(huán)的，也就是說，所述芳香族環(huán)體系能夠具有一個環(huán)(例如苯基)或者兩個或更多個環(huán)，所述兩個或更多個環(huán)也能夠縮合(例如萘基)或者能夠共價地鍵合(例如聯(lián)苯基)，或者包含縮合的和鍵合的環(huán)的組合。
[0015]優(yōu)選的芳香族環(huán)體系例如是苯基、聯(lián)苯基、三苯基、萘基、蒽基、聯(lián)萘基、菲基、二氫菲基、芘、二氫芘、屈(*屈)、二萘嵌苯、并四苯、并五苯、苯并芘、芴和茚。尤其優(yōu)選地，芳香族環(huán)體系是苯基、聯(lián)苯基或者萘基，尤其優(yōu)選是苯基。
[0016]如已經(jīng)提到的，芳香族環(huán)體系能夠通過脂肪族基團(tuán)來取代。在這里可以考慮的是，芳香族環(huán)體系不是僅通過一個脂肪族團(tuán)而是通過兩個或更多個脂肪族團(tuán)取代。脂肪族殘基優(yōu)選是具有I至20個，或I至10個碳原子的烴基殘基。根據(jù)本發(fā)明的脂肪族烴基殘基優(yōu)選是線性的或者支化的或者環(huán)狀的烷基基團(tuán)，其中一個或多個氫原子也能夠通過氟來代替。具有I至20個碳?xì)湓拥闹咀鍩N基殘基的實例包括:甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基(1-甲基丙基)、叔丁基、異戊基、正戊基、叔戊基(1，2-二甲基丙基)、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基(新戊基)、1_乙基丙基、2-甲基丁基、正己基、異己基、
I,2- _.甲基丁基、1_乙基_1_甲基丙基、2_甲基丁基、1_乙基-2-甲基丙基、I, 1，2- 二甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基丁基、1-甲基丁基，1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、2-乙基己基、三氟甲基、五氟乙基和2，2，2-三氟乙基。尤其優(yōu)選作為脂肪族烴基殘基的是甲基或者乙基。
[0017]格外優(yōu)選的是，交聯(lián)的磺化聚合物的通過脂肪族殘基取代的或者未取代的磺化的芳香族單元是苯磺酸基團(tuán)或者是其衍生物。在苯磺酸基團(tuán)的衍生物的情況下，衍生物是指通過脂肪族殘基取代的衍生物。在這種情況下，苯基殘基上的磺酸基團(tuán)優(yōu)選位于相對于苯基環(huán)上的結(jié)合至基本構(gòu)架位置的對位。脂肪族殘基在這里優(yōu)選是甲基基團(tuán)或者乙基基團(tuán)，所述甲基基團(tuán)或者乙基基團(tuán)位于苯基基團(tuán)上的相對于苯基環(huán)上的結(jié)合至基本構(gòu)架的位置的鄰位或間位。
`[0018]但是尤其優(yōu)選的是，磺化的芳香族單元不被取代。在這里特別考慮磺化的交聯(lián)的聚苯乙烯?；腔木郾揭蚁┑慕宦?lián)優(yōu)選通過苯乙烯與二乙烯苯的共聚來實現(xiàn)，隨后進(jìn)行苯基基團(tuán)的磺化。但是在這里為了制造交聯(lián)的共聚物也可以考慮任何其它的包含兩個乙烯基團(tuán)的交聯(lián)劑。
[0019]交聯(lián)的磺化聚合物的交聯(lián)度根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選為0.5%至50%，尤其優(yōu)選5%至45%并且最優(yōu)選10%至35%。在本發(fā)明中，將以百分比表示的交聯(lián)度理解為所使用的包含兩個乙烯基團(tuán)的化合物與待聚合的單體單元的總數(shù)的摩爾百分比。
[0020]交聯(lián)的磺化聚合物的磺化度優(yōu)選為1%至80%，更優(yōu)選為3%至60%并且最優(yōu)選為5%至40%。以百分比表示的磺化度涉及磺酸基團(tuán)的摩爾數(shù)與用于聚合的所有的單體單元之t匕，所述單體單元具有磺化的基團(tuán)。將用于聚合的具有可磺化的基團(tuán)的單體單元理解為包含磺化的芳香族單元的所有的單體單元，也理解為包含可磺化的基團(tuán)、優(yōu)選芳香族單元的所有的單體單元以及可選擇地理解為引起交聯(lián)的所有的化合物，只要這些化合物包含可磺化的或者磺化的基團(tuán)的話。如果使用磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物作為交聯(lián)的磺化聚合物，那么百分比形式的磺化度與磺酸基團(tuán)的數(shù)量相對于包含在聚合物中的所有的苯基基團(tuán)或亞苯基基團(tuán)的數(shù)量之比有關(guān)。
[0021]在根據(jù)本發(fā)明的方法中或者在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用中所使用的交聯(lián)的磺化聚合物優(yōu)選以規(guī)則或者不規(guī)則成形的樹脂顆粒的形式存在。在本發(fā)明中將術(shù)語“規(guī)則地成形”理解為如下形狀，所述形狀通過對稱操作如面鏡像、點鏡像或者旋轉(zhuǎn)軸或者其組合來描述。在這里尤其優(yōu)選的能夠是球狀的形狀。將術(shù)語“球狀的”不僅理解為純粹對稱的球體，也理解為與之有所不同的形狀例如橢圓體。但是兩個彼此連接為啞鈴的球狀的本體也應(yīng)包括在此。將不規(guī)則的形狀理解為各不完整的形狀，所述不完整的形狀不具有對稱性。樹脂顆粒優(yōu)選具有I μ m至1000 μ m的中位平均直徑，更優(yōu)選為5 μ m至100 μ m的中位平均直徑并且尤其優(yōu)選為10 μ m至50 μ m的中位平均直徑。
[0022]在根據(jù)本發(fā)明的方法中或在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用中所使用的交聯(lián)的磺化聚合物優(yōu)選具有微孔，在所述微孔中，發(fā)射與待分離的材料的原本的交互作用。因此其優(yōu)選是多孔聚合物材料。這些微孔優(yōu)選具有6nm至400nm的平均直徑,尤其優(yōu)選30nm至IOOnm的平均直徑。微孔直徑通過逆體積排阻層析法來確定:在此待研究的相材料被包入到層析柱中并且注入一系列的聚合物尺寸標(biāo)準(zhǔn)。在相對于洗提體積繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)中的分子量的對數(shù)時，能夠從曲線的變化中根據(jù)文獻(xiàn)中已知的方法確定微孔直徑的分布進(jìn)而確定中位微孔直徑。
[0023]此外，交聯(lián)的磺化聚合物具有l(wèi)mL/g至3mL/g范圍中的微孔體積是優(yōu)選的。微孔體積通過對吸水能力的測量來確定:在干燥狀態(tài)下確定重量的相材料與溶劑交聯(lián)，對于所述溶劑應(yīng)確定微孔體積(不同的溶劑能夠由于不同的可潤濕性而顯示不同的結(jié)果)。對于本發(fā)明的目的而言，將水作為溶劑來使用。過量的溶劑被濾出并且相材料在離心機(jī)中從其它的位于粒子間體積中的溶劑中釋放出來。緊接著所述材料重新被稱重。僅僅微孔仍應(yīng)通過溶劑來填充。微孔體積能夠經(jīng)由被填充的微孔和空的微孔之間的質(zhì)量差以及溶劑的密度來計算。
[0024]在根據(jù)本發(fā)明的方法中或在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用中所使用的交聯(lián)的磺化聚合物具有如下優(yōu)點，即其除了在側(cè)鏈中的具有芳香族單元的親脂性的基本構(gòu)架之外，還具有可離子化的基團(tuán)如磺酸基團(tuán)。以這種方式其適合于不僅通過離子的交互作用也通過親脂性的交互作用來與大分子相互作用。在這里磺酸基團(tuán)優(yōu)選用作為陰離子-S03_-基團(tuán)，所述陰離子-so3_-基團(tuán)能夠允許與大分子的陽離子進(jìn)行離子交互作用。此外，來自于生物源的大分子，例如蛋白質(zhì)、DNA或者RNA也具有親脂性的區(qū)域，所述親脂性的區(qū)域能夠作為親脂性的基質(zhì)與交聯(lián)的磺化聚合物的芳香族單元交互作用。以這種方式可能的是，使用來自于生物源的溶液，所述溶液能夠包含直至lmol/L的非常高的鹽，而不會導(dǎo)致從離子交換材料中洗提大分子。
[0025]根據(jù)本發(fā)明所使用的交聯(lián)的磺化聚合物優(yōu)選用于提取或純化包含陽離子基團(tuán)的大分子。大分子優(yōu)選是生物大分子。生物大分子優(yōu)選是肽。肽更尤其優(yōu)選是胰島素。換而言之，本發(fā)明因此優(yōu)選涉及將交聯(lián)的磺化聚合物用于從來自于生物源的溶液中純化或提取胰島素的應(yīng)用。
[0026]制造交聯(lián)的磺化聚合物優(yōu)選通過借助使用硫酸或類似的材料對已經(jīng)交聯(lián)的聚合物進(jìn)行磺化來實現(xiàn)，如這例如在制造磺化的交聯(lián)的聚苯乙烯中從英國的專利文獻(xiàn)GB1116800和GB 1483587中已知。交聯(lián)的聚合物的制造是現(xiàn)有技術(shù)并且能夠由各個聚合物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在不需要創(chuàng)造性的勞動的情況下執(zhí)行。
[0027]但是尤其優(yōu)選按如下所示執(zhí)行磺化:根據(jù)所尋求的磺化度，例如聚苯乙烯-二乙烯苯-聚合物在具有2%至15%水含量的硫酸和水組成的混合物中在20°C至80°C的溫度中攪拌I至6個小時。硫酸含量、溫度和反應(yīng)時間的提高中的每一項本身都引起磺化度的提高。通過調(diào)節(jié)所有三個參數(shù)，能夠相對精確地達(dá)到所尋求的磺化度。在反應(yīng)之后，聚合物通過稀釋的硫酸和水來沖洗。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，也優(yōu)選的是，交聯(lián)的磺化聚合物用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物來覆層。
[0029]包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的基本構(gòu)架優(yōu)選與在上文中對于交聯(lián)的磺化聚合物所提到的內(nèi)容相同。因此基本構(gòu)架在這里也尤其優(yōu)選是聚乙烯構(gòu)架。在這個聚乙烯構(gòu)架上，氨基基團(tuán)優(yōu)選通過共價單鍵直接鍵合在基本構(gòu)架的原子上。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，將氨基基團(tuán)理解為伯、仲、叔或季氨基基團(tuán)以及還有脒基團(tuán)或者胍基團(tuán)。但是包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物尤其優(yōu)選是交聯(lián)的聚乙烯胺。[0031]通過包含伯或者仲氨基基團(tuán)的線性的聚合物與交聯(lián)反應(yīng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)換的方式，優(yōu)選執(zhí)行包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的交聯(lián)，所述交聯(lián)反應(yīng)物能夠允許在兩個端部上與氨基基團(tuán)的共價結(jié)合。對此原則上能夠使用任何可考慮的交聯(lián)反應(yīng)物。但是根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選使用如下交聯(lián)反應(yīng)物，在所述交聯(lián)反應(yīng)物中用于交聯(lián)的所有的氨基基團(tuán)在交聯(lián)之后總是仍以氨基基團(tuán)的形式存在。以這種方式確保了，氨基基團(tuán)通過質(zhì)子化/烷基化總是仍能夠作用為陽離子的離子交換基團(tuán)。這引起離子交換基團(tuán)在其它的親脂性的基質(zhì)上的高密度。在交聯(lián)之后，之前為伯或仲的氨基基團(tuán)隨后作為仲或叔氨基基團(tuán)存在。
[0032]為了給予氨基基團(tuán)正電荷，所述氨基基團(tuán)能夠被質(zhì)子化。但是對此可替選的是，伯、仲或者叔氨基基團(tuán)也能夠通過借助烷基化反應(yīng)物進(jìn)行三烷基化、雙烷基化或者單烷基化而過渡為季氨離子。
[0033]包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的交聯(lián)度優(yōu)選在5%至80%的范圍中，尤其優(yōu)選在6%至60%的范圍中并且最優(yōu)選10%至40%的范圍中。百分?jǐn)?shù)在這里與用于交聯(lián)的氨基基團(tuán)的數(shù)量相對于未交聯(lián)的聚合物的所有氨基基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)。
[0034]尤其優(yōu)選的是，包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物與交聯(lián)的磺化聚合物的質(zhì)量比位于
0.05至0.3的范圍中、尤其優(yōu)選位于0.08至0.25的范圍中并且最優(yōu)選位于0.11至0.20的范圍中。
[0035]包含交聯(lián)的氨基基團(tuán)的聚合物優(yōu)選以交聯(lián)的磺化聚合物上的層/覆層的形式存在。在這里優(yōu)選使用樹脂顆粒形式的交聯(lián)的磺化聚合物并且用包含氨基基團(tuán)的未交聯(lián)的聚合物覆層，以及緊接著與交聯(lián)劑交聯(lián)。以這種方式能夠在表面上實現(xiàn)氨基基團(tuán)的高濃度，不會由該方法而完全地?fù)p失基質(zhì)的親脂性的特性。因此提供了一種離子交換樹脂，所述離子交換樹脂通過氨基基團(tuán)的質(zhì)子化/烷基化能夠與大分子的陰離子基團(tuán)交互作用。附加地，親脂性的基質(zhì)也能夠允許與大`分子的親脂性的交互作用。
[0036]位于磺化的聚合物的表面上的、包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物優(yōu)選沉積在磺化的聚合物的樹脂顆粒的微孔中，也就是說，其優(yōu)選位于磺化的聚合物的微孔中。
[0037]包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物優(yōu)選具有在20000g/mol至50000g/mol的范圍中的中位分子重量，更優(yōu)選在30000g/mol至46000g/mol的范圍中的中位分子重量。
[0038]尤其優(yōu)選通過所述陽離子的離子交換樹脂從溶液中去除大分子如DNA或者RNA，以至于溶液被所述離子交換樹脂純化，并且能夠從溶液中提取出不具有DNA或者RNA的期望的目標(biāo)分子。
[0039]同樣優(yōu)選通過根據(jù)本發(fā)明的離子交換樹脂(陰離子交換劑)從溶液中去除大分子如內(nèi)毒素，以至于所述大分子首先結(jié)合在離子交換樹脂上并且溶液絕大部分沒有內(nèi)毒素。因此或者原始的溶液能夠沒有內(nèi)毒素并且被繼續(xù)使用，或者內(nèi)毒素能夠通過將離子交換樹脂用適當(dāng)?shù)娜芤旱南刺醽硖崛?。將?nèi)毒素理解為一類生化物質(zhì)。所述生物物質(zhì)是細(xì)菌的分解產(chǎn)物，所述分解產(chǎn)物在人體中能夠觸發(fā)眾多的生理反應(yīng)。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌或者藍(lán)綠藻的外部的細(xì)胞膜(OM=OUter membrane外膜)的組成部分。在化學(xué)上，它是脂多糖(LPS)，所述脂多糖由親水性的多糖和親脂性的脂質(zhì)部分構(gòu)成。相反于細(xì)菌，內(nèi)毒素是極其熱穩(wěn)定的并且甚至經(jīng)受得住滅菌，其中內(nèi)毒素來自于所述細(xì)菌。用于測量內(nèi)毒素的當(dāng)前最靈敏的方法經(jīng)由在變形細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中活化凝血級聯(lián)來起作用，所述變形細(xì)胞從馬蹄蟹(limulus polyphemus)中離析出來。該測試一般而言被稱為LAL-測試。[0040]如已經(jīng)提到的，根據(jù)本發(fā)明的大分子來自于生物源。在這里，大分子優(yōu)選具有1000至0.2kDa的范圍中的分子重量，更優(yōu)選500至IkDa并且最優(yōu)選從300至5kDa的范圍中的
分子重量。
[0041]將來自于生物源的溶液理解為體液或者植物提取物或者例如通過發(fā)酵或者發(fā)酵過程獲得的溶液，所述體液或者植物提取物或者溶液優(yōu)選具有0.lmS/cm至120mS/cm，更優(yōu)選從lmS/cm至60mS/cm的范圍中并且最優(yōu)選從10mS/cm至20mS/cm的范圍中的離子電導(dǎo)率。這些溶液優(yōu)選是水的溶液。它們優(yōu)選具有直至1.2mol/L的含鹽量。其含鹽量尤其優(yōu)選位于0.01mol/L至1.2mol/L的范圍中，更優(yōu)選在0.05mol/L至1.0mol/L的范圍中并且最優(yōu)選在0.25mol/L至0.6mol/L的范圍中。在本發(fā)明中，將鹽理解為各種鹽,如無機(jī)鹽和有機(jī)鹽，所述鹽優(yōu)選以生物液體存在。在這里，將這些溶液不僅理解為直接從生物源中提取并使用的溶液，而是將其理解為已經(jīng)以任何方式處理過的溶液。將“處理過的”理解為，溶液已經(jīng)以任何方式被預(yù)處理，例如在根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用之前改變PH值或者分離物質(zhì)。
[0042]根據(jù)本發(fā)明，通過Greisinger公司的型號為GMH 3430的電導(dǎo)率測量設(shè)備來確定離子電導(dǎo)率。
[0043]因此，來自于具有極高含鹽量的溶液的生物的大分子能夠與根據(jù)本發(fā)明所使用的交聯(lián)的磺化聚合物，或者與用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的層包覆的交聯(lián)的磺化聚合物結(jié)合，所述溶液之前不必通過附加的稀釋步驟或者透析來稀釋。本發(fā)明以這種方式提供用于純化生物的大分子的一種成本適宜的方法/ 一種成本適宜的應(yīng)用，所述生物的大分子優(yōu)選是胰島素、單克隆抗體、DNA或者RNA。
[0044]附加地，所使用的離子交換材料具有如下優(yōu)點，即它們能夠在I至14的整個pH范圍中使用，如所述PH范圍 存在于來自于生物源的液體中那樣。
[0045]此外，本發(fā)明還涉及其它的實施形式:
[0046](i)用于利用交聯(lián)的磺化聚合物將大分子從來自于生物源的溶液中分離出來的方法，所述磺化聚合物包含結(jié)合在其基本構(gòu)架上的磺化的芳香族單元，所述芳香族單元被脂肪族殘基取代或者是未取代的。
[0047](ii)根據(jù)實施形式(i)所述的方法，其中所述基本構(gòu)架是交聯(lián)的聚乙烯構(gòu)架。
[0048](iii)根據(jù)實施形式(i)或(ii)所述的方法，其中所述磺化的芳香族單元是苯磺
酸基團(tuán)。
[0049](iv)根據(jù)實施形式(i)至(iii)中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物是磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物。
[0050](V)根據(jù)實施形式(i)至(iv)中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物的交聯(lián)度為0.5%至50%。
[0051](Vi)根據(jù)實施形式(i)至(V)中任一項所述的方法，其中磺化度以與磺酸基團(tuán)的摩爾數(shù)與全部用于聚合的能磺化的單體單元之比計為1%至80%。
[0052](Vii)根據(jù)實施形式(i)至(Vi)中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物以樹脂顆粒的形式存在。
[0053](viii)根據(jù)實施形式(vii)所述的方法,其中所述樹脂顆粒具有I μ m至1000 μ m的中位平均直徑。
[0054](ix)根據(jù)實施形式(vii)或(viii)所述的方法，其中所述樹脂顆粒具有微孔，所述微孔具有IOnm至400nm范圍中的平均直徑。
[0055](X)根據(jù)實施形式(i)至(ix)中任一項所述的方法，其中所述大分子是肽。
[0056](Xi)根據(jù)實施形式(X)所述的方法，其中所述肽是胰島素。
[0057](Xii)根據(jù)實施形式(i)至(ix)中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物覆層。
[0058](Xiii)根據(jù)實施形式(Xii)所述的方法，其中所述包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的交聯(lián)度在5%至80%的范圍中。
[0059](xiv)根據(jù)實施形式(xii)或(xiii)所述的方法，其中所述包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物是交聯(lián)的聚乙烯胺。
[0060](XV)根據(jù)實施形式(xii)至(xiv)中任一項所述的方法,其中用于交聯(lián)的所有的氨基基團(tuán)在交聯(lián)之后以胺的形式存在。
[0061](xvi)根據(jù)實施形式(xii)至(XV)中任一項所述的方法,其中所述交聯(lián)的磺化聚合物與所述包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的質(zhì)量比在3至20的范圍中。
[0062](xvii)根據(jù)實施形式(xii)至(xvi)中任一項所述的方法,其中所述大分子是內(nèi)毒素、DNA或者RNA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]在下文中應(yīng)根據(jù)附圖和實例闡述本發(fā)明，但是本發(fā)明不能夠理解為受限于此保護(hù)范圍。`
[0064]附圖:
[0065]圖1:通過測量胰島素的吸附容量與鹽濃度的相關(guān)性，示出根據(jù)本發(fā)明所使用的離子交換劑與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的兩種離子交換劑的不根據(jù)本發(fā)明的使用的對比。
[0066]圖2:繪制出在通過根據(jù)本發(fā)明所使用的陰離子交換材料流經(jīng)發(fā)酵溶液流經(jīng)之后洗提液相對于時間的耗盡圖。
[0067]圖3:通過測量DNA的吸附容量與鹽濃度的相關(guān)性，示出根據(jù)本發(fā)明所使用的離子交換劑與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的兩種離子交換劑的不根據(jù)本發(fā)明的使用的對比。
[0068]具體實施形式
[0069]實例:
[0070]實例1:基于交聯(lián)的磺化聚合物制造陽離子交換樹脂。
[0071]方案的目的:在20°C的情況下對聚苯乙烯載體Amberchrom XT 30進(jìn)行磺化(從前身是羅門哈斯的陶氏化學(xué)公司中是市售的)。
[0072]將165mL的濃H2S04加入到可控溫的250mL的反應(yīng)器中。將30.0g的載體材料加到硫酸中并且稱量瓶借助各20mL的濃硫酸再清洗三次。在添加載體材料之后，攪拌懸浮液并且控溫到20°C。在2小時的反應(yīng)時間后，從反應(yīng)器中倒出懸浮液并且將其分配給兩個150mL的注射器。硫酸被吸出并且對這個相依次用200mL的稀釋的(62%的)硫酸、125mL的水、175mL的甲醇、125mL的水和緊接著用175mL的甲醇來沖洗。所述相被吸干并且緊接著在50°C的情況下在真空中被干燥。
[0073]在HPLC柱中通過吸附乙酸銨、緊接著洗提所結(jié)合的乙酸并且經(jīng)由靛酚藍(lán)證明，來進(jìn)行磺酸基團(tuán)的確定。得出375μπι01/ιΛ的磺酸含量。這相應(yīng)于近似13%的磺化度。顆粒大小平均為30 μ m。顆粒是具有22nm的中位微孔直徑和1.25mL/g的中位微孔體積的球。
[0074]實例2:制造基于用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物包覆的交聯(lián)的磺化聚合物的陰離子交換劑:
[0075]羅門哈斯的Amberchrom CG1000S用作為離子交換材料的基礎(chǔ)。如在例I中所闡述的一樣，這在80°C的情況下用98%的硫酸磺化3小時。在此獲得具有30 μ m的中位平均大小的和22nm至25nm的中位微孔直徑的顆粒。通過稱重被干燥的、磺化的聚苯乙烯、添加并且接下來離心分離多余的水的方式，從所產(chǎn)生的磺化的聚苯乙烯確定吸水能力或者微孔體積。位于微孔中的水在此保留在其位置中。在再次稱重后，能夠從與干燥的聚苯乙烯的稱量差中確定微孔體積為大約1.2mL/g至1.3mL/g。
[0076]為了對聚苯乙烯覆層，提供水相的聚乙烯胺溶液，所述聚乙烯胺溶液由具有35000g/mol的中位摩爾重量的聚乙烯胺構(gòu)成。pH值被調(diào)節(jié)到9.5。聚乙烯胺的量在這里為待覆層的聚苯乙烯的15%，并且所述溶液的體積為聚苯乙烯的所確定的微孔體積的95%。聚乙烯胺溶液與聚苯乙烯一起被加入到緊閉的PE瓶中并且在振動篩上在高頻的情況下振動6小時。在此必須注意充分的混合。在所述程序之后，聚乙烯胺溶液進(jìn)入到聚苯乙烯的微孔中。聚苯乙烯緊接著在50°C的情況下在真空干燥箱中被干燥為恒重。為了使聚乙烯胺交聯(lián)，被覆層的聚苯乙烯容納在三倍體積的異丙醇中，并且與以聚乙烯胺的氨基基團(tuán)數(shù)計為5%的二乙二醇二縮水甘油基醚交聯(lián)。反應(yīng)混合物在反應(yīng)器中以在55°C的情況下被攪拌六小時。緊接著，其被轉(zhuǎn)送到玻璃吸濾器上并且用2柱床體積的異丙醇、3柱床體積的0.5MTFA-溶液、2柱床體積的水、4柱床體積的IM氫氧化鈉溶液沖洗并且緊接著用8柱床體積的水沖洗。
[0077]實例3:通過在實例I中制造的陽離子交換劑純化胰島素
[0078]在實例I中制造的耐鹽的離子交換劑的胰島素的吸附容量的確定借助10mg/mL的胰島素的溶液在具有50mM的乳酸的30%的異丙醇中在pH為3.5且NaCl濃度不同的情況下來進(jìn)行。吸附容量在10% 的穿透量的情況下被確定，并且與兩種競爭材料比較。結(jié)果在圖1中示出。使用Merck公司市售的離子交換材料“Eshumo S”(聚乙烯醚,離子吸收能力 50 μ mol/mL 至 100 μ mol/mL,顆粒大小 75 μ m 至 95 μ m)和 GE Healthcare 公司的“Source30S”(聚苯乙烯/ 二乙烯苯,顆粒大小30 μ m)作為對比材料。
[0079]當(dāng)對比材料在流動相中在250mM的NaCl含量的情況下僅示出非常低的吸收能力時，所述吸收能力在更高的鹽含量的情況下不再是可測量的，根據(jù)本發(fā)明所使用的離子交換劑仍示出明顯的直至IM NaCl的吸收能力。這可清晰地從圖1中讀出。
[0080]實例4:通過使用在實例2中所制造的陰離子交換樹脂分離DNA:
[0081]在從發(fā)酵溶液中提純單克隆抗體的過程中的第一步驟是耗盡所包含的DNA。這通過經(jīng)由實例2中制造的陰離子交換劑的相“過濾”發(fā)酵溶液的方式起作用。DNA在這個步驟中結(jié)合到這個相上，并且定量地穿過的發(fā)酵溶液因此近似沒有DNA。對此在實例2中制造的陰離子交換劑被包入具有21.2mL柱床體積的270 X IOmm的柱中并且首先以pH7.0的500mM的NaKPO4來平衡并且緊接著以pH7.0的50mM的NaKPO4來平衡。發(fā)酵溶液經(jīng)由0.45 μ m_過濾器來過濾并且沒有沉淀物。發(fā)酵溶液中的300mL經(jīng)由外部的泵被提供到柱上。穿流量、具有pH6.5的IM NaCl的洗提液和具有IM NaOH的沖洗步驟被采集。
[0082]圖2中稱作為穿流量的部分幾乎僅包含單克隆抗體并且不包含DNA。但是DNA的洗提僅通過施加NaOH來實現(xiàn)。
[0083]穿流量中的和發(fā)酵溶液中的DNA的含量借助Picogreen-Assay根據(jù)制造商說明來確定。
[0084]表1:
【權(quán)利要求】
1.一種將交聯(lián)的磺化聚合物的用于從溶液中分離大分子的應(yīng)用，所述溶液來自于生物源，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物包含結(jié)合在其基本構(gòu)架上的磺化的芳香族單元，所述芳香族單元以通過脂肪族殘基取代的形式或者以未取代的形式存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述基本構(gòu)架是交聯(lián)的聚乙烯構(gòu)架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述磺化的芳香族單元是苯磺酸基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的應(yīng)用，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物是磺化的聚苯乙烯-二乙烯苯-共聚物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的應(yīng)用，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物的交聯(lián)度為.0.5% 至 50%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的應(yīng)用，其中磺化度以與磺酸基團(tuán)的摩爾數(shù)與全部用于聚合的能磺化的單體單元之比計為1%至80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的應(yīng)用，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物以樹脂顆粒的形式存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述樹脂顆粒具有Iμ m至1000 μ m的中位平均直徑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其中所述樹脂顆粒具有微孔，所述微孔具有IOnm至400nm范圍中的平均直徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的應(yīng)用，其中所述大分子是肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所述肽是胰島素。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的應(yīng)用，其中所述交聯(lián)的磺化聚合物用包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物覆層。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物的交聯(lián)度在5%至80%的范圍中。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的應(yīng)用，其中所述包含氨基基團(tuán)的交聯(lián)的聚合物是交聯(lián)的聚乙烯胺。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述的應(yīng)用，其中用于交聯(lián)的所有的氨基基團(tuán)在交聯(lián)之后以胺的形式存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的應(yīng)用，其中所述大分子是內(nèi)毒素、DNA或者RNA。
【文檔編號】B01J47/00GK103827135SQ201280034371
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】馬庫斯·阿倫特, 格哈德·施圖姆, 馬丁·韋爾特, 托馬斯·施瓦茨 申請人:因斯特艾克申有限公司