二氧化鈦四氧化三鐵納米顆粒的制備及其富集磷酸肽的方法
【專利摘要】鈣的缺乏和吸收效率低已成為全球性問題，已被證明磷酸化肽能有效地促進人體對鈣的吸收，因此尋找高效快捷的磷酸肽富集方法則具有重要意義。以磁性納米顆粒為吸附載體對目標(biāo)物質(zhì)進行分離純化是一項新興的分離純化技術(shù)，通過對磁性納米顆粒的表面修飾改性，特定地分離純化目標(biāo)物質(zhì)，在外加磁場的作用下，從復(fù)雜的體系中實現(xiàn)快速分離。與傳統(tǒng)方法相比，磁分離技術(shù)具有操作簡單、快速、高效富集、高回收率等優(yōu)點。本發(fā)明首先提供了一種金屬氧化物磁性納米顆粒的制備方法，制備的二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒用于磷酸肽的富集。本發(fā)明制備的二氧化鈦四氧化三鐵納米磁性顆粒具有超順磁性及良好的水分散性，對磷酸肽的吸附顯示出高特異性。建立在此金屬氧化物磁性納米顆粒礎(chǔ)上的磷酸肽的富集明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。
【專利說明】二氧化鈦四氧化三鐵納米顆粒的制備及其富集磷酸肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料和蛋白質(zhì)分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備及其富集磷酸肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈣是人體中含量最多的微量元素，被稱為人體的“環(huán)境衛(wèi)士”，具有重要的生理功能，包括:輕度抑制甲狀腺機能亢進，預(yù)防異位鈣化和骨化，減少結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)率以及減少高血壓病的發(fā)生。長期缺鈣會導(dǎo)致骨骼和牙齒發(fā)育不全、骨質(zhì)疏松癥、貧血，甚至高血壓和冠心病。而我國居民平均每日鈣攝入量只有400mg左右，只占每日推薦量的50 %左右，因此補鈣是當(dāng)務(wù)之急。
[0003]1950年，Mellander及其同事首次利用胃蛋白酶和胰酶作用于酪蛋白得到了一種富磷多肽，并將之命名為酪蛋白磷酸化肽(簡稱CPP)。CPP能抵抗蛋白酶的進一步分解，與Ca、Fe離子具有親和性，并且在生理pH值下，無論正常嬰兒還是佝僂病患兒對酪蛋白磷酸化肽的鈣鹽比自然狀態(tài)下的鈣都能更好的吸收。酪蛋白磷酸化肽作為目前唯一一種可作為食品添加劑的促鈣吸收的活性肽，其在中國具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＲ虼?，工業(yè)化生產(chǎn)酪蛋白磷酸化肽在生產(chǎn)實踐中即具有重要的影響。
[0004]卵黃高磷蛋白磷酸肽(簡稱PPP)是從卵黃高磷蛋白中提取的一種多種短肽的混合物，其主要生物學(xué)功能是促進鈣、鐵和鋅等金屬離子的吸收。有學(xué)者研究PPP-鈣對受試小鼠的鈣表觀吸收率的影響表明，其鈣的吸收量達到8.446—11.375%，能有效地促進鈣的吸收。InwookCetal (2005)指出PPP中含有的磷酸化絲氨酸殘基比CPP多，且證明出PPP在抑制鈣形成不溶性的化合物方面優(yōu)于商品化的CPP。因此可見PPP在促進鈣等礦物質(zhì)吸收方面顯示出廣闊的應(yīng)用潛力。因此，尋找一種高效、安全、成本低，工藝簡單的磷酸化肽的富集方法則尤為重要。
[0005]目前磷酸肽的富集方法主要有乙醇鈣沉淀法，離子交換法和膜分離法，而這三種方法在實際應(yīng)用上都存在一定的不足:乙醇鈣沉淀法溶劑消耗量大，且存在有機溶劑殘留問題；離子交換法需要大量的酸液堿液再生，對周圍的水體環(huán)境和大氣環(huán)境均會造成較大程度的污染；而膜分離法對設(shè)備條件要求很高，膜的清洗和維護也是相當(dāng)關(guān)鍵，且工序較為繁瑣。固定化金屬離子親和色譜由Porath于1975年首先提出，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)成為目前最為普及的磷酸化肽富集方法。以磁性納米顆粒為吸附載體對目標(biāo)物質(zhì)進行分離純化是一項新興的分離純化技術(shù)，通過對磁性納米顆粒的表面修飾改性，特定地分離純化目標(biāo)物質(zhì)，在外加磁場的作用下，從復(fù)雜的體系中實現(xiàn)快速分離。與傳統(tǒng)方法相比，磁分離技術(shù)具有操作簡單、快速、高效富集、高回收率等優(yōu)點。四氧化三鐵磁性納米顆粒毒性較低，制備方法簡單，當(dāng)粒徑小于30nm時，則表現(xiàn)出超順磁性，即在外加磁場作用下具有較強的磁響應(yīng)性，當(dāng)撤離磁場時，磁性迅速消失，剩磁為零，不會被永久磁化。
[0006]到目前為止，尚未有采用金屬氧化物磁性納米顆粒作為吸附載體用于食品級CPP和PPP富集的報道。本發(fā)明制備合成了形貌規(guī)整，粒徑均一的超順磁性二氧化鈦四氧化三鐵納米顆粒，并將其應(yīng)用于磷酸肽的富集。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備方法，制備的顆粒形貌規(guī)整、粒徑均一、磁響應(yīng)性強，具有良好的生物相容性。采用所制備的二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒富集磷酸肽，操作簡便、成本低廉，生產(chǎn)周期短，且易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，解決了傳統(tǒng)磷酸肽富集困難、步驟繁多等問題。
[0008]本發(fā)明提供的二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備及其富集磷酸肽的方法，其實施方案如下:
[0009]1.二氧化鈦(TiO2)四氧化三鐵磁性納米顆粒(簡寫為Fe3O4OTiO2)的制備
[0010]采用化學(xué)共沉淀法合成，其化學(xué)反應(yīng)式為:
[0011]Fe2++2Fe3++8NH3.H2O = Fe3O4 I +8NH4++4H20
[0012]步驟如下:
[0013](I)將可溶性的Fe2+和Fe3+(總鐵離子濃度為0.01?0.5M)溶解在水一無水乙醇混合溶液中，在機械攪拌下通氮氣10?50min。
[0014](2)將溫度升高到40?70°C，在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加氨水溶液到體系中，調(diào)節(jié)體系的pH值到10?11左右，得到黑色的含磁性顆粒溶液。
[0015](3)在攪拌狀態(tài)下迅速加入20?40ml的鈦酸丁酯-乙醇混合溶液，升溫到70?90°C反應(yīng)I?2h,終止反應(yīng),靜置冷卻，得反應(yīng)液。
[0016](4)在外加磁場的作用下分離磁性顆粒，并且用去離子水清洗數(shù)次至中性，去除未反應(yīng)完全的化學(xué)組分。
[0017](5)對收集到的磁性顆粒進行冷凍干燥處理，隨后高溫煅燒(200-500°C )即可得Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒粉末。
[0018]采用上述方法成功實現(xiàn)了 TiO2與四氧化三鐵的偶聯(lián)，且方法制備的Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒形貌規(guī)整，粒徑均一，具有超順磁性，同時在水溶液中具有良好的分散性。
[0019]2.權(quán)利要求1方法制備得到的Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于用于富集CPP，步驟如下:
[0020](I)制備酪蛋白磷酸肽的吸附原液:
[0021]取新鮮牛奶，調(diào)pH至4.6以便沉降酪蛋白，過濾得到酪蛋白粗品。將酪蛋白粗品水解得到CPP的吸附原液。
[0022](2)富集磷酸肽:
[0023]將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到含有CPP的吸附原液中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，使溶液中的CPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有CPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進行洗脫，收集磷酸肽的洗脫液，測定N/P。
[0024]3.權(quán)利要求1方法制備得到的Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于用于富集PPP，步驟如下:
[0025](I)制備卵黃高磷蛋白磷酸肽的吸附原液:[0026]取新鮮雞蛋進行蛋清和蛋黃的分離，將蛋黃置于濾紙上除去附著的蛋清，用針挑破膜，收集蛋黃內(nèi)容物，之后進行噴霧干燥，得蛋黃粉。將蛋黃粉經(jīng)一系列的脫脂、脫磷、酶解處理得到PPP的吸附原液。
[0027](2)富集磷酸肽:將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到含有PPP的吸附原液中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，使溶液中的PPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有PPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進行洗脫，收集磷酸肽的洗脫液，測定N/P。
[0028]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明制備了一種金屬氧化物磁性納米顆粒，并將其應(yīng)用于CPP和PPP的富集。建立在此金屬氧化物磁性納米顆粒基礎(chǔ)上的CPP和PPP的富集，其N/P下降相當(dāng)顯著。CPP可由提純前的42.53降低到6.13?7.67，PPP可由提純前的39.49降低到6.65?8.05,明顯優(yōu)于目前所報道的傳統(tǒng)的富集方法。
[0029]另外，本發(fā)明提供的金屬氧化物磁性納米顆粒富集磷酸肽的方法同時具有以下的優(yōu)點:
[0030](I)操作簡單，富集周期較短
[0031]本分離純化工藝采用固定化金屬氧化物磁性納米顆粒從牛奶或蛋黃蛋白質(zhì)酶解溶液中富集磷酸肽，從吸附、清洗到洗脫整個過程在2-4h內(nèi)完成。
[0032](2)磷酸肽的特異性吸附好
[0033]N/P下降相當(dāng)顯著(試驗中排除了游離磷酸根基團的干擾)，由此說明吸附的大部分含氮組分均為磷酸化肽。
[0034](3)反應(yīng)條件溫和
[0035]本富集工藝是在水溶液及室溫條件下進行，不會引起其它蛋白質(zhì)組分及肽的變性。
[0036](4)能進行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)
[0037]磷酸肽的吸附、清洗和洗脫過程可以進行連續(xù)化生產(chǎn)操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1 二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒的透射電鏡圖。
【具體實施方式】
[0039]實施例1
[0040]1.二氧化鈦四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備
[0041]采用化學(xué)共沉淀法合成，化學(xué)反應(yīng)方程式為:
[0042]Fe2++2Fe3++8NH3.H2O = Fe3O4 I +8NH4++4H20
[0043]步驟如下:
[0044](I)將可溶性的Fe2+和Fe3+溶解在水-乙醇混合溶液中(v/v = 10:1)，在機械攪拌下通氮氣20min。
[0045](2)將溫度升高到60°C，在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加氨水溶液到體系中，調(diào)節(jié)體系的pH值到10左右，得到黑色的含磁性顆粒溶液。
[0046](3)在攪拌狀態(tài)下迅速加入40mL的酞酸丁酯-乙醇混合溶液，升溫到80°C反應(yīng)Ih,終止反應(yīng),靜置冷卻,得反應(yīng)液。
[0047](4)在外加磁場的作用下分離磁性顆粒，并且用去離子水清洗數(shù)次至中性，去除未反應(yīng)完全的化學(xué)組分。
[0048](5)對收集到的磁性顆粒進行冷凍干燥處理，400°C煅燒lh，即可得Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒粉末。
[0049]2.二氧化鈦磁性納米顆粒富集CPP的應(yīng)用，步驟如下:
[0050](I)取新鮮牛奶，調(diào)pH至4.6以便沉降酪蛋白，離心得到酪蛋白粗品。
[0051](2)酶解:將酪蛋白粗品轉(zhuǎn)移到酶解反應(yīng)器里，加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:
1),ρΗ8.0，501:下酶解311，并用0.IM NaOH調(diào)節(jié)pH，使酶解液的pH維持在8.0，每間隔IOmin記錄V(Naffl)。水解結(jié)束后于80°C下滅酶IOmin,待冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH至4.5,酶解液于9000r/min，4°C下離心lOmin，取上清液，測N、P含量，計算N/P。此上清液作為酪蛋白磷酸肽的吸附原液。
[0052](3)富集CPP:將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到pH = 4，蛋白質(zhì)含量為30mg/mL的CPP的吸附原液，在25°C攪拌反應(yīng)30min，使溶液中的CPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有CPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用0.4% pH = 13的氫氧化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫液，測定N/P。
[0053]3.二氧化鈦磁性納米顆粒富集PPP的應(yīng)用，步驟如下:
[0054](I)新鮮雞蛋進行蛋清和蛋黃的分離，將蛋黃置于濾紙上除去附著的蛋清，用針挑破膜，收集蛋黃內(nèi)容物，之后進行噴霧干燥，得蛋黃粉。
[0055](2)上述制備得到的蛋黃粉經(jīng)95%乙醇脫脂處理(脫脂率94.8% )，之后于60°C烘干，將原料保存于干燥環(huán)境中。
[0056](3)堿法脫磷:稱取蛋黃粉于0.1M的NaOH溶液中，于37°C下反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后迅速用0.1M鹽酸將pH調(diào)節(jié)至8.0，采用去離子水稀釋3-5倍。然后用3000K超濾膜進行超濾處理(超濾前先進行抽濾，以免堵塞超濾膜)，脫除磷酸根離子。
[0057](4)酶解:將超濾后的濾液轉(zhuǎn)移到酶解反應(yīng)器里，加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1)，ρΗ8.0, 50°C下酶解4h，并用0.1M NaOH調(diào)節(jié)pH,使酶解液的pH維持在8.0,每間隔IOmin記錄V(Na0H)。水解結(jié)束后于80°C下滅酶IOmin,待冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH至4.5,酶解液于9000r/min，4°C下離心lOmin，取上清液，測N、P含量，計算N/P。此上清液作為卵黃高磷蛋白磷酸肽的吸附原液。
[0058](5)富集PPP:將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到pH = 4，蛋白質(zhì)含量為30mg/mL的PPP的吸附原液，在25°C攪拌反應(yīng)30min，使溶液中的PPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有PPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用0.4% pH = 13的氫氧化鈉溶液進行洗脫，收集洗脫液，測定N/P。
【權(quán)利要求】
1.二氧化鈦磁性納米顆粒的制備及其富集磷酸肽的方法，包括以下幾個步驟: 二氧化鈦(TiO2)四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備(簡寫為Fe3O4OTiO2)采用化學(xué)共沉淀法合成，其化學(xué)反應(yīng)式為:Fe2++2Fe3++8NH3.H2O = Fe3O4 I +8NH4++4H20 步驟如下: (1)將可溶性的Fe2+和Fe3+溶解在不同體積比的水一無水乙醇混合溶液中，在機械攪拌下通氮氣10~50min。 (2)將溫度升高到40~70°C，在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加氨水溶液到體系中，調(diào)節(jié)體系的pH值到10~11左右，得到黑色的含磁性顆粒溶液。 (3)在攪拌狀態(tài)下迅速加入一定量的鈦酸丁酯溶液，升溫到70~90°C反應(yīng)I~2h，終止反應(yīng)，靜置冷卻，得反應(yīng)液。 (4)在外加磁場的作用下分離磁性顆粒，并且用去離子水清洗數(shù)次至中性，去除未反應(yīng)完全的化學(xué)組分。 (5)對收集到的磁性顆粒進行冷凍干燥處理，隨后進行高溫煅燒(200-500°C)，即可得Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒粉末。
2.權(quán)利要求1方法制備得到的Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于用于富集CPP，步驟如下: (1)制備酪蛋白磷酸肽的吸附原液: 取新鮮牛奶，調(diào)pH至4.6以便沉降酪蛋白，過濾得到酪蛋白粗品。將酪蛋白粗品水解得到CPP的吸附原液。 (2)g集憐酸妝: 將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到含有CPP的吸附原液中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，使溶液中的CPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有CPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進行洗脫，收集磷酸肽的洗脫液，測定N/P。
3.權(quán)利要求1方法制備得到的Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的應(yīng)用，其特征在于用于富集PPP，步驟如下: (1)制備卵黃高磷蛋白磷酸肽的吸附原液: 取新鮮雞蛋進行蛋清和蛋黃的分離，將蛋黃置于濾紙上除去附著的蛋清，用針挑破膜，收集蛋黃內(nèi)容物，之后進行噴霧干燥，得蛋黃粉。將蛋黃粉經(jīng)一系列的脫脂、脫磷、酶解處理得到PPP的吸附原液。 (2)富集磷酸肽:將Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒加入到含有PPP的吸附原液中，在一定溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，使溶液中的PPP特定地吸附在Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒表面，在外加磁場的作用下將吸附有PPP的磁性納米顆粒從反應(yīng)溶液中分離出來，用去離子水清洗三次去除雜質(zhì)，再用洗脫液進行洗脫，收集磷酸肽的洗脫液，測定N/P。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的制備工藝中，其特征在于可溶性的Fe2+化合物是四水氯化亞鐵或七水硫酸亞鐵；可溶性的Fe3+化合物是六水氯化鐵；其中Fe2+與Fe3+的摩爾比為1:2~2:1，總鐵離子濃度為0.01~0.5M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的制備工藝中，其特征在于所選用的水和無水乙醇的體積比為1:1~10:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的制備工藝中，其特征在于所述的機械攪拌的轉(zhuǎn)速為600~800rpm范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的制備工藝中，其加入的鈦酸丁酯與四氧化三鐵的摩爾比為2:1~1:10。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒的制備工藝中，磁性納米顆粒是在外加磁場的作用下得以分離，因此最后所得的金屬氧化物性納米顆粒中沒有游離的未被吸附的化學(xué)組分。
9.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的采用Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒富集磷酸肽工藝中，其特征在于富集過程中選用的溫度為O~50°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的采用Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒富集磷酸肽工藝中，其特征在于富集反應(yīng)時間為5~180_。
11.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的采用Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒富集磷酸肽工藝中，其特征在于磷酸肽吸附原液中蛋白質(zhì)含量為25~50mg/mL，緩沖液的pH為3~7。
12.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求3所述的采用Fe3O4OTiO2磁性納米顆粒富集磷酸肽工藝中，其特征在于富集后選用的洗脫液為0.1~0.4%氫氧化鈉溶液。
【文檔編號】B01J20/06GK103495376SQ201310460177
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】楊嚴(yán)俊, 蘇宇杰, 汪家琦 申請人:江南大學(xué)