用帶負電荷顆粒對多核苷酸的色譜純化的制作方法
【專利摘要】純化包括多核苷酸的樣品的方法，所述方法包括以下步驟：(i)提供填充的色譜柱，其具有帶負電荷的多孔顆粒，(ii)將所述柱平衡至所述樣品中的多核苷酸洗脫的條件，(iii)使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸，使得施加于所述填充的色譜柱的樣品體積小于或等于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間，(iv)從所述填充的色譜柱洗脫多核苷酸，其中所述多核苷酸處于更純的狀態(tài)且處于所述填充的色譜柱平衡至的條件。
【專利說明】用帶負電荷顆粒對多核苷酸的色譜純化
[0001]相關(guān)申請的聲明
[0002]本申請要求2013年3月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/773，666和2012年5月31日提交的美國臨時申請?zhí)?1/653，694的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及用于純化多核苷酸的方法。其進一步涉及這些能力與其它純化方法的結(jié)合以達到期望的最終純化水平。
[0004]發(fā)明背景
[0005]具有帶電荷表面的固體材料被廣泛地用在多核苷酸純化領(lǐng)域中。這些材料通常包括離子交換劑，所述離子交換劑經(jīng)常以2種應用形式中的任一種采用。在結(jié)合-洗脫模式中，將多核苷酸和離子交換劑平衡至允許目標多核苷酸物質(zhì)結(jié)合的條件。與帶電荷表面較弱地相互作用或根本不相互作用的污染物不會結(jié)合并被消除。比多核苷酸更強地相互作用的污染物會更強地結(jié)合。洗滌以除去未結(jié)合的污染物以后，可以通過增加鹽濃度來洗脫柱。這允許其與離子交換劑的相互作用強度處于遞增次序的結(jié)合物質(zhì)的分級分離，由此實現(xiàn)高多核苷酸純化程度。在流穿模式中，例如在陽離子交換劑上，將樣品和離子交換劑平衡至阻止多核苷酸結(jié)合的條件。與多核苷酸相比更強烈地與離子交換劑相互作用的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合且由此被除去，但是比多核苷酸更弱地結(jié)合的物質(zhì)與它一起流穿且作為污染物持續(xù)。兩種模式在存在于多種固相體系結(jié)構(gòu)(包括填充在柱中的多孔或無孔顆粒)中的帶電荷表面上進行，或直接加入大體積水性樣品中，或在整體料或膜上。這些不同的體系結(jié)構(gòu)會賦予不同的流動性能、能力和分辨率，但是限定流穿或結(jié)合-洗脫色譜法的化學特征是恒定的(不論物理形式如何)。兩種方法依賴于離子交換劑和樣品平衡至向柱引入樣品之前的相同條件。
[0006]一些色譜介質(zhì)體現(xiàn)了電荷與其它類型的化學官能團的組合。這些介質(zhì)被概括地稱作混合模式或多模式材料，且可以將電荷與疏水基團、金屬親和力、有利于氫鍵形成的基團或化學基團進行不同地組合。取決于第二官能團的性質(zhì)，它們在不同的化學條件下運行，但是它們?nèi)匀灰越Y(jié)合-洗脫和流穿模式運行。
[0007]已經(jīng)描述了少數(shù)將電荷與物理官能團組合的多模式材料，例如，在帶電荷材料也具有根據(jù)物質(zhì)的大小來分選所述物質(zhì)的能力的情況下。一個這樣的例子采用與正電性表面組合的可變尺寸排阻官能團[Hunter, A., J.Chromatogr.A 897:65-80 (2000)；Hunter, A., J.Chromatogr.A 897:81-97 (2000) ;Hunter, A., J.Chromatogr.A930:79-93 (2000) ；Hunter, A.，J.Chromatogr.A 971:105-116 (2000)]。所述方法通常包括，使蛋白以尺寸依賴性的方式進入顆?？字?，同時表現(xiàn)出對蛋白上的電荷以及緩沖液條件的協(xié)同依賴性。象用于分級分離的其它帶電荷材料一樣，所述方法采用結(jié)合-洗脫和流穿操作模式。
[0008]最近(Nian等人.J.Chromatogr.A 1282(2013) 127-132.)，已經(jīng)描述了被稱作空隙排阻色譜法的新色譜法模式。用于實施所述方法的材料包括用正電性顆粒填充的柱(參見Hunter出處同上)，前提條件是，施加于柱的樣品體積不大于被顆粒之間的空間占據(jù)的體積。描述了用于純化抗體的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]提供了用于純化多核苷酸的方法、材料和試劑盒。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于純化包含多核苷酸的樣品的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供填充的色譜柱，其包含帶負電荷的多孔顆粒，(?)將所述填充的色譜柱平衡至允許所述樣品中的多核苷酸洗脫的條件，(iii)使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸，使得施加于所述填充的色譜柱的樣品體積小于或等于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間，和(iv)從所述填充的色譜柱洗脫多核苷酸，其中所述多核苷酸處于更純的狀態(tài)。
_0] 發(fā)明的詳細描述
[0011]在某些實施方案中，本發(fā)明涉及用負電性的多孔顆粒填充的柱，其中多核苷酸可以通過靜電排斥力(其不依賴于來自孔的空間位阻或與來自孔的空間位阻組合)或僅通過來自孔的空間位阻而基本上限于顆粒之間的空間(即顆粒間或空隙空間)。這可以造成所述多核苷酸基本上(如果不是排它地)穿過空隙空間而經(jīng)過柱。具體地，空間位阻表示這樣的機制:其中在阻止多核苷酸克服由孔內(nèi)的帶負電荷的配體的構(gòu)型產(chǎn)生的物理阻力的條件下，多核苷酸不能進入孔空間中。許多污染性蛋白(包括從生產(chǎn)多核苷酸的宿主細胞產(chǎn)生的那些)和細胞培養(yǎng)基組分(包括鹽、非離子的物質(zhì)、和兩性離子的物質(zhì))能夠進入顆粒的孔中，這被認為(不限于任何具體理論)會減慢它們穿過柱的運輸，并造成它們隨著緩沖液流過柱而變得與更快迀移的多核苷酸分離。酸性污染物可以通過結(jié)合至負電性表面而進一步減慢。
[0012]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該方法允許有效地分級分離尤其是多核苷酸，不論樣品條件如何，不論大多數(shù)污染物的化學特性如何，且不論在樣品施加以后為了迫使多核苷酸穿過柱而立即施加的緩沖液的組成如何。在某些實施方案中，本發(fā)明的一個優(yōu)點是，它可以在寬范圍的條件(pH、鹽濃度、電導率等)下實施，且因此可以為了在制備和純化多核苷酸的過程中方便實現(xiàn)本發(fā)明的方法以及在本發(fā)明的方法之前或之后的方法而選擇那些條件。在某些實施方案中，通過將樣品施加限制為不超過柱內(nèi)的帶負電荷顆粒的顆粒間體積的體積，可以實現(xiàn)這些獨特的操作特征和結(jié)果。另外，在某些實施方案中，所述方法既不與其它類型的帶負電荷材料(包括無孔的顆粒、膜或整體料)一起應用，也不通過將帶負電荷的多孔或無孔顆?；蚩扇苄缘膸ж撾姾删酆衔锓稚⒃跇悠穬?nèi)來應用。相反，在本發(fā)明的某些實施方案中，所述方法用多孔顆粒的填充柱實現(xiàn)。在某些實施方案中，與使用多孔顆粒填充柱的其它多核苷酸純化方法相比，本發(fā)明是非常有利的，因為穿過顆粒間空間的運輸是對流的，而不是擴散的。這允許所述方法以比其它顆粒-柱方法更高的流速有效地進行，這會轉(zhuǎn)化成更高的生產(chǎn)力。
[0013]已經(jīng)進一步發(fā)現(xiàn)，可以如下增強本發(fā)明的某些實施方案的固有分級分離能力:在柱床內(nèi)的顆粒上包括額外表面官能團，只要將柱平衡至不會造成多核苷酸被那些額外官能團截留或顯著減慢的條件。這樣的官能團可以包括、但不限于帶正電荷的基團、疏水基團、π-π鍵合基團、氫鍵合基團或金屬-螯合基團。這些額外官能團可以位于與帶負電荷的基團相同的化學部分上，位于與帶負電荷的基團相同的多孔顆粒上，或位于可為多孔或無孔的不同顆粒上。在通過包括額外顆粒而添加第二官能團的情況下，可以施加的樣品的體積可以限于這樣的體積:其對應于僅在柱中的帶負電荷的多孔顆粒之間存在的顆粒間空間。該體積可以估計為柱中的帶負電荷的多孔顆粒的重力沉降體積的約40%，但是如果物理地壓縮顆粒床的話可以更小，且可以通過實驗定量地確定。
[0014]在某些實施方案中，可以如下增強通過所述方法提供的純化程度:用試劑預處理所述樣品，以促進可能已經(jīng)與多核苷酸結(jié)合的污染物的解離。這樣的試劑具體地包括各種解離劑，包括高濃度的鹽、脲、氨基酸、非離子有機聚合物、有機溶劑和表面活性劑等。在某些實施方案中，在高達6M濃度的離液鹽胍對于從新鮮勻漿化的細胞或其它復雜制品解離多核苷酸而言可能是特別有用的。在所述方法的常規(guī)實施過程中，與樣品中的其它小分子一起除去解離劑。這凸顯了本發(fā)明的2個優(yōu)點:第一個是，它不需要將樣品預先平衡至所述柱將運行的條件，即使當樣品條件根本不適合用于以結(jié)合-洗脫或流穿模式進行離子交換色譜法時；第二個是，不論樣品的組成如何，樣品洗脫在用于平衡柱的緩沖液中，從而實現(xiàn)緩沖液更換與多核苷酸的純化結(jié)合。
[0015]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于純化含有多核苷酸的樣品的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供填充的色譜柱，其包含帶負電荷的多孔顆粒，(?)將所述柱平衡至要洗脫所述樣品中的多核苷酸的條件，(iii)使所述樣品與所述柱接觸，使得施加于所述柱的樣品體積小于或等于所述柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間，(iv)從所述柱洗脫多核苷酸，其中所述多核苷酸處于更純的狀態(tài)且處于所述柱要平衡至的條件。
[0016]在上述實施方案中，所述多核苷酸物質(zhì)可以是基因組多核苷酸、多核苷酸片段或多核苷酸質(zhì)粒。所述多核苷酸可以具有天然或重組起源。
[0017]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品可以是沒有預先純化的。
[0018]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品可以在實施本發(fā)明之前濃縮。
[0019]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品可以已經(jīng)通過超濾進行濃縮。
[0020]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品可以已經(jīng)經(jīng)歷先前純化步驟達到中間純度水平或高純度水平。
[0021]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品的中間純度水平可以是約40%至約90%純度的范圍內(nèi)或更大。
[0022]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品的高純度水平可以是約90%或更大。
[0023]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的90 %。
[0024]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的80 %。
[0025]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的70%。
[0026]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的60 %。
[0027]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的50%。
[0028]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間的0.1%。
[0029]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述填充的色譜柱可以僅用帶負電荷的多孔顆粒填充，且所述樣品體積可以小于所述填充的色譜柱的體積的40%。
[0030]在每個上述實施方案的一個或多個中，樣品施加條件包括在大約2至大約9的pH范圍內(nèi)的pH。
[0031]在每個上述實施方案的一個或多個中，可以將所述填充的色譜柱平衡至大約4至大約8的pH。
[0032]在每個上述實施方案的一個或多個中，可以用具有約4.5至約6.0的pH的緩沖液平衡所述填充的色譜柱。
[0033]在每個上述實施方案的一個或多個中，樣品施加條件包括在大約0.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍內(nèi)的電導率值。
[0034]在每個上述實施方案的一個或多個中，可以將所述填充的色譜柱平衡至大約0.lmS/cm至大約30mS/cm的電導率值。
[0035]在每個上述實施方案的一個或多個中，可以將所述填充的色譜柱平衡至約0.1至約15mS/cm的電導率值。
[0036]在每個上述實施方案的一個或多個中，可以用具有約4.5的pH和小于約lmS/cm的非零電導率值的緩沖液平衡所述填充的色譜柱。
[0037]在每個上述實施方案的一個或多個中，為了在洗脫液上進行后續(xù)純化步驟，可以將所述填充的色譜柱平衡至處于或接近樣品施加條件的條件。
[0038]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述帶負電荷的多孔顆粒是陽離子交換顆粒。
[0039]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述陽離子交換顆粒具有電負性，所述電負性的至少部分由選自以下的基團提供:羧基、磺基或磷?；?br> [0040]在每個上述實施方案的一個或多個中，電負性可以由超過一種帶負電荷的基團提供。
[0041]在每個上述實施方案的一個或多個中，電負性可以由復雜配體提供，所述復雜配體包括與賦予第二反應性的其它官能團組合的羧基、磺基或磷?；Ｔ谝粋€這樣的實施方案中，電負性可以由復雜配體提供，所述復雜配體包括與至少一個氨基組合的一個或多個羧基，使得帶負電荷的配體具有參與金屬配位的強能力。這樣的配體的例子可以是亞氨基二乙酸或次氮基三乙酸(nitriloacetic acid)。在另一個這樣的實施方案中，所述復雜配體可以包含與一個或多個負電荷直接地或間接地共價連接的芳族或脂族疏水基團。
[0042]在每個上述實施方案的一個或多個中，除了負電性的多孔顆粒以外，所述填充的色譜柱還包含其它顆粒。
[0043]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述負電性的多孔顆?；蛩銎渌w粒中的至少一種包含一個或多個選自以下的第二化學官能團:陰離子交換、疏水相互作用、氫鍵合、JT-JT相互作用和金屬螯合作用。
[0044]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述方法可以進一步包括:在使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸的步驟之前，使所述樣品與一種或多種解離劑接觸的額外步驟，其中所述解離劑的目的是，將多核苷酸物質(zhì)從它可能非特異性地結(jié)合的污染物解離。
[0045]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述解離劑可以是有機溶劑。
[0046]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述解離劑可以是乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亞砜、甘油、乙醇或異丙醇。
[0047]在上述實施方案的一個或多個中，所述解離劑可以以從非零量至0.1%或更高、1%或更高、10%或更高、或20%或更高范圍內(nèi)的濃度存在。
[0048]在一個或多個上述實施方案中，所述解離劑可以是從非零濃度至8M或更高(例如
0.5M或更高、IM或更高、2M或更高、4M或更高、6M或更高)的離液劑，諸如尿素。
[0049]在一個或多個上述實施方案中，所述解離劑可以是表面活性劑。
[0050]在一個或多個上述實施方案中，所述表面活性劑可以是:非離子表面活性劑，諸如Triton或吐溫或Brij ;或兩性離子表面活性劑諸如CHAPS、CHAPSO或辛基葡萄糖苷。
[0051]在一個或多個上述實施方案中，所述表面活性劑可以以小于0.1 %的濃度存在于樣品中。
[0052]在一個或多個上述實施方案中，所述解離劑可以是氫鍵干擾劑，諸如尿素或山梨醇。
[0053]在一個或多個上述實施方案中，所述解離劑可以是氨基酸，諸如精氨酸、賴氨酸或組氨酸。
[0054]在一個或多個上述實施方案中，所述氨基酸可以是在從非零量至500mM的范圍內(nèi)的濃度。
[0055]在一個或多個上述實施方案中，所述解離劑可以是螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)、三(2-氨基乙基)胺(TREN)或去鐵胺。
[0056]在一個或多個上述實施方案中，所述螯合劑可以是在從非零量至50mM的范圍內(nèi)的濃度。
[0057]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述方法可以進一步包括:在使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸的步驟之前，使所述樣品與一種或多種鹽接觸的額外步驟，其中所述鹽的目的是，將多核苷酸物質(zhì)從它可能非特異性地結(jié)合的污染物解離。
[0058]在每個上述實施方案的一個或多個中，加入所述樣品中的鹽可以由氯化鈉、氯化鉀或其它所謂的中性鹽組成。
[0059]在每個上述實施方案的一個或多個中，加入所述樣品中的鹽可以由離液鹽(諸如胍)組成。
[0060]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述鹽可以是在從非零量至2M或更高(例如50mM或更高、10mM或更高、200mM或更高、500mM或更高、IM或更高)的范圍內(nèi)的濃度。
[0061]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述污染物可以是金屬離子、蛋白、脂質(zhì)、內(nèi)毒素、病毒、細胞培養(yǎng)基組分、不希望的核苷酸物質(zhì)或它們的組合。
[0062]在每個上述實施方案的一個或多個中，所述樣品可以含有一種或多種污染物，其中由于執(zhí)行本文中公開的方法，所述多核苷酸的更純狀態(tài)與所述樣品相比具有降低的這類污染物的含量。
[0063]可以提供用于方便地實施任意上述實施方案的方法的試劑盒。
[0064]在某些實施方案中，所述顆粒間空間大于樣品體積的大約2倍。在某些實施方案中，含有多孔負電性顆粒的柱部分的顆粒間空間大于樣品體積。在某些具有僅用帶負電荷的多孔顆粒填充的柱的實施方案中，所述樣品體積是填充柱體積的約40%或小于填充柱體積；在某些具有用帶負電荷的多孔顆粒和其它顆粒填充的柱的實施方案中，所述樣品體積是柱中重力沉降的帶負電荷的多孔顆粒的體積的約40%或小于該體積。
[0065]在某些實施方案中，在柱中填充的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間具有與樣品大約相同的體積，或比樣品體積大1 %，或比樣品體積大20、30、40、50、60、70、80、90或100%，或比樣品體積大1.5或2或2.5或3或4或5倍或更多倍。
[0066]在某些實施方案中，在使所述樣品與所述柱接觸之前，用平衡緩沖液平衡所述柱。在某些這樣的實施方案中，將所述柱平衡至大約3至大約9的pH。在某些這樣的實施方案中，用具有約4至約6.0的pH的緩沖液平衡所述柱。在某些這樣的實施方案中，用具有約
4.5至約5.5的pH的緩沖液平衡所述柱。在某些實施方案中，將所述柱平衡至大約lmS/cm至大約30mS/cm的電導率值。在某些實施方案中，選擇所述柱的pH、鹽濃度和電導率條件，使得負電性的多孔顆粒和來自樣品的組分(除了多核苷酸以外)之間的靜電相互作用基本上暫停(suspend)。在本發(fā)明的某些實施方案中，可以為平衡緩沖液和/或洗脫緩沖液選擇pH、鹽濃度和電導率條件，使得負電性的多孔顆粒和來自樣品的組分(除了期望的蛋白以外)之間的靜電相互作用基本上暫停。在某些實施方案中，經(jīng)平衡的柱的電導率為約0.1至約15mS/cm。在某些實施方案中，為了在洗脫液上進行后續(xù)純化步驟，可以將所述柱平衡至處于或接近樣品施加條件的條件。
[0067]在某些實施方案中，所述樣品條件可以在從大約3的pH至大約10的pH的范圍內(nèi)。在某些這樣的實施方案中，所述樣品的電導率值可以在從大約0.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，所述樣品條件可以在從大約2的pH至大約10的pH的范圍內(nèi)，且在某些實施方案中，所述樣品的電導率值條件可以在從大約0.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍內(nèi)。
[0068]在某些實施方案中，所述洗脫條件可以在從大約2的pH至大約10的pH的范圍內(nèi)。在某些這樣的實施方案中，在樣品以后立即施加的緩沖液的電導率可以在從大約0.lmS/cm至大約250mS/cm的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，在樣品以后立即施加的緩沖液具有比樣品或平衡緩沖液更低的電導率。在某些實施方案中，在樣品以后立即施加的緩沖液具有比樣品或平衡緩沖液更高的電導率。
[0069]在某些實施方案中，所述柱平衡緩沖液可以具有約5.0的pH和小于lmS/cm的電導率，諸如在沒有加入鹽的情況下由20mM或更低濃度的乙酸介導。在某些實施方案中，所述乙酸鹽的濃度可以是在約20mM至約50mM的范圍內(nèi)。
[0070]在某些實施方案中，在樣品以后立即施加的緩沖液可以具有與平衡緩沖液相同的組成。在某些實施方案中，在樣品以后施加的緩沖液可以具有與平衡緩沖液不同的組成。在某些實施方案中，在樣品以后立即施加的緩沖液可以具有比平衡緩沖液高得多的電導率，其目的是，除去可能與帶負電荷顆粒結(jié)合的帶正電荷材料。
[0071]在某些實施方案中，可以在樣品中包括過量的鹽或其它添加劑，以在為后續(xù)使用循環(huán)的準備中清潔柱。應該理解，這樣的添加劑也可以介導解離多核苷酸和污染物物質(zhì)之間的非特異性相互作用的有益效果，結(jié)果是，通過該技術(shù)達到純度程度的增加和/或聚集體減少。
[0072]在某些實施方案中，所述帶負電荷的多孔顆粒是陽離子交換顆粒。在某些這樣的實施方案中，所述陽離子交換顆粒具有電負性，所述電負性部分地由諸如羧基、磺基、磷酰基、亞氨基二乙酸基或次氮基三乙酸基等基團提供。在某些實施方案中，所述柱含有除了負電性的多孔顆粒以外的顆粒。在某些實施方案中，所述負電性的多孔顆粒和所述額外顆粒中的至少一種具有一個或多個選自以下的第二化學官能團:陽離子交換、疏水相互作用、氫鍵合、JT-JT相互作用和金屬螯合作用。
[0073]在某些實施方案中，所述技術(shù)利用所謂的嫁接配體，所述嫁接配體在顆?？變?nèi)建立帶電荷基團的致密網(wǎng)絡，使得所述網(wǎng)絡在物理上阻礙或阻止缺少強正電荷的溶質(zhì)的進入。
[0074]在某些實施方案中，所述技術(shù)利用帶負電荷的多孔顆粒色譜介質(zhì)，其具有阻止多核苷酸的有效進入的孔徑。可用于阻止多核苷酸顆粒進入的示例性孔徑包括約1nm至約10nm的范圍，包括在二者之間的任意值和其分數(shù)，取決于多核苷酸的尺寸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，也可以采用小于1nm的孔徑，包括、但不限于，1、2、3、4、5、6、7、8或9nm。同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員還會明白，可以采用大于10nm的孔徑，包括、但不限于，120、150、200、300和500nm，包括在其之間的任意值和其分數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，基于要純化的多核苷酸適當?shù)剡x擇孔徑。這樣的多孔顆?？梢詷?gòu)成整個樣品體積或其任意更小部分。
[0075]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在使所述樣品與所述柱接觸的步驟之前，使所述樣品與解離劑接觸的額外步驟。在某些這樣的實施方案中，解離劑可以是鹽、有機溶劑或有機聚合物、氫鍵干擾劑、離液劑、表面活性劑或螯合劑。
[0076]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在使所述樣品與所述柱接觸的步驟之前，使所述樣品與超過一種解離劑接觸的額外步驟。在某些這樣的實施方案中，所述解離劑可以包括任意下述解離劑類別中的超過一種，或來自不同類別的試劑的組合，其中所述類別包括例如:鹽、有機溶劑或有機聚合物、氫鍵干擾劑、離液劑、表面活性劑或螯合劑。
[0077]在某些這樣的實施方案中，所述解離劑是選自以下的非離子有機聚合物:聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。在某些這樣的實施方案中，所述解離劑具有大約500D或更小的平均分子量。在某些這樣的實施方案中，所述解離劑是選自以下的有機溶劑:乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亞砜、乙醇和甘油。在某些這樣的實施方案中，所述解離劑以大約1%(w/v)或更大的濃度提供。
[0078]在某些實施方案中，所述解離劑是選自以下的表面活性劑:吐溫、Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷。在某些這樣的實施方案中，以大約1% (w/v)或更低的非零濃度，或以大約0.1% (w/v)或更低的非零濃度，提供所述表面活性劑。
[0079]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其包括:在使所述樣品與所述柱接觸的步驟之前，除去不溶性固體的額外步驟。
[0080]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中所述樣品含有一種或多種污染物，其中由所述方法的執(zhí)行產(chǎn)生的多核苷酸的更純狀態(tài)具有與樣品相比降低的這類污染物的含量。例如，在某些實施方案中，在所述污染物是蛋白的情況下，蛋白濃度可以下降超過10倍、或超過20倍、或超過50倍、或超過90倍、或超過95倍。
[0081]在某些實施方案中，通過在使多核苷酸基本上不被帶負電荷顆粒結(jié)合的條件下暴露于那些顆粒，調(diào)節(jié)澄清的、但是在其它方面未純化的樣品，其目的是，在實施本發(fā)明之前清除高酸性的污染物。在一個這樣的實施方案中，將帶負電荷顆粒直接加入樣品中，例如以整個樣品體積的約2-5% (V:V)的量。在某些這樣的實施方案中，所述帶負電荷顆粒包括第二官能團，諸如其具有參與疏水相互作用或金屬配位的能力。在這樣的實施方案中，該實施應當理解為如下改善本發(fā)明的執(zhí)行:除去可能干擾多核苷酸與用于實施本發(fā)明的填充柱的帶負電荷顆粒之間的相互作用的樣品組分。在某些這樣的實施方案中，該處理發(fā)生在通過超濾濃縮多核苷酸之前。在其它這樣的實施方案中，該處理可以在沒有有關(guān)的超濾步驟下發(fā)生。在其它這樣的實施方案中，該處理發(fā)生在通過超濾濃縮多核苷酸之后。在第一種情況中，應當理解可能改善超濾步驟的執(zhí)行。在最后一種情況中，應當理解會減小處理過程的體積和清除高酸性的污染物所需的帶負電荷顆粒的體積。在任何情況下，在本發(fā)明的處理之前，可以在除去顆粒之前添加中間步驟。
[0082]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于方便地實施本發(fā)明的方法的試劑盒，所述試劑盒包括執(zhí)行本發(fā)明所需的一些或全部材料，優(yōu)選地以方便地執(zhí)行本發(fā)明的方法的量和濃度。這樣的試劑盒還可以包括在所述試劑盒中提供的材料的使用說明書。
[0083]定義下述術(shù)語以便可以更容易地理解本發(fā)明。在詳細描述中闡述了其它定義。
[0084]“柱平衡”表示達到期望的緩沖液在用色譜介質(zhì)填充的柱中的穩(wěn)定和均勻分布。在平衡時，在柱出口處測量的洗脫液的pH、電導率和UV吸收基本上等于在柱入口處引入的洗脫液。
[0085]“柱體積”表示在被稱作柱的通常為圓柱形的裝置內(nèi)的填充顆粒的總體積。術(shù)語柱體積通常理解為對應于所謂的總柱體積，其包含3個部分:被稱作空隙體積的顆粒間空間的體積，被稱作孔體積的孔內(nèi)的體積，和經(jīng)常被稱作基質(zhì)體積的被顆粒的固體基質(zhì)占據(jù)的體積。
[0086]“電導率值”表示電解質(zhì)溶液的導電能力。可以測量電解質(zhì)的溶液的電導率，例如，通過確定被固定距離隔開的2個電極之間的溶液的電阻。電導率值最常見地被表示為毫西門子 /cm (mS/cm)。
[0087]“污染物”表示降低多核苷酸純度的任何不希望的無機或有機實體。污染物包括這樣的實體:其可以與多核苷酸形成在多種條件下保持穩(wěn)定的結(jié)合體。本發(fā)明的方法可以提供這樣的聚集體的有效解離，以將多核苷酸從它所結(jié)合的污染物回收。示例性的污染物具體地包括蛋白，但是也包括多核苷酸、細胞內(nèi)容物、細胞培養(yǎng)基組分等。
[0088]“負電性的多孔顆粒”或“帶負電荷的多孔顆?！北硎具@樣的不溶性固體:其可以是或不是大致球形的，且可以具有任意尺寸的孔。任選地，顆粒可以具有在小于10微米至超過100微米的范圍內(nèi)的尺寸，且平均孔徑可以在從小于1nm(多微孔的)至超過10nm(大孔的)的范圍內(nèi)。顆粒的電負性可以由化學基團提供，所述化學基團包括、但不限于弱陰離子交換基團、羧基或磷?；?，強陰離子交換基團諸如磺基，或具有凈負電荷的多模式基團，或前述基團的組合。在帶負電荷的表面上建立多模式特性的第二官能團可以由帶負電荷的或帶正電荷的基團、疏水基團、鍵合基團、氫鍵合基團或金屬-螯合基團組成。所述第二官能團可以作為用于合成顆粒的制備材料或方法的非故意副產(chǎn)物存在于負電性顆粒上，或它們可以通過故意設計而存在。第二官能團的濃度可以在從小于I毫當量/mL顆粒至超過100毫當量/mL的范圍內(nèi)。術(shù)語負電性的多孔顆粒包括市售的被稱作陽離子交換劑的多孔顆粒色譜材料，且可以包括為負電性的所謂的混合模式色譜材料。
[0089]“顆粒間體積”或“空隙體積”表示柱內(nèi)未被顆粒本身占據(jù)的體積；顆粒之間的空間。這經(jīng)常被稱作柱的空隙體積。對于類似大小的大致球形的顆粒而言，當所述顆粒通過重力進行沉降且不通過機械方式物理壓縮時，空隙體積通常占用那些顆粒填充的柱的約40%。
[0090]“孔體積”表示在多孔顆粒的孔內(nèi)的體積。所述孔可以是物理上未阻塞的，具有主要分布在孔壁上的帶正電荷的基團，或部分地阻塞的，具有分布在位于孔內(nèi)的聚合物網(wǎng)絡表面上或內(nèi)部的帶正電荷的基團。在所述孔被部分地阻塞的情況下，表觀阻塞程度可以隨抗體或其它樣品組分的電荷特征而變化，和/或作為緩沖液條件(諸如PH和電導率)的函數(shù)。
[0091]“非離子有機聚合物”表示天然存在的或合成的烴，所述烴由缺少帶電荷基團的連接的重復有機亞基組成。它可以是直鏈的，具有一些支鏈的主要直鏈的，或主要支鏈的。適合于實施本發(fā)明的例子包括、但不限于:聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有結(jié)構(gòu)式HO-(CH2-CH2-O)n-H。例子包括、但不限于:具有在小于100道爾頓至超過1000道爾頓的范圍內(nèi)的平均聚合物分子量的組合物。
[0092]“解離劑”表示這樣的有機或無機化合物:其通過促進污染物從要純化的多核苷酸的解離，可以減少污染，或與其它試劑組合輔助減少污染。有機解離劑可以包括、但不限于，酰脲、氨基酸、非離子有機聚合物、有機溶劑、螯合劑和表面活性劑等。無機解離劑具體地包括鹽。
[0093]“有機溶劑”表示以液體狀態(tài)存在的天然存在的或合成的有機化合物。適合于實施本發(fā)明的例子包括、但不限于:乙二醇、丙二醇、甘油、二甲亞砜、乙醇和苯氧乙醇。
[0094]“多核苷酸”表示由在鏈中共價地鍵合的多個核苷酸單體組成的生物聚合物。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的例子。多核苷酸的例子包括、但不限于，基因組DNA、cDNA、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、信使RNA(mRNA)、短干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)等。多核苷酸可以具有形成氫鍵的高傾向。這樣的多核苷酸可以以多種尺寸和構(gòu)型存在，其中的任一種可以通過本發(fā)明進行加工。多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈。
[0095]多核苷酸還可以包括非天然的多核苷酸，包括具有非天然主鏈(諸如硫代磷酸酯主鏈)的那些，或摻入非天然堿基的那些。多核苷酸還可以包括肽核酸(PNA)。
[0096]“蛋白”表不一組復雜有機大分子中的任一種，所述復雜有機大分子含有碳、氫、氧、氮，且經(jīng)常含有硫，并且主要由通過肽鍵連接的一條或多條氨基酸鏈組成。蛋白可以具有天然來源或重組來源?？梢杂梅前被岵糠中揎椀鞍?，諸如通過糖基化、聚乙二醇化或綴合其它化學部分。蛋白的例子包括、但不限于抗體、凝固因子、酶和肽激素。
[0097]“多核苷酸制品”表示含有目標多核苷酸的任意水性的或主要水性的溶液，諸如含有細胞的細胞培養(yǎng)物收獲物、(基本上)無細胞的細胞培養(yǎng)物上清液、或來自純化階段的含有目標多核苷酸的溶液。
[0098]“樣品施加條件”表示如何供給含有期望蛋白的樣品，且包括，例如，樣品濃度、洗脫液電導率、PH等。通常可以將樣品施加條件選擇成在該條件下使所述柱被平衡以確保純化的條件，或可以不同于這樣的條件。
[0099]“固體材料”表示不溶性的有機固體，所述固體在性質(zhì)上可以是微粒狀的、結(jié)晶性的、聚合的、纖維性的、多孔的-中空纖維的、整體的或膜狀的。它可以由無孔的或多孔的顆粒、多孔的膜、多孔的濾器或多孔的整體料組成。如果是微粒，所述顆?？梢允腔虿皇谴笾虑蛐蔚模铱梢跃哂袕男∮?0nm至超過100微米范圍內(nèi)的尺寸。多孔顆粒的平均孔徑可以在從小于約1nm(多微孔的)至超過約10nm(大孔的)的范圍內(nèi)。膜中的平均孔徑可以在從小于10nm至超過I微米的范圍內(nèi)。膜或整體料中的平均通道尺寸可以在從小于I微米至超過10微米的范圍內(nèi)。所述固體材料可以進一步由這樣的化合物構(gòu)造組成:例如其中將顆粒嵌入在網(wǎng)狀基質(zhì)中，夾在膜之間，或二者。
[0100]“表面活性劑”包括“表面活性劑(surface active agents) ”諸如這樣的有機分子類別:其通常具有疏水部分和親水部分，從而造成它們被稱作兩親的。在水溶液中的足夠濃度，表面活性劑可以自結(jié)合成簇，其中疏水部分聚集在中心以使與水的接觸最小化，且親水部分向外輻射以使與水的接觸最大化。在有生物制品(特別是含有具有疏水特性或具有疏水特性區(qū)域的材料的那些)存在下，表面活性劑的疏水部分傾向于自發(fā)地與疏水材料的一些部分結(jié)合，并通過表面活性劑的親水部分的影響而增加它們的溶解度。它們也可以用于調(diào)節(jié)溶解在水性溶劑中的不同疏水材料之間發(fā)生的疏水相互作用。適合用于實施本發(fā)明的某些實施方案的表面活性劑的例子包括、但不限于:非離子型表面活性劑諸如聚山梨酯表面活性劑(例如，吐溫20、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯和吐溫80、聚氧乙烯
(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)和Triton(例如，聚乙二醇對-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)，和兩性離子表面活性劑諸如CHAPS (3- [ (3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽)、CHAPSO(3-[ (3-膽酰氨基丙基)二甲基錢基]-2-輕基-1-丙燒橫酸鹽)和辛基葡萄糖苷(例如，(2R, 3S, 4S, 5R, 6R)-2-(羥甲基)-6-八氧基噁烷(octoxyoxane)-3, 4，5-三醇
[0101]“酰脲”表示具有天然或合成來源的環(huán)狀或無環(huán)有機分子，其包含一個或多個脲部分或其衍生物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了酰脲諸如尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿囊素(CAS號97-59-6 ;鋁克洛沙、尿囊素鋁、尿囊素、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙內(nèi)酰脲、乙醛?；ｋ濉⒁胰┧岫ｋ?、2，5-二氧代-4-咪唑烷基脲)、嘌呤、及其衍生物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了式 1?-0)-順-0)-順2或 R-C0-NH-C0-NH-C0-R’ 或 R’R" NH-CO-NR" ’R""的有機分子，其中有關(guān)的“R-基團”可以是H或任意有機部分。
[0102]“空隙排阻”表示這樣的化學相互作用:通過該作用，使用帶靜電荷的顆粒填充的柱的環(huán)境內(nèi)的樣品的至少一種組分由于靜電排斥的結(jié)果而被約束以基本上停留在柱床的顆粒間空間內(nèi)，和/或不能克服進入孔的物理阻力，所述物理阻力可以由位于顆粒中的孔的固有尺寸施加，或其次由其中在孔內(nèi)存在靜電荷的物理形式施加。
[0103]“空隙排阻模式”或“空隙排阻色譜法”表示在填充的帶靜電荷的顆粒的柱中實施的分級分離方法，其中施加于柱的樣品體積不大于填充的床內(nèi)的顆粒間體積，且期望的樣品組分(諸如蛋白)不能進入顆粒的孔中，且由此受約束在顆粒間空間(這也通常被稱作空隙體積)中移動。空隙排阻色譜法的一個基本的且獨特的特征是，不需要將樣品平衡至柱操作條件，作為其結(jié)果，樣品條件可以包括被認為不適合用于在帶靜電荷的顆粒上進行色譜法的非常高的鹽濃度和PH值。其它基本的且獨特的特征包括，它的達到緩沖液更換結(jié)合分級分離的獨特能力。在空隙排阻色譜法中，期望的蛋白洗脫在柱所平衡的緩沖液中，不依賴于用于將它施加于柱的樣品組成。
[0104]在某些實施方案中，在樣品施加之前，可以將多核苷酸洗脫在平衡柱的相同緩沖液中。在這樣的實施方案中，本發(fā)明可以提供以下優(yōu)點:它可以用于更換樣品所在的緩沖液的目的，從它的最初制劑至更適合用于通過其它方法進行后續(xù)加工的制劑。當樣品最初所在的緩沖液的組成沒有限制(除了避免破壞多核苷酸的要求以外)時，柱平衡緩沖液的組成必須在一定范圍內(nèi)，所述范圍不會在多核苷酸上產(chǎn)生正電荷至足以造成大部分多核苷酸結(jié)合帶負電荷顆粒的水平。適當?shù)钠胶鈼l件隨帶負電荷的多孔顆粒的選擇和具體多核苷酸的特定特征而變化。一般而言，柱平衡條件可以在以下范圍內(nèi)，但不限于此:小于0.lmS/cm至超過30mS/cm的電導率值，和從小于4.0至大于9.0的pH值。
[0105]在某些其中技術(shù)的目的是降低污染物水平的實施方案中，將有利的是，采用不會造成多核苷酸基本上結(jié)合帶負電荷顆粒的最低PH和/或最低電導率。應該理解，根據(jù)抗體的溶解度和穩(wěn)定性要求，可以調(diào)節(jié)最低PH和/或最低電導率的指南。
[0106]在某些其中負電性顆粒帶有額外化學官能團的實施方案中，可能必要的或有益的是，采用高PH值或包括添加劑，所述添加劑調(diào)節(jié)多核苷酸與顆粒表面的相互作用，以便實施所述方法。最簡單的這樣的轉(zhuǎn)化可以是添加NaCl或其它鹽。通過評價NaCl濃度的不同增量，諸如25mM、50mM、100mM、200mM等，可以實驗性地確定最有效的水平。一旦確定了有效范圍，可以用以更細的增量進行的后續(xù)實驗或借助于統(tǒng)計方法諸如所謂的實驗設計(DoE)將其細化。也可以考慮替代性的鹽，以及其它添加劑包括糖、離液劑、有機溶劑和表面活性劑等。也可以評價添加劑的組合，包括與不同的pH值的組合。
[0107]在某些實施方案中，位于柱內(nèi)的帶負電荷顆?？梢詫儆趩我活愋突蚨喾N類型，包括多孔和無孔顆粒的組合，或具有不同孔徑的多孔顆粒的組合。在本發(fā)明采用具有不同孔徑的顆粒的組合的情況下，一個顆粒子集可以具有在物理上排阻抗體的尺寸的孔，而另一個子集可以具有不排阻多核苷酸的孔徑。在這樣的情況下，具有足夠大以致于不排阻多核苷酸的孔的子集可以以在物理上阻礙缺少強正電荷的多核苷酸進入孔的方式呈現(xiàn)配體。
[0108]在某些實施方案中，本發(fā)明可以用于從粗制樣品或在任何純化階段初步分級分離多核苷酸；在任何情況下解釋了，本發(fā)明可以與其它純化方法組合，以達到特定多核苷酸應用所需的總純化程度。
[0109]在某些實施方案中，通過超濾可以濃縮要引入的樣品。
[0110]在某些實施方案中，可能有利的是，在將樣品引入柱之前，將樣品暴露于一個或多個帶負電荷的表面。這樣的暴露應當被理解為除去高正電性的樣品組分，所述組分可能傾向于污染用于實施本發(fā)明的柱，但是也應當理解，可能需要開發(fā)特殊條件來除去污染劑而不損失多核苷酸。例如，可能必須加入鹽，所述鹽足以阻止多核苷酸的結(jié)合，但是不足以阻止來自在其中生產(chǎn)多核苷酸的宿主細胞的多核苷酸壓緊蛋白的結(jié)合。在實施本發(fā)明之前所述樣品可向其暴露的帶負電荷的表面可以包括顆粒、膜、纖維、整體料或化合物構(gòu)造。
[0111]在某些實施方案中，在空隙排阻色譜模式中采用的負電性的色譜介質(zhì)包含選自陽離子交換劑、金屬親和介質(zhì)和多模式色譜介質(zhì)的一種，其具體例子包括Unosphere S和UNOsphere Rapid S ；UN0sphere Profinity ；Capto MMC，和適合于實施所述方法的基于其它負電性顆粒的介質(zhì)。在某些實施方案中，可以使用具有負電性基團的任意陽離子交換介質(zhì)，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，并非所有負電性的介質(zhì)都是合適的。盡管沒有完整地闡明限定成功介質(zhì)的確切參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員對于其在空隙排阻陰離子交換色譜法中的執(zhí)行能力可以容易地篩選任何特定負電性介質(zhì)。在最基礎水平，這容易在簡單實驗中完成，其中將候選陽離子交換顆粒填充在柱中，例如以20mL的體積。理想地允許顆粒通過重力進行沉降，然后設定液流接頭，使得它接觸、但是不顯著壓迫床。所述技術(shù)可以在這樣的柱上執(zhí)行:其中床已經(jīng)被壓縮，但是壓縮會減少顆粒間空間，其直接結(jié)果是，減小柱的容積樣品容量。例如，20mL重力沉降床可以具有高達約8mL的樣品容積容量，但是床的25%壓縮(達到15mL的容積)將會使容量減小至低于15mL相同介質(zhì)在重力沉降床中的容量的水平。這提示且實驗證據(jù)傾向于支持以下觀點:與顆粒體積不同，壓縮會不勻稱地減小顆粒間體積。理想地以特定方式構(gòu)造所述柱所在的色譜法系統(tǒng)，從而以不會造成樣品在到達柱的路上顯著稀釋的方式遞送樣品，因為所述技術(shù)依賴于進入柱的樣品的體積不大于柱的顆粒間體積。眾所周知層流會在邊界稀釋樣品。在具有幾米長度的5mL樣品環(huán)的實例中，樣品在進入柱時的樣品體積可以遠大于最初引入環(huán)中的5mL，例如可能增加至7.5mL或甚至1mL或更多。具有所謂的超環(huán)的系統(tǒng)非常適用于實施本發(fā)明，因為借助于它們對圓筒-柱塞設計的依賴性，它們允許施用大樣品體積，而不造成通過層流的過度稀釋。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解，作為流體穿過不同閥門和混合器的結(jié)果，任何給定的色譜法系統(tǒng)也造成樣品引入裝置(注射器)和柱之間的特定量的樣品稀釋，并且作為一般規(guī)則，柱體積與特定系統(tǒng)的內(nèi)部前置柱稀釋體積的比率越大，在柱(at-the-column)樣品體積作為功能系統(tǒng)稀釋的相對增加越低。實際上，這意味著，在設計和構(gòu)造成用于大規(guī)模應用的色譜儀上運行小柱將會對可以在注射器施加的樣品體積造成嚴重次要限制，而在這樣的系統(tǒng)上運行大柱將允許用戶在樣品進入柱的點處施加更大體積的樣品，所述體積保持在給定柱的容積限度內(nèi)。對于在系統(tǒng)諸如AKTA Explorer 100上的20mL重力填充的未壓縮的柱，使用深綠色PEEK管道，且配備預先已經(jīng)加載含有多核苷酸的樣品的超環(huán)，且用50mM乙酸鹽(pH 4.0)平衡柱，將ImL樣品加載上柱。在抗體開始離開柱的點處，做出圖標。在電導率變化(其指示與樣品結(jié)合的小分子的通過)的點處，做出另一個圖標。在所述標記之間的體積會提供柱的顆粒間體積的有用估計。計算顆粒間體積與總柱體積的比率。適合于執(zhí)行空隙排阻陽離子交換色譜法技術(shù)的陽離子交換色譜介質(zhì)將表現(xiàn)出約1/2.5的比率，但是表現(xiàn)出低比率(諸如1/2.4、1/2.3,1/2.2,1/2.1,1/2.0或更低)的介質(zhì)可以提供有用的結(jié)果，只要進入柱的樣品的體積沒有超過根據(jù)以上結(jié)果調(diào)節(jié)的體積即可。應當理解，這里提示的確定給定的陰離子交換介質(zhì)用于進行多核苷酸的空隙排阻陽離子交換色譜法的適合性的條件不一定是實現(xiàn)最有效的污染物除去的條件，也不一定是最適合于所有形式的多核苷酸的條件。還應當理解，包括額外化學官能團的負電性介質(zhì)(所述額外化學官能團造成所述負電性介質(zhì)被銷售用于所謂的多模式色譜法)將需要包括評價不同緩沖液條件的工藝開發(fā)的額外方面，以確定給定的介質(zhì)是否適合于執(zhí)行空隙排阻模式的吸附色譜法。一個實例包括所謂的混合模式或多模式負電性色譜介質(zhì)，其在Capto MMC的商品名下銷售，據(jù)稱其并入了造成它參與氫鍵和疏水相互作用的官能團。
[0112]本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將部分地闡述在下面的描述中，且部分地從所述描述顯而易見，或可以通過實施本發(fā)明來獲知。借助于在權(quán)利要求書中指定的要素和組合，會實現(xiàn)和達到本發(fā)明的目的和優(yōu)點。
[0113]應當理解，前述一般描述和下述詳細描述僅僅是示例性的和解釋性的，且不限制要求保護的發(fā)明。
[0114]在關(guān)于使用本發(fā)明的某些實施方案的準備中，必須確定就柱而言可用的樣品體積。在其最簡單的模式中，在柱中的所有顆粒都是帶負電荷的多孔顆粒的情況下，通過將未壓縮的重力沉降填充的色譜床的總體積乘以0.4，可以估計該值。通過簡單實驗可以精確地確定可允許的最大樣品體積，在所述簡單實驗中，將柱平衡至中等PH的低鹽緩沖液，并施加在高鹽緩沖液中的多核苷酸樣品，然后施加額外的平衡緩沖液。標記多核苷酸開始洗脫的點，如通過在280nm的UV吸光度的增加所指示的。標記高鹽開始洗脫的點，如通過電導率的增加所指示的。所述標記之間的體積代表該柱的每個循環(huán)的最大樣品體積。
[0115]對于包括除了多孔負電性顆粒以外的額外顆粒(諸如帶有第二化學表面的那些)的柱而言，適合執(zhí)行本發(fā)明的某些實施方案的樣品體積可以通過僅乘以帶負電荷的多孔顆粒的體積進行估計?？梢詰靡陨蠈嶒炓跃唧w地限定最大樣品。顯而易見，對于給定的混合的負電顆粒和其它顆粒柱而言，最大樣品體積相對于僅帶負電荷的多孔顆粒柱減小，與被非負電顆粒占據(jù)的相對柱體積成比例。
[0116]在某些實施方案中，用于純化特定多核苷酸制品的方法的開發(fā)通常開始于最簡單選擇的評價，所述最簡單選擇將是僅用帶負電荷的多孔顆粒填充的柱。適當?shù)念w?？梢杂射N售的用于實施所謂的陰離子交換色譜法技術(shù)的市售色譜介質(zhì)組成。數(shù)十種這樣的產(chǎn)品的例子包括:Capto S，Capto CM, Capto MMC, S Sephadex, CM Sephadex (GE Healthcare)；GigaCap S 和 S-Toyopearl(Tosoh B1separat1ns) ；Macroprep High-S,UNOsphere
5,UNOsphere Rapid S, Nuvia S, Profinity(B1-Rad Laboratories) ；Eshmuno S, SFractogel, (Merck);和S-HyperD(Pall)。這樣的產(chǎn)品目前沒有關(guān)于它們的表面上的第二官能團的特性或濃度進行標記，也沒有關(guān)于孔徑進行標記，也沒有關(guān)于排阻極限進行標記，也沒有關(guān)于虛擬孔徑(其源自它們各自的配體嫁接方法的采用以增強它們的功能性)進行標記，也沒有關(guān)于通?？蓮墓痰玫降倪@類信息進行標記。應當預見到，所有這樣的產(chǎn)品包括多個物理和化學官能團，且應當謹慎地評價超過一種產(chǎn)品以確定哪種在性質(zhì)上最適合用于純化特定多核苷酸制品。在一個實施方案中，評價可以開始于UNOsphere S和UNOsphere Rapid S、Capto MMC或更小的候選物子集。
[0117]對于任何給定的多核苷酸，評價柱最初平衡至的pH和電導率值范圍是可取的。作為一般規(guī)則，污染物減少在多核苷酸保持可溶性和穩(wěn)定性的最低PH和最低電導率時是最佳的，所以適當酸性的緩沖液諸如20-50mM乙酸鹽(pH 4.5)的最初條件可以是方便的開始地方?？梢噪S后評價更低和更高的PH值，其中pH值低至2.0或高于9.0，且電導率值范圍為從小于0.1mS/cm至超過30mS/cm。
[0118]在某些實施方案中可能有用的是，評價使得洗脫的樣品適合應用于后續(xù)純化步驟而無需進一步樣品制備的條件。例如，如果洗脫的樣品要在以后應用于陰離子交換柱(pH
6.0)，可能合乎需要的是，將所述柱平衡至pH 6.0。如果洗脫的樣品要在以后應用于羥磷灰石柱，可能合適的是采用中性PH和將緩沖液的磷酸鹽濃度設定在羥磷灰石柱需要的水平，并且省略螯合劑諸如EDTA或檸檬酸鹽。在為與后續(xù)分級分離方法的連續(xù)性選擇平衡緩沖液的任何情況下，將仍然通常評價低PH低電導率條件，以確保在本步驟中沒有犧牲純化潛力。
[0119]不受限于任何特定理論，據(jù)信，所述方法事實上不依賴于樣品組成。結(jié)果，在某些實施方案中，所述樣品可以含有多種試劑(單獨地或組合地)，以增強多核苷酸-污染物復合物的解離。
[0120]在某些實施方案中，其中已經(jīng)預先用如上所述的解離劑處理樣品中的多核苷酸，或如果要在未純化的細胞培養(yǎng)物上清液樣品上實施所述方法，通過使用具有大量第二官能團的帶負電荷的多孔顆粒，可以增強方法的執(zhí)行。實例可以包括基于多孔顆粒的市售的色譜法產(chǎn)品，其具有有意地與第二官能團組合的正電荷。這樣的介質(zhì)通常被稱作混合模式。Capto MMC (GE Healthcare)和 Nuvia cPrime (B1-Rad Laboratories)是市售的混合模式色譜法產(chǎn)品的例子，所述產(chǎn)品將正電荷與賦予參與疏水相互作用、鍵合和氫鍵合的能力的官能團組合。在文獻中已知了類似的組合，且可以預見到額外的市售實體。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可能需要修改平衡緩沖液的配方以防止被第二官能團截留或減慢。在CaptoMMC Nuvia cPrime的情況下，例如，可能必須在比銷售的用于陽離子交換的色譜介質(zhì)所要求的條件更高的PH和更高的電導率下操作。另一類所謂的多模式帶負電荷介質(zhì)可以包括所謂的固定化的金屬親和色譜配體(IMAC)諸如亞氨基二乙酸或次氮基三乙酸。但是，第二官能團的包含不會損害本發(fā)明的適應樣品的能力，無論樣品組成如何。這是與標準的流穿和結(jié)合-洗脫方法(其在有具有高電導率的樣品存在下完全不能達到分級分離)的一個基本的且重要的區(qū)別。
[0121]在某些其中樣品包括諸如上述的組合物的實施方案中，可替換地可能有用的是，將多孔負電性顆粒與具有第二化學官能團的不同顆粒組合，并將兩種或幾種顆粒類型一起填充在同一柱中。帶有第二官能團的顆?？梢允嵌嗫椎幕驘o孔的。如上所述，所述方法保持不依賴于樣品組成。同樣地，平衡條件可受限于暫停抗體和第二官能團之間的相互作用的需要。例如，如果存在帶有正電荷官能團的顆粒且特定多核苷酸具有結(jié)合這樣的電荷的強烈趨勢，可能必須降低PH和/或增加電導率。在如上所述的這種情況下，有利的權(quán)衡是，一個或多個第二官能團的包含可能實現(xiàn)更高的純化程度。
[0122]在某些其中將多孔負電性顆粒與具有第二官能團的不同顆粒組合的實施方案中，所述不同顆粒可以在負電性顆粒床的上面鋪層或填充在單獨的柱中，所述單獨的柱可以在負電性顆粒柱之前緊挨著或之后緊挨著懸垂。在某些實施方案中，將所述多孔負電性顆粒與帶有第二官能團的單獨顆粒混合。
[0123]在某些替代實施方案中，可以實施所述方法，使得第二顆?？梢灶A先直接加入樣品中，以清除可能引起麻煩的污染物，并然后將所述顆粒與樣品分離，使得部分地純化的樣品然后與柱接觸。
[0124]當開發(fā)顆?；旌衔镆詢?yōu)化特定多核苷酸的純化時，可以可替換地或額外地根據(jù)它們的增強PH控制和/或減小將柱滴定至其期望操作pH所需的緩沖液體積的能力，選擇第二官能團。例如，已知陰離子交換劑當暴露于升高的電導率時會產(chǎn)生失控的暫時PH增加。當電導率下降時，它們產(chǎn)生失控的暫時pH下降。這些效應的幅度和持續(xù)時間隨步驟之間的電導率差異、交換劑的電荷特征和緩沖容量而變化。陽離子交換劑遭受相同的問題，但是失控的PH偏離的方向與陰離子交換劑發(fā)生的方向相反。因此，將第二正電性官能團與主要負電性官能團組合會減小PH偏離的幅度和持續(xù)時間。通過實驗可以容易地確定官能團的理想混合物。
[0125]在某些采用不同于負電性顆粒的具有官能團的額外顆粒，且其中將那些不同顆粒與負電性顆?；旌匣蛟谪撾娦灶w粒之前填充在柱中的實施方案中，可能必須從施加于僅有負電性顆粒的柱的量向下調(diào)節(jié)最初樣品體積以補償樣品體積的增加，所述增加作為多核苷酸在穿過柱的過程中發(fā)生擴散而分散的結(jié)果而發(fā)生。通過簡單實驗可以容易地確定最初樣品體積的減小(如果有的話)的必要程度，其中判據(jù)是平衡緩沖液內(nèi)的多核苷酸的洗脫。
[0126]在某些實施方案中，由于所述方法的有效性不依賴于在樣品施加以后立即施加的緩沖液的組成，所述方法不同于帶負電荷的多孔顆粒的其它應用。在許多情況下，有利的是，在樣品施加之后立即施加緩沖液組合物，其意圖完全地洗脫與多孔顆粒結(jié)合的材料。例如，可以將柱平衡至25mM乙酸鹽(pH 4.5)。將含有多核苷酸的細胞培養(yǎng)物上清液(含有
1.0M氯化鈉，pH 7.0)以占柱體積的35%的體積施加，然后施加2M氯化鈉，pH 8.0?；旧霞兓亩嗪塑账嵯疵撛谝宜猁}緩沖液中。該現(xiàn)象的原因是，如上所述，多核苷酸僅僅穿過顆粒間空間移動，而追蹤-緩沖液還必須穿過顆粒內(nèi)孔空間移動。該方案的令人注目的特征是，它支持同時洗脫污染物和清潔柱的獨特能力，具有縮短過程循環(huán)、減少過程時間和材料使用的實際益處。這使得在小柱上執(zhí)行多個循環(huán)(而不是在大柱上的單個循環(huán))成為有吸引力的，這會進一步減少材料使用。
[0127]在某些實施方案中，可能有利的是，在樣品之后施加平衡緩沖液或較低電導率的緩沖液，例如20mM乙酸鹽(pH 4.0)，為了增強具有大于負電性多孔顆粒的平均孔徑的流體動力學尺寸的酸性污染物(諸如多核苷酸)的保留的明確目的，因為它們否則可以在多核苷酸的拖尾邊界處洗脫，并可能污染它至過度的和非必要的程度。就所述柱可以包括增加的正電性顆粒而言，這也可以增強負電性污染物的除去。從約50 %的填充柱體積開始，可以通過實驗確定低電導率追蹤-緩沖液的理想體積。
[0128]在某些實施方案中，所述方法支持比在多孔顆粒上的色譜法常用的流速更快的流速。這是因為，在質(zhì)量運輸是對流的情況下，多核苷酸僅僅穿過顆粒間空間移動，且因此不受多核苷酸的緩慢擴散常數(shù)影響，也不受流速或樣品粘度影響。因此，所述方法可以在高達100cm/小時或更大的線性流速高效地實施，與此相比，普通的多孔顆粒色譜法操作在50-100cm/小時或更低進行。但是，超過300cm/小時的流速可能需要減小的樣品體積。這是因為，能夠進入孔中的污染物的質(zhì)量運輸是擴散性的，在增加流速或樣品粘度的情況下變得低效。過度的流速會使污染物具有更少的機會達到與多孔顆粒的孔的擴散平衡。實驗將揭示任何給定的多核苷酸和緩沖液組合物集合的理想流速。
[0129]在某些其中將負電性的多孔顆粒組合在帶有其它表面化學成分的多孔顆粒的柱中的實施方案中，通常有用的是，將最大樣品體積僅僅基于負電性顆粒的體積。即使那樣，可能需要謹慎地通過實驗確定最大樣品體積，因為缺少負電性表面的顆粒的存在可能具有稀釋柱內(nèi)的樣品的效應。
[0130]在某些實施方案中，可以將帶有表面化學成分(而不是負電性)的顆粒填充在單獨的柱中，所述單獨的柱與負電性顆粒柱串聯(lián)懸垂。在這樣的構(gòu)型中，可以適用與以下情形討論的相同的注意事項:將其它化學顆粒與負電性顆?；旌显谕恢?。
[0131]在某些實施方案中，本文中公開的方法可以用于樣品制備以后的初步純化步驟中。在其它實施方案中，它可以用于中間純化，或它可以用于最終純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，在其中沒有將所述方法用作過程的最后一個步驟的任何情況下，它具有如下促進總過程連續(xù)性的能力:通過它在減少污染物的同時用緩沖液交換樣品的能力。
[0132]在某些實施方案中，本發(fā)明可以與其它純化方法結(jié)合實施。具體地，它可以與尺寸排阻、陰離子交換、陽離子交換、疏水相互作用、差別排阻、羥磷灰石或其它形式或混合模式色譜法或生物親和色譜法以任意組合使用；也與沉淀、結(jié)晶、超速離心和水性兩相分配方法結(jié)合使用。
[0133]得到經(jīng)加工的多核苷酸以后，可以拋棄柱的內(nèi)容物?？商鎿Q地，可以用高濃度的鹽清潔柱，然后通過重新平衡來恢復至原始條件，使得它可以用于額外的循環(huán)。也可以用適當?shù)脑噭?諸如氫氧化鈉)將所述柱消毒。
[0134]在某些實施方案中，可以將本發(fā)明機械化和自動化以增加處理量。在某些這樣的實施方案中，例如，所述方法可以包括:自動化的多柱系統(tǒng)，諸如用于執(zhí)行模擬的移動床色譜法。
實施例
[0135]提供下述實施例來指導本發(fā)明的實施。盡管提供的實施例具體地顯示了 DNA的不同純化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，類似的條件和原理可以應用于RNA和其它天然的或非天然的多核苷酸的純化。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，在操作一些核苷酸(諸如RNA)時，由于它們極大的不穩(wěn)定性，適當?shù)木杩赡苁潜匾?。這樣的必要警惕完全是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的權(quán)限內(nèi)。
[0136]實施例1.用多孔顆粒陽離子交換介質(zhì)(Nuvia S，B1-Rad)填充柱。用5OmMHepes (pH 7.0)平衡柱。將哺乳動物(中國倉鼠卵巢(CHO))細胞在4M胍中勻漿化。通過離心使物理碎片沉淀。將在4M胍中的上清液(占柱體積的20% )施加于柱，并用平衡緩沖液追蹤樣品。超過90%的DNA洗脫在平衡緩沖液中。稍后與來自原始樣品的胍的通過一起，除去蛋白和其它污染物。
[0137]實施例2.如實施例1所述，將得自鮭魚精的純化的DNA施加于柱。平衡緩沖液是50mM Tris (pH 8.0)，其導致DNA洗脫在該緩沖液中。將洗脫的DNA直接施加于平衡至相同條件的陰離子交換整體料(QA)。隨后用鹽梯度從陰離子交換整體料洗脫DNA，以約60mS/cm的電導率洗脫。本實施例解釋了可以如何使用本發(fā)明在單個單元操作中純化DNA和制備用于后續(xù)方法步驟的樣品。
[0138]實施例3.如實施例2所述，將得自鮭魚精的純化的DNA施加于Nuvia S柱。平衡緩沖液為50mM H印es、50mM磷酸鹽(pH 7.0)，其導致DNA洗脫在該緩沖液中。將洗脫的DNA直接施加于羥磷灰石(CHT I型，40微米)的柱，然后洗脫在磷酸鹽梯度中，在約225-275mM磷酸鹽mS/cm的磷酸鹽濃度范圍內(nèi)洗脫。本實施例提供了可以如何使用本發(fā)明在單個單元操作中純化DNA和制備用于后續(xù)方法步驟的樣品的另一種解釋。普通技術(shù)人員會明白，本發(fā)明可以類似地用于連接2個純化步驟，例如用羥磷灰石執(zhí)行初步純化步驟，使用本發(fā)明實現(xiàn)額外的純化，同時平衡樣品用于施用于陰離子交換柱，然后執(zhí)行陰離子交換步驟。普通技術(shù)人員會明白，這樣的3-步法可以適合用于將基因治療載體純化至適合于體內(nèi)人治療的水平。
[0139]實施例4.從新鮮哺乳動物細胞純化DNA。通過離心從細胞培養(yǎng)物濃縮中國倉鼠卵巢細胞。拋棄上清液，并將干燥的胍直接加入樣品中，以建立3M的終濃度。將細胞在胍中手工地勻漿化，然后通過離心除去大部分微粒，隨后通過穿過0.45微米膜過濾完全除去它們。將5mL澄清上清液樣品施加于20mL的UNOsphere Rapid S柱，該柱平衡至0.05M乙酸鹽(pH 4.1)。樣品之后施加足夠的緩沖液，以推進樣品穿過柱。同時在254和280nm監(jiān)測柱流出物。洗脫峰的254/280比率為約1.7，指示高度地、但是不完全純化的DNA。污染物和胍洗脫在第二個峰中，并拋棄。將在0.04M乙酸鹽(pH 4.1)中的含有DNA的樣品滴定至PH 7.0，并施加于平衡至相同條件的QA 334微升整體盤進行進一步純化。將整體料用5分鐘線性梯度洗脫至IM NaCl (Wmin)。DNA在0.6M NaCl時洗脫在具有2:1的254/280比率的尖銳峰中，指示非常高的純度。
[0140]實施例5.從干燥的哺乳動物細胞純化DNA。遵循實施例4的形式，但是將在培養(yǎng)皿上以薄層涂片的CHO細胞在通風櫥中干燥過夜，然后在5M胍(pH 5)中勻漿化。結(jié)果與在實施例4中得到的相同。
[0141]實施例6.在帶負電荷的疏水多模式色譜介質(zhì)上的DNA純化。將得自鮭魚精的純化的基因組DNA再懸浮于50H印es、10mM NaCl (pH7.0)中。將樣品穿過0.22微米膜過濾以除去微粒，然后將5mL施加于用Capto MMC(由負電荷、疏水殘基和氫鍵合殘基組成的多模式色譜介質(zhì))填充的20mL柱，該柱平衡至50mM乙酸鹽、10mM NaCl (pH 4.0)。90%的DNA完全分配至空隙體積中并洗脫在乙酸鹽緩沖液中，剩余的DNA在鹽穿過柱以后洗脫。
[0142]實施例7.在帶負電荷的金屬親和多模式色譜介質(zhì)上的DNA純化。將得自鮭魚精的純化的基因組DNA再懸浮于50H印es、10mM NaCl (pH 7.0)中。將樣品穿過0.22微米膜過濾以除去微粒，然后將5mL施加于用Capto MMC (由構(gòu)造成提供金屬親和力的負電荷組成的多模式色譜介質(zhì)(UNOsphere Profinity))填充的20mL柱，平衡至50mM乙酸鹽、10mMNaCl (pH 4.0)。DNA完全分配至空隙體積并洗脫在乙酸鹽緩沖液中。
[0143]鑒于樣品體積相對于柱體積的重要性，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到以不導致樣品在樣品邊界處失控分散的方式施加樣品的重要性，這將具有在樣品可以進入柱中之前非故意地增加樣品體積的作用。借助于被稱作超環(huán)的裝置(其特別地避免在樣品邊界處的分散)，將樣品施加于所有以上實施例。
[0144]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會明白，可以施加樣品來純化其它多核苷酸并具有同樣的成功預期。實例具體地包括RNA。
[0145]本發(fā)明可以與其它純化方法組合以達到較高的純化水平。這樣的其它純化方法的例子包括、但不限于:常用于純化多核苷酸的其它方法諸如超速離心、超濾、密度梯度過濾、親和色譜法、陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法、固定化的金屬親和色譜法和其它混合模式色譜方法；以及沉淀、結(jié)晶和液-液萃取的方法。開發(fā)適合于不同方法的條件并將它們與本文中的發(fā)明結(jié)合以達到特定多核苷酸的必要純化，是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的權(quán)限內(nèi)。
[0146]本文中引用的所有參考文獻都以它們的整體通過引用并入且用于所有目的，達到如同明確地且單獨地指出每篇單獨的出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾埻ㄟ^引用整體并入用于所有目的的相同程度。在通過引用并入的出版物和專利或?qū)＠暾埮c在本說明書中含有的公開內(nèi)容矛盾的情況下，本說明書意圖替代和/或優(yōu)先于任何這樣的矛盾材料。
[0147]在本說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的量、色譜法條件、諸如此類的所有數(shù)字，在所有情況下應理解為由術(shù)語“約”修飾。因此，除非相反說明，否則在說明書和所附的權(quán)利要求書中闡述的數(shù)字參數(shù)是近似值，所述近似值可以隨本發(fā)明尋求得到的期望性能而變化。
[0148]本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，可以做出本發(fā)明的許多修改和變化，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。本文描述的具體實施方案僅僅作為示例而提供，且無意以任何方式進行限制。說明書和實施例意圖僅僅視作示例性的，本發(fā)明的真實范圍和精神由下述權(quán)利要求指定。
【權(quán)利要求】
1.純化包含多核苷酸的樣品的方法，所述方法包括下述步驟:(i)提供填充的色譜柱，其包含帶負電荷的多孔顆粒，(ii)將所述填充的色譜柱平衡至允許所述多核苷酸洗脫的條件，(iii)使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸，使得施加的樣品體積小于或等于所述填充的色譜柱內(nèi)的帶負電荷的多孔顆粒的顆粒間空間，(iv)從所述填充的色譜柱洗脫多核苷酸，其中所述多核苷酸處于更純的狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是基因組DNA、細胞器DNA諸如線粒體DNA或葉綠體DNA、質(zhì)粒DNA、單鏈DNA、雙鏈DNA或另一種形式的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品可以是未純化的，處于中間純度水平，或高度純化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述柱之前已經(jīng)經(jīng)過濃縮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述填充的色譜柱之前已經(jīng)通過超濾進行濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品在施加于所述填充的色譜柱之前已經(jīng)預先在使多核苷酸基本上不結(jié)合一個或多個帶負電荷的表面的條件下暴露于所述表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一個或多個帶負電荷的表面進一步包含第二反應性，所述第二反應性包括參與疏水相互作用、金屬親和相互作用或它們的組合的能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7中的任一項所述的方法，其中所述一個或多個帶負電荷的表面包括膜、整體料、一個纖維或多個纖維、一個顆?；蚨鄠€顆?；蚱浠衔飿?gòu)造。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述填充的色譜柱僅用帶負電荷的多孔顆粒填充，且樣品體積小于所述填充的色譜柱的體積的40 %。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述填充的色譜柱被平衡至在約2至約9范圍內(nèi)的pH。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述填充的色譜柱被平衡至在約0.lmS/cm至約30mS/cm范圍內(nèi)的電導率值。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述填充的色譜柱用具有在選自以下范圍內(nèi)的pH的緩沖液平衡:⑴約2至約8，⑵約4至約7，和(3)約4.5至約6.0。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述填充的色譜柱被平衡至在約0.lmS/cm至約15mS/cm范圍內(nèi)的電導率值。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中為了在包含多核苷酸的洗脫液上進行后續(xù)純化步驟中使用，所述填充的色譜柱被平衡至處于或接近樣品施加條件的條件。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸的樣品施加條件包括在約2至約10范圍內(nèi)的pH。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸的樣品電導率值包括從非零電導率直到與特定鹽或鹽組合的飽和溶液對應的電導率的范圍。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中平衡所述填充的色譜柱的步驟包括:向所述填充的色譜柱施加具有在約4至約9的范圍內(nèi)的pH的平衡緩沖液。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述平衡緩沖液的電導率值包括約0.lmS/cm至約30mS/cm的范圍。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述帶負電荷的多孔顆粒包括陽離子交換顆粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中由選自羧基、磺基或磷?；幕鶊F部分地將電負性賦予所述帶負電荷的多孔顆粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中除了所述帶負電荷的多孔顆粒以外，所述填充的色譜柱還包含其它顆粒。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或21所述的方法，其中所述帶負電荷的多孔顆粒、所述其它顆粒中的至少一種或二者具有一個或多個選自以下的第二化學官能團:陰離子交換、疏水相互作用、氫鍵合、π-π相互作用和金屬螯合作用。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括:在使所述樣品與所述填充的色譜柱接觸的步驟之前，使所述樣品與一種或多種污染物解離劑接觸的額外步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在使所述樣品與所述柱接觸的步驟之前，所述污染物解離劑選自:鹽、非離子有機聚合物、有機溶劑、表面活性劑和離液劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24中的任一項所述的方法，其中所述污染物解離劑是選自聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁 二醇的非離子有機聚合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述非離子有機聚合物具有在約130D至約1000D的范圍內(nèi)的平均分子量。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26中的任一項所述的方法，其中所述污染物解離劑是選自乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亞砜、乙醇和苯氧乙醇的有機溶劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27中的任一項所述的方法，其中以在約0.01%至約25%重量/體積范圍內(nèi)的濃度提供所述污染物解離劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28中的任一項所述的方法，其中所述污染物解離劑是選自吐溫、Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷的表面活性劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中以在約0.001%至約I %重量/體積的范圍內(nèi)的濃度提供所述表面活性劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30中的任一項所述的方法，其中以在約0.001%至約0.1%重量/體積的范圍內(nèi)的濃度提供所述表面活性劑。
32.試劑盒，其提供用于方便地實施權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法。
【文檔編號】B01D15/14GK104470606SQ201380038185
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】彼得·加尼翁 申請人:新加坡科技研究局