針對(duì)高度保守靶標(biāo)的包含來自駱駝科之序列的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗原結(jié)合多肽,并且特別是來源于駱駝科物種的常規(guī)抗體,所述抗體與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是自身抗原或者高度保守抗原。本發(fā)明還涉及抗獨(dú)特型抗原結(jié)合肽,其與包含獲得自駱駝科物種的抗體之可變區(qū)的靶抗原結(jié)合。
【專利說明】針對(duì)高度保守靶標(biāo)的包含來自駱駝科之序列的抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗原結(jié)合多肽,并且特別是來源于駱駝科(camelid)物種的常規(guī)抗 體,所述抗體與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是自身抗原或高度保守抗原。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體作為研究工具具有許多應(yīng)用,并且越來越多地作為治療或診斷劑。特 別地,治療性抗體的開發(fā)是醫(yī)藥行業(yè)中增長最快的領(lǐng)域之一。產(chǎn)生針對(duì)給定治療靶標(biāo)的高 質(zhì)量單克隆抗體是在治療性抗體藥物的開發(fā)中成功的關(guān)鍵。迄今為止,已經(jīng)開發(fā)了許多可 以生產(chǎn)針對(duì)治療目的之靶抗原的單克隆抗體(包括全人或"人源化"抗體)的不同技術(shù)平 臺(tái)。這些技術(shù)平臺(tái)可大致分為體內(nèi)的方法(基于使用經(jīng)免疫的動(dòng)物),以及體外的方法,其 中抗體序列是使用技術(shù)(例如噬菌體展示)從抗體可變鏈cDNA文庫中選擇的。
[0003] 盡管均可使用用于單克隆抗體開發(fā)的體內(nèi)和體外平臺(tái),但是生產(chǎn)與跨物種"高度 保守的"抗原特異性結(jié)合的抗體和生產(chǎn)針對(duì)"自身"抗原的抗體仍是特別困難的。Zhuo等, PLoS 0NE,第4卷,第6期,2009年6月討論了由于免疫耐受性,在針對(duì)小鼠自身抗原或者在 小鼠與人類之間高度保守抗原的抗體生產(chǎn)中使用基于免疫動(dòng)物(特別是小鼠)的常規(guī)單克 隆抗體方法所出現(xiàn)的特別困難之處。
[0004] 為克服與自身抗原或高度保守抗原相關(guān)之免疫耐受性的之前的嘗試已經(jīng)包括使 用特異性敲除小鼠或者使用具有受損的免疫耐受性的小鼠品系。然而,存在與這些方法中 的每個(gè)相關(guān)的缺點(diǎn);產(chǎn)生對(duì)于每個(gè)保守的目的抗原的敲除小鼠是昂貴且耗時(shí)的,而通過免 疫具有受損耐受性的小鼠產(chǎn)生的抗體可能是質(zhì)量可變的,即可表現(xiàn)出低親和力和/或?qū)Π?抗原的低特異性。
[0005] 在別處已經(jīng)報(bào)道了可以從非免疫人噬菌體展示文庫分離針對(duì)人抗原的人抗體 (Griffiths等EMBO J?第12卷.,725-734,1993)。這種方法的潛在缺點(diǎn)是,合成的噬菌體 展示文庫只是接近天然存在于人類種系的功能多樣性,因而多樣性是比較有限的。此外,使 用非免疫文庫產(chǎn)生的抗體不是來源于通過主動(dòng)免疫體內(nèi)選擇的⑶R,因而通常必須進(jìn)行親 和力成熟(affinity maturation)以提高對(duì)祀抗原的親和力。親和力成熟是一個(gè)冗長的過 程,其可能會(huì)大大增加抗體發(fā)現(xiàn)過程的時(shí)間。此外,在親和力成熟過程中,可能會(huì)改變某些 氨基酸殘基,這可能對(duì)所得的抗體的結(jié)合特異性或可制造性(例如表達(dá)水平、溶解性、物理 化學(xué)穩(wěn)定性等)產(chǎn)生負(fù)面影響(Wu等,J. Mol. Biol. 368 :652-65 (2007))。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 開發(fā)用于產(chǎn)生針對(duì)高度保守靶抗原的抗體之技術(shù)上簡單的平臺(tái)仍是本領(lǐng)域中的 一個(gè)目標(biāo),其不受現(xiàn)有技術(shù)方法所遇到的問題(例如,低親和力、低特異性、多樣性差)困 擾。特別地,期望開發(fā)用于產(chǎn)生針對(duì)高度保守靶抗原之抗體的平臺(tái),其基于通過主動(dòng)免疫體 內(nèi)選擇CDR,因而避免了對(duì)親和力成熟的需求和與所得抗體的"可制造性"相關(guān)的問題。
[0007] 現(xiàn)在已經(jīng)觀察到可通過駱駝科(Camelidae)物種的主動(dòng)免疫產(chǎn)生針對(duì)自身抗原 和高度保守靶抗原的高親和力免疫特異性抗體。即便使用展示出與最近的駱駝科同源物具 有高于90%,并且高達(dá)97%氨基酸序列同一性的人多肽,通過動(dòng)物的簡單免疫可產(chǎn)生高特 異性、高親和力的抗體,而無需產(chǎn)生敲除或以其他方式操作動(dòng)物的遺傳背景或其天然免疫 功能。通過駱駝科動(dòng)物的簡單免疫來打破自身耐受性屏障的能力是非常出乎意料的,并且 提高了產(chǎn)生有用的抗體的機(jī)會(huì),所述有用抗體包括具有潛在治療效用的針對(duì)一系列高度保 守靶標(biāo)的抗體,之前認(rèn)為這是超越已知的單克隆抗體平臺(tái)的范圍的。
[0008] 因此,在第一個(gè)方面,本發(fā)明提供了包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域之分離的抗原結(jié)合 多肽,其中在所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)獲 得自駱駝科物種的VH或VL結(jié)構(gòu)域,其特征在于,所述抗原結(jié)合多肽與靶抗原特異性結(jié)合, 所述靶抗原是在包括至少所述抗原結(jié)合多肽之表位的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱 駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %氨基酸序列同一性的 多肽抗原。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是在包括包含抗原結(jié)合多肽之表位的靶抗原的至少一 個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%,或者至少 95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是在全長的靶抗原表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質(zhì)具有至少90%,或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0011] 靶抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比較物蛋白質(zhì)中存在的表位具有基本上 相同結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)表位。在線性表位的情況下,形成所述表位的氨基酸序列在靶抗原與 比較物駱駝科動(dòng)物蛋白質(zhì)之間可以是100 %保守的。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原可以是高度保守抗原,其中所述高度保守抗原是來自 所述駱駝科物種之外的物種的多肽,其在包括至少抗原結(jié)合多肽之表位的序列比較窗口 表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質(zhì)具有至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或 98 %的氨基酸序列同一性。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中,高度保守抗原是在包括包含抗原結(jié)合多肽之表位的靶抗原 的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質(zhì)具有至少 90%,或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是在全長的靶抗原表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同 源蛋白質(zhì)具有至少90%,或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的高度保守 抗原。
[0015]在每一個(gè)前述實(shí)施方案中,所述高度保守抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比 較物蛋白質(zhì)中存在的表位具有基本上相同結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)表位。
[0016]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,高度保守抗原可以是來自所述駱駝科物種之外的物種 的多肽,其在如上所定義的序列比較窗口或全長的靶抗原表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的 同源蛋白質(zhì)具有至少95%、96%、97%、98%或者甚至至少99%的氨基酸序列同一性。
[0017]在一些特定的實(shí)施方案中,高度保守抗原可以來自選自以下之物種的多肽:人、非 人靈長類動(dòng)物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、?;螂u。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,所 述高度保守抗原是人多肽。
[0018]在一些特定的實(shí)施方案中,所述駱駝科物種選自駱駝(camel)、大羊駝(llama)、 單峰騎(dromedary)、胳馬(vicufia )、原騎(guanaco)和羊騎(alpaca)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中,所述胳騎科物種是大羊騎(Lama glama)。
[0019] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,高度保守抗原是人多肽并且所述駱駝科物種是大 羊駝。在該實(shí)施方案中,所述高度保守抗原(即,人多肽)在如上所定義的序列比較窗口可 表現(xiàn)出與同源的大羊駝蛋白質(zhì)具有至少90%,或者至少95%、96%、97%、98%,或者甚至 至少99 %的氨基酸序列同一性。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原可以是來自駱駝科物種的自身抗原或者駱駝科動(dòng)物 來源的抗原,其是在包括至少抗原結(jié)合多肽之表位的序列比較窗口表現(xiàn)出與駱駝科自身抗 原具有至少90%,或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是駱駝科動(dòng)物來源的抗原,其在包括包含抗原結(jié)合多 肽之表位的靶抗原的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比較窗口表現(xiàn)出與駱駝科動(dòng)物自身抗原具有 至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的氨基酸序列同一性。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是駱駝科動(dòng)物來源的抗原,其在全長的靶抗原表現(xiàn)出 與駱駝科動(dòng)物自身抗原具有至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的氨基酸序列同 一性。
[0023] 所述駱駝科動(dòng)物來源的抗原可保留其所來源的駱駝科動(dòng)物自身抗原的表位,或者 其可包含與在該自身抗原中存在的表位具有基本上相同結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)表位。
[0024] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,靶抗原是從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區(qū)或者 表現(xiàn)出與其至少90%氨基酸序列同一性的序列變體。在一些特定的實(shí)施方案中,序列變 體可表現(xiàn)出與從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區(qū)具有至少95%、96%、97%、98%或 99%的氨基酸序列同一性。在駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的情況下,用于對(duì)變體與從所述駱駝科 物種獲得之抗體的可變區(qū)進(jìn)行序列比較的比較窗口可包括全長的VH結(jié)構(gòu)域和全長的VL結(jié) 構(gòu)域。在包含VHH結(jié)構(gòu)域的駱駝科動(dòng)物之只有重鏈的抗體的情況下,序列比較窗口可以是 全長的VHH結(jié)構(gòu)域。序列變體可保留其所來源的駱駝科動(dòng)物抗體可變結(jié)構(gòu)域的表位(或獨(dú) 特型)。
[0025] 在第二個(gè)方面,本發(fā)明提供了用于制備與靶抗原特異性結(jié)合的重組抗原結(jié)合多肽 的方法,所述抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中在所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL 結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)獲得自駱駝科物種,所述方法包括以下步 驟:
[0026] (a)免疫駱駝科物種,由此產(chǎn)生針對(duì)所述靶抗原的常規(guī)抗體;
[0027] (b)分離編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)的駱駝科常規(guī)抗體之VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的 至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的駱駝科核酸;
[0028] (c)制備包含編碼如下高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)之核苷酸序列的多核苷酸,所述高變 環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)具有與由步驟(a)分離的核酸編碼的高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)一致的氨基酸 序列,所述多核苷酸編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)(或特異性結(jié)合)的包含VH結(jié)構(gòu)域和VL 結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽;以及
[0029] (d)由步驟(c)的重組多核苷酸表達(dá)所述抗原結(jié)合多肽,其中所述抗原結(jié)合多肽 是與所述部分(b)的駱駝科常規(guī)抗體不一致的,其特征在于所述靶抗原是在包括至少抗原 結(jié)合多肽之表位的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%或 者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是在包括包含抗原結(jié)合多肽之表位的靶抗原的至少一 個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%或者至少 95 %氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中,靶抗原是在全長的靶抗原表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質(zhì)具有至少90%或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0032] 在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,步驟(a)中產(chǎn)生的抗體所針對(duì)的靶抗原是高度 保守抗原,其中所述高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽,所述多肽在 如上所定義的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質(zhì)具有至少90 %或 者至少95 %、96 %、97 %或98 %的氨基酸序列同一性。
[0033] 在所述方法的另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,高度保守抗原可以是來自所述駱駝科物 種之外的物種的多肽,所述多肽在如上所定義的序列比較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物 種的同源蛋白質(zhì)具有至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的氨基酸序列同一性。
[0034] 在一些特定的實(shí)施方案中,所述高度保守抗原可以是來自選自以下物種的多肽: 人、非人靈長類動(dòng)物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、?;螂u。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案 中,所述高度保守抗原是人多肽。
[0035] 在一些特定的實(shí)施方案中,與靶抗原發(fā)生免疫的駱駝科物種是選自:駱駝、大羊 駝、單峰駝、駱馬、原駝和羊駝。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述駱駝科物種是大羊駝。
[0036] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,高度保守抗原是人多肽并且與所述高度保守抗原 發(fā)生免疫的駱駝科物種是大羊駝。在該實(shí)施方案中,所述高度保守抗原(即,人多肽)在 如上所定義的序列比較窗口將可表現(xiàn)出與同源的大羊駝蛋白質(zhì)具有至少90%,或者至少 95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
[0037] 在一個(gè)特定的、非限制性實(shí)施方案中,靶抗原可以是從所述駱駝科物種獲得之抗 體的可變區(qū)或者在如上所定義的序列比較窗口表現(xiàn)出具有與其至少90%氨基酸序列同一 性的序列變體。在一些特定的實(shí)施方案中,序列變體在如上所定義的序列比較窗口可表現(xiàn) 出具有與從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區(qū)至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的氨 基酸序列同一'丨生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038] 圖1說明由HMGB1和HMGB2 ELISA所確定之純化的大羊駝來源的Fab的結(jié)合特性。
[0039] 圖2說明通過ELISA所測(cè)量的由大羊駝來源的Fab 2A1抑制HMGB1/RAGE相互作 用。
[0040] 圖3說明通過ELISA評(píng)估大羊駝IgG形式的抗獨(dú)特型抗體11E1 (lallEl)與一組 抗體的結(jié)合譜(profile)。
[0041] 圖4證明了大羊騎IgG形式的抗獨(dú)特型抗體11E1 (lallEl)在食蟹猴(cynomolgus monkey)血楽背景中檢測(cè)祀抗體68F2和129D3的能力。
[0042] 圖5示出通過ELISA所測(cè)量的與61H7 (mAb)結(jié)合之7C6 (Fab)的Log (劑量)-響 應(yīng)曲線,其中將在620nm處的吸收對(duì)7C6 Fab的濃度對(duì)數(shù)作圖,使得能夠計(jì)算EC50。
[0043]圖6說明通過ELISA所測(cè)量的抗獨(dú)特型mAb與41D12(Fab)的結(jié)合。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明已經(jīng)從出乎意料的觀察結(jié)果得出可通過駱駝科物種的主動(dòng)免疫產(chǎn)生針對(duì) 高度保守靶抗原并且甚至是自身抗原的高親和力、高特異性抗體。因此,在本發(fā)明最廣泛的 方面,其提供了駱駝科動(dòng)物來源的抗原結(jié)合多肽(即,包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié) 合多肽,其中在所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 獲得自駱駝科物種),其特征在于與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原高度類似于駱駝科動(dòng)物 自身抗原的序列和/或結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了駱駝科動(dòng)物來源的抗原結(jié)合多肽,其與駱駝 科動(dòng)物自身抗原特異性結(jié)合。
[0045] 在本 申請(qǐng)人:自己早些時(shí)候的公開W0 2010/001251和W0 2011/080350中描述了 駱駝科動(dòng)物來源的常規(guī)抗體的一般特征,所述申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。駱 駝科動(dòng)物來源的常規(guī)抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(如區(qū)別于駱駝科動(dòng)物只有重鏈的抗 體)的特征在于其與人抗體之間特別高的同源性,無論是在重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之框架 區(qū)中的一級(jí)氨基酸序列水平上,還是在有助于抗原結(jié)合位點(diǎn)之CDR的三維構(gòu)象上(在W0 2010/001251中廣泛的詳細(xì)討論)。此外,駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的可變結(jié)構(gòu)域可通過"種系 化(germlining) "的簡單方法變得更加人樣化,其中框架區(qū)中選定的少量氨基酸被來自人 種系的同源氨基酸所替換(在W02011/080350中廣泛討論)。
[0046] 現(xiàn)在已經(jīng)觀察到可產(chǎn)生針對(duì)一組靶抗原的高親和力高特異性駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗 體,之前認(rèn)為使用已知的抗體開發(fā)技術(shù),特別是使用依賴于對(duì)宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫的抗體平 臺(tái)是很難靶向所述靶抗原的。這些"難以靶向"抗原的特征在于其與靶抗體將在其中產(chǎn)生 的系統(tǒng)中(例如,宿主駱駝科動(dòng)物)天然表達(dá)的抗原有非常接近的序列和/或類似結(jié)構(gòu), 并且包括自身抗原以及多肽抗原兩者,所述自身抗原來自于抗體將在其中產(chǎn)生的駱駝科物 種,所述多肽抗原表現(xiàn)出與來自抗體將在其中產(chǎn)生的同一駱駝科物種之最接近匹配的駱駝 科動(dòng)物多肽具有至少90%的氨基酸序列相似性。本文提供的抗原結(jié)合多肽不僅表現(xiàn)出對(duì) "難以靶向"抗原的高親和力特異性結(jié)合,而且保留駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的特別優(yōu)點(diǎn),即,與 人抗體的可變結(jié)構(gòu)域之非常高的序列同源性和結(jié)構(gòu)同源性。
[0047]
[0048] 術(shù)語"抗原結(jié)合多肽"是指包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的任何多肽,其與靶抗原免 疫反應(yīng)(對(duì)靶抗原表現(xiàn)出特異性結(jié)合)。如本文別處所討論的,示例性的抗原結(jié)合多肽包括 抗體和免疫球蛋白,還包括抗體片段。
[0049] 術(shù)語"靶抗原"是指抗原結(jié)合多肽針對(duì)其免疫反應(yīng)的抗原。
[0050] 術(shù)語"靶抗原"或"抗原物質(zhì)"還可用來描述在制備與目的靶抗原反應(yīng)的抗原結(jié)合 多肽期間用來免疫動(dòng)物(例如駱駝科動(dòng)物)的材料。在本文的上下文中,術(shù)語"靶抗原"可 涵蓋抗原的經(jīng)純化形式,并且還可以是抗原的未處理的或半純化制劑(例如細(xì)胞、細(xì)胞裂 解物或上清液、細(xì)胞級(jí)分(例如細(xì)胞膜)等),以及與適當(dāng)載體蛋白綴合的半抗原,或者靶抗 原的截短形式(例如含有免疫原性表位的片段),或者甚至是能夠編碼靶抗原的多核苷酸, 因?yàn)閷⒂糜?DNA免疫"。用于主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物的"靶抗原"或"抗原物質(zhì)"的另一些特 征在本文別處進(jìn)行描述,并且將是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的。
[0051] 抗原結(jié)合多肽與靶抗原之間的"特異性結(jié)合"是指免疫特異性。如果抗原結(jié)合多肽 優(yōu)先于其它表位與靶抗原上的表位結(jié)合,則所述抗原結(jié)合多肽與其靶抗原"特異性"結(jié)合。 "特異性結(jié)合"并不排除與其它具有類似抗原表位的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0052] "抗體"(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)是糖蛋白,其表現(xiàn)出與(靶)抗原的特異性結(jié) 合。
[0053] 已知駱駝科動(dòng)物物種具有兩種不同類型的抗體;經(jīng)典的或"常規(guī)"的抗體以及重鏈 抗體。
[0054] 如本文所使用的,術(shù)語"常規(guī)抗體"是指任何同種型的抗體,包括IgA、IgG、IgD、IgE 或IgM。自然的或天然存在的"常規(guī)"駱駝科動(dòng)物抗體通常是異四聚體糖蛋白,由兩條相同 的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連,而二 硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈 內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端(N端)具有可變結(jié)構(gòu)域(VH),其后是若干恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕 鏈在一端(N端)具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)而在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域(CL);輕鏈的恒定結(jié) 構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R(align),且輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?齊。認(rèn)為特定氨基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。
[0055] 術(shù)語"重鏈抗體"是指已知在駱駝科動(dòng)物物種中天然存在的第二種類型的抗體,這 樣的抗體天然缺失輕鏈(Hamers-Casterman等,Nature. 1993 ;363 ;446_8)。重鏈抗體(縮 寫為HCAb)由共價(jià)二硫鍵連接的兩條重鏈構(gòu)成。HCAb中每條重鏈的一端具有可變結(jié)構(gòu)域。 為了將其與"常規(guī)"駱駝科動(dòng)物抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域(VH)區(qū)分開,HCAb的可變結(jié)構(gòu)域被 稱為"VHH"。VHH結(jié)構(gòu)域與VH結(jié)構(gòu)域完全不同,其由駱駝科動(dòng)物基因組中的不同基因區(qū)段 編碼。
[0056] 本發(fā)明多肽的VL結(jié)構(gòu)域可以是VX型或Vk型。因此,術(shù)語"VL結(jié)構(gòu)域"是指來 自駱駝科的Vk和兩種同種型以及由其改造的變體(相對(duì)于駱駝科的VL結(jié)構(gòu)域來說, 所述變體包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、插入或者缺失)。
[0057] 術(shù)語"VH結(jié)構(gòu)域"是指駱駝科任何已知的重鏈同種型的VH結(jié)構(gòu)域,包括Y、e、 8、a或y同種型以及其改造的變體(相對(duì)于駱駝科的VH結(jié)構(gòu)域來說,所述變體包含一 個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換、插入或者缺失)。術(shù)語"VH結(jié)構(gòu)域"僅指駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的 VH結(jié)構(gòu)域,而玉涵蓋駱駝科動(dòng)物的VHH結(jié)構(gòu)域。
[0058] 術(shù)語"可變"是指可變結(jié)構(gòu)域VH和VL的某些部分的序列在抗體之間差異很大的事 實(shí),并且用于每個(gè)特定抗體針對(duì)其靶抗原的結(jié)合及特異性。然而,可變性在抗體的可變結(jié)構(gòu) 域中并非均勻分布。其集中于每個(gè)VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域中被稱為"高變環(huán)(hypervariable loop)"的三個(gè)區(qū)段中,其形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分。V A輕鏈結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第 三高變環(huán)在本文中被稱為LIU)、L2U)和L3U),并且可定義為包含VL結(jié)構(gòu)域中的 24位至33位(L1(A),由9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)氨基酸殘基組成)、49位至53位(L2(入), 由3個(gè)殘基組成)和90位至96位(L3 ( X ),由5個(gè)殘基組成)殘基(Morea等,Methods 20:267-279(2000))。Vk輕鏈結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第三高變環(huán)在本文中被稱為L1(k)、 L2 (k)和L3 (k),并且可定義為包含VL結(jié)構(gòu)域中的25位至33位(LI (k),由6個(gè)、7個(gè)、8 個(gè)、11個(gè)、12個(gè)或13個(gè)殘基組成)、49位至53位(L2 (k),由3個(gè)殘基組成)和90位至97 位(L3(k),由 6個(gè)殘基組成)殘基(Morea等,Methods 20 :267-279(2000))。VH結(jié)構(gòu)域的 第一、第二和第三高變環(huán)在本文中被稱為H1、H2和H3,并且可定義為包含VH結(jié)構(gòu)域中的25 位至33位(H1,由7個(gè)、8個(gè)或9個(gè)殘基組成)、52位至56位(H2,由3個(gè)或4個(gè)殘基組成) 和91位至105位(H3,其長度高度可變)殘基(Morea等,Methods 20 :267-279 (2000))。
[0059] 除非另有說明,否則術(shù)語L1、L2和L3分別是指VL結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第三高變 環(huán),并且涵蓋獲得自駱駝科的Vk和同種型的高變環(huán)。術(shù)語H1、H2和H3分別是指VH 結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第三高變環(huán),并且涵蓋獲得的自駱駝科的任何已知重鏈同種型(包 括Y、e、S、a或y )的高變環(huán)。
[0060] 高變環(huán)LI、L2、L3、HI、H2和H3可以各自包括"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"的一部分。 術(shù)語"高變環(huán)"和"互補(bǔ)決定區(qū)"不是嚴(yán)格意義的同義詞,因?yàn)楦咦儹h(huán)(HV)是基于結(jié)構(gòu)定 義的,而互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)是基于序列可變性定義的(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD.,1983),并且HV和CDR的界限在一些VH和VL結(jié)構(gòu)域中可以不同。
[0061]VL和VH結(jié)構(gòu)域的⑶R通常定義為包含以下氨基酸:輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的24位至 34位(CDRL1)、50位至56位(CDRL2)和89位至97位(CDRL3)殘基,以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域 中的31位至35位或31-35b位(CDRH1)、50位至65位(CDRH2)和95位至102位(CDRH3) 殘基;Kabat 等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991)。因此,HV 可以 包含在相應(yīng)的CDR中,并且本文中提及的VH和VL結(jié)構(gòu)域的"高變環(huán)"也應(yīng)解釋為涵蓋相應(yīng) 的CDR,反之亦然,除非另有說明。
[0062] 可變結(jié)構(gòu)域的保守性較高的部分稱為框架區(qū)(framework region, FR)。天然重鏈 和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個(gè)FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4),主要是采取0片層構(gòu) 型,通過三個(gè)高變環(huán)相連接。每條鏈中的高變環(huán)通過FR而緊密地合在一起,并與其它鏈中 的高變環(huán)一起促進(jìn)抗體之抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)分析揭示了序列與通過互補(bǔ) 決定區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)形狀之間的關(guān)系(Chothia等,J.Mol.Biol.227:799-817(1992)); Tramontane)等,J. Mol. Biol,215 :175-182 (1990))。盡管它們具有高序列可變性,但六個(gè) 環(huán)中有五個(gè)只采取了主鏈構(gòu)象的一小部分庫(repertoire),稱為"規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonical structure) "。這些構(gòu)象首先取決于環(huán)的長度,其次取決于環(huán)和框架區(qū)中某些位點(diǎn)關(guān)鍵殘基 的存在(通過其包裝、氫鍵或呈現(xiàn)不尋常主鏈構(gòu)象的能力來確定構(gòu)象)。
[0063] 恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但表現(xiàn)出多種效應(yīng)功能,例如抗體參 與抗體依賴的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity,ADCC)或補(bǔ)體依賴的細(xì) 胞毒性(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 〇
[0064] 在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案中,駱駝科(或駱駝科動(dòng)物)物種(從其獲得本 發(fā)明抗原結(jié)合多肽的高變環(huán)或CDR)可以是駱駝、大羊駝、單峰駝、駱馬、原駝或羊駝,以及 其任何的雜交物種。大羊騎(Lama glama)和羊騎(Lama pacos)是本發(fā)明所有方面優(yōu)選的 駱駝科物種。
[0065] 如果抗原結(jié)合多肽包含獲得自駱駝科物種的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)高 變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū),則認(rèn)為其是"駱駝科動(dòng)物來源的"。為了避免疑問,術(shù)語"VH結(jié)構(gòu)域"、 "VL結(jié)構(gòu)域"是指來源于駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的結(jié)構(gòu)域。該定義排除了駱駝科動(dòng)物只有重 鏈的VHH抗體以及僅包含駱駝科動(dòng)物VHH結(jié)構(gòu)域之HV或CDR的重組構(gòu)建體,其玉涵蓋在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0066] 所謂"獲得自駱駝科物種的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)"意指 高變環(huán)(HV)或CDR具有的氨基酸序列與由駱駝科免疫球蛋白基因編碼的高變環(huán)或CDR的 氨基酸序列一致或基本一致。在本文的上下文中,"免疫球蛋白基因"包括種系基因、已經(jīng) 歷重排的免疫球蛋白基因以及體細(xì)胞突變基因。因此,獲得自駱駝科物種VH或VL結(jié)構(gòu)域 的HV或CDR的氨基酸序列可以與存在于成熟的駱駝科常規(guī)抗體中的HV或CDR的氨基酸序 列一致。本文上下文中的術(shù)語"獲得自"表明了結(jié)構(gòu)關(guān)系,意思是本發(fā)明抗原結(jié)合多肽的HV 或CDR包含最初由駱駝科免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列(或其略微發(fā)生改變的變體)。 然而,對(duì)于用于制備本發(fā)明抗原結(jié)合多肽的生產(chǎn)方法而言,其并不一定意味著特定的關(guān)系。 正如下面將要討論的,有若干方法可用來制備包含HV或CDR(其氨基酸序列與最初由駱駝 科免疫球蛋白基因編碼的序列一致(或基本上一致))的抗原結(jié)合多肽。
[0067] 術(shù)語"駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的VH結(jié)構(gòu)域"和"獲得自駱駝科物種的VH結(jié)構(gòu)域"可 同義使用,并且涵蓋這樣的VH結(jié)構(gòu)域,其為合成的或經(jīng)改造之重組基因(包括密碼子優(yōu)化 的合成基因)的產(chǎn)物,該VH結(jié)構(gòu)域具有的氨基酸序列與駱駝科免疫球蛋白基因(種系的、 重排的或體細(xì)胞突變的)編碼之VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一致(或基本一致)。類似地,術(shù) 語"駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的VL結(jié)構(gòu)域"和"獲得自駱駝科物種的VL結(jié)構(gòu)域"可同義使用,并 且涵蓋這樣的VL結(jié)構(gòu)域,其為合成的或經(jīng)改造之重組基因(包括密碼子優(yōu)化的合成基因) 的產(chǎn)物,該VL結(jié)構(gòu)域具有的氨基酸序列與駱駝科免疫球蛋白基因(種系的、重排的或體細(xì) 胞突變的)編碼之VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一致(或基本一致)。
[0068] 本文提供的抗原結(jié)合多肽通常是重組表達(dá)的多肽,并且可以是嵌合多肽。術(shù)語"嵌 合多肽"是指通過將不連續(xù)存在的兩個(gè)或更多個(gè)肽片段相鄰而產(chǎn)生的人工(非天然存在) 多肽。此定義中包括"物種"嵌合多肽,其通過將兩個(gè)或更多個(gè)物種(例如駱駝科動(dòng)物和人) 編碼的肽片段相鄰而產(chǎn)生。
[0069] 本文提供的抗原結(jié)合不是天然存在的人抗體(特別是人類自身抗體),因?yàn)樾枰?來自于駱駝科動(dòng)物的至少一個(gè)高變環(huán)(或CDR)。所謂"天然存在的"人抗體意指在人對(duì)象內(nèi) 天然表達(dá)的抗體。本發(fā)明的范圍排除具有與天然存在人抗體或其片段的氨基酸序列100% 一致的氨基酸序列的抗原結(jié)合多肽,其中天然抗體或片段不是嵌合的,并且在氨基酸序列 中也沒有受到任何經(jīng)改造的變化(排除體細(xì)胞突變)。
[0070] 本文提供的抗原結(jié)合多肽包含重鏈可變(VH)結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域二 者,并且特征在于在VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)獲得自駱駝 科物種。
[0071] 在一些替代的實(shí)施方案中,VH結(jié)構(gòu)域中的H1或H2或者H1和H2二者均可以獲得 自駱駝科物種,并且獨(dú)立地,VL結(jié)構(gòu)域中的L1或L2或者L1和L2二者均可以獲得自駱駝 科物種。在另一些實(shí)施方案中,VH結(jié)構(gòu)域中的H3或VL結(jié)構(gòu)域中的L3也可以獲得自駱駝 科物種。上述所有可能的排列都是允許的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié) 構(gòu)域兩者中的每個(gè)高變環(huán)HI、H2、H3、LI、L2和L3都可以獲得自駱駝科物種。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方案中,整個(gè)VH結(jié)構(gòu)域和/或整個(gè)VL結(jié)構(gòu)域可以獲得自駱駝科物種。 然后,可以對(duì)駱駝科的VH結(jié)構(gòu)域和/或駱駝科的VL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行蛋白質(zhì)改造,其中向駱駝科 序列中引入一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、插入或者缺失。這些經(jīng)改造的變化優(yōu)選地包括相對(duì) 于駱駝科序列而言的氨基酸替換。這樣的變化包括"人源化"或"種系化",其中駱駝科動(dòng)物 編碼的VH或VL結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基被來自于同源的人編碼的VH或VL結(jié) 構(gòu)域中的等效殘基所取代。
[0073] 在某些實(shí)施方案中,駱駝科的高變環(huán)(或CDR)可以通過使用與期望的目的"靶抗 原"反應(yīng)能夠誘發(fā)抗體的抗原物質(zhì)對(duì)駱駝科物種進(jìn)行主動(dòng)免疫而獲得。如本文詳細(xì)討論和 舉例的,使用能夠與靶抗原免疫反應(yīng)誘發(fā)抗體的抗原物質(zhì)來免疫駱駝科(天然動(dòng)物或者經(jīng) 改造的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以表達(dá)駱駝科動(dòng)物物種免疫球蛋白庫)之后,可以鑒定由B細(xì)胞產(chǎn)生的 對(duì)期望抗原具有特異性的(常規(guī)駱駝科)抗體,并且可以使用已知的技術(shù)來分離編碼這樣 的抗體之VH和VL結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。
[0074] 因此,在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了與靶抗原免疫反應(yīng)的重組抗原結(jié) 合多肽,所述多肽包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高 變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)獲得自駱駝科物種的VH或VL結(jié)構(gòu)域,并且特征在于所述抗原結(jié)合多肽 與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是在包括至少抗原結(jié)合多肽之表位的序列比較窗口表現(xiàn) 出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原,所述抗原 結(jié)合多肽通過包括以下步驟的方法獲得:
[0075] (a)免疫駱駝科物種并且由此產(chǎn)生針對(duì)所述靶抗原的抗體;
[0076] (b)確定核苷酸序列,所述核苷酸序列編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)的駱駝科常規(guī) 抗體之VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);以及
[0077] (c)表達(dá)與所述靶抗原免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合多肽,所述抗原結(jié)合多肽包含VH和VL 結(jié)構(gòu)域,其中VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)具有由部分(a) 所確定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0078] 分離的通過主動(dòng)免疫獲得的駱駝科VH和VL結(jié)構(gòu)域可以用作改造根據(jù)本發(fā)明的 抗原結(jié)合多肽的基礎(chǔ)。從完整的駱駝科VH和VL結(jié)構(gòu)域開始,可以進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)氨基 酸替換、插入或者缺失的改造,從而與開始的駱駝科序列不同。在某些實(shí)施方案中,這樣的 替換、插入或缺失可存在于VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)。在一級(jí)氨基酸序列中進(jìn) 行這些變化的目的可以是為了減少推測(cè)的不利性質(zhì)(例如在人宿主中的免疫原性(所謂的 人源化)、為了減少使?jié)撛诋a(chǎn)物具有異質(zhì)性和/或不穩(wěn)定性的位點(diǎn)(糖基化、脫酰胺、異構(gòu) 化等)或是為了提高分子的一些其它有利性質(zhì)(例如溶解性、穩(wěn)定性、生物利用率等)。在 另一些實(shí)施方案中,在一級(jí)氨基酸序列中的變化可以在通過主動(dòng)免疫獲得的駱駝科VH和/ 或VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或更多個(gè)高變環(huán)(或CDR)中進(jìn)行改造??梢砸脒@樣的變化從而提高 抗原結(jié)合的親和力和/或特異性,或者減少推測(cè)的不利性質(zhì)(例如在人宿主中的免疫原性 (所謂的人源化或種系化)、減少使?jié)撛诋a(chǎn)物具有異質(zhì)性和/或不穩(wěn)定性的位點(diǎn)(糖基化、 脫酰胺、異構(gòu)化、移除含硫氨基酸例如甲硫氨酸等),或是為了提高分子的一些其它有利性 質(zhì)(例如溶解性、穩(wěn)定性、生物利用率、可制造性等)。
[0079] 因此,在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了重組的抗原結(jié)合多肽,相比于通過用靶抗 原對(duì)駱駝科物種進(jìn)行主動(dòng)免疫所獲得的駱駝科VH或VL結(jié)構(gòu)域,其在VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu) 域的至少一個(gè)框架區(qū)或⑶RR中包含至少一個(gè)氨基酸替換,特征在于所沭抗原結(jié)合多肽與 靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨 基酸序列同一性的多肽抗原。該特定的實(shí)施方案排除了通過主動(dòng)免疫產(chǎn)生的含有天然駱駝 科VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽。
[0080] 在另一些實(shí)施方案中,本發(fā)明涵蓋"嵌合"抗體分子,其包含來自駱駝科的VH和VL 結(jié)構(gòu)域(或其經(jīng)改造的變體)以及來自非駱駝科動(dòng)物抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域,例 如人編碼的恒定結(jié)構(gòu)域(或其經(jīng)改造的變體)。在這樣的實(shí)施方案中,優(yōu)選的是VH結(jié)構(gòu)域 和VL結(jié)構(gòu)域均獲得自同一駱駝科動(dòng)物物種,例如,VH和VL可以都來自大羊駝或者VH和VL 可以都來自羊駝(之后引入經(jīng)改造的氨基酸序列變化)。在這樣的實(shí)施方案中,VH和VL結(jié) 構(gòu)域可以都來自于單個(gè)動(dòng)物,尤其是已被主動(dòng)免疫的單個(gè)動(dòng)物。本發(fā)明還延伸至嵌合抗原 結(jié)合多肽(例如抗體分子),其中VH或VL結(jié)構(gòu)域之一是經(jīng)駱駝科動(dòng)物編碼的,而其它可變 結(jié)構(gòu)域是非駱駝科動(dòng)物(例如人)的。
[0081] 作為在駱駝科VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基酸序列中進(jìn)行改造產(chǎn)生變化的一個(gè) 替代方案,可將單個(gè)的駱駝科高變環(huán)或CDR或者其組合從駱駝科VH/VL結(jié)構(gòu)域中分離出來, 并通過CDR移植將其轉(zhuǎn)移到替代的(即非駱駝科的)框架(例如人VH/VL框架)。
[0082] 與高度保守抗原結(jié)合的抗原結(jié)合多狀
[0083] 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至 少90%氨基酸序列同一性的靶抗原可能是"高度保守"抗原。在由駱駝科動(dòng)物物種的主動(dòng) 免疫產(chǎn)生抗原結(jié)合多肽的情況下,如果靶抗原與同一駱駝科動(dòng)物物種(如同在其中產(chǎn)生抗 原結(jié)合多肽的駱駝科動(dòng)物物種)的天然抗原的序列和/或結(jié)構(gòu)極其類似,那么認(rèn)為所述靶 抗原是"高度保守的"。例如,在抗原結(jié)合多肽是大羊駝來源的情況下,"高度保守"靶抗原 是來自大羊駝之外物種的高度類似于天然大羊駝抗原的多肽。
[0084] 在多肽抗原的情況下,高度保守抗原與天然駱駝科動(dòng)物多肽(其在結(jié)構(gòu)上最接近 相關(guān)的)之間的相似度可表示為氨基酸序列的%相似性。因此,在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中, 高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽,其表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種 的同源蛋白質(zhì)具有至少90%的氨基酸序列同一性。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,高度保守 抗原可以是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽,其表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同 源蛋白質(zhì)具有至少95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
[0085] 除非本申請(qǐng)中另外說明,否則兩個(gè)氨基酸序列之間的%序列同一性可通過比較這 兩個(gè)以最佳方式比對(duì)的序列來確定并且其中待比較的兩個(gè)氨基酸序列可包含相對(duì)于參考 序列的添加或缺失以得到這兩個(gè)序列之間的最佳比對(duì)。通過測(cè)定兩個(gè)序列之間相同的氨 基酸殘基的位置數(shù),將該相同的位置數(shù)除以所選序列比較窗口中的位置總數(shù)并且將所得結(jié) 果乘以100從而獲得這兩個(gè)序列之間的同一性百分比來計(jì)算同一性百分比。例如,可使用 BLAST 程序,可在網(wǎng)站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html 上得到的 "BLAST 2 序列,'(Tatusova 等,"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" ,FEMS Microbiol Lett. 174:247-250),所使用的參數(shù)是默認(rèn) 給出的那些(特別是參數(shù)"開放空缺罰分(open gap penalty)":5,以及"延伸空缺罰分 (extension gap penalty) ":2;選擇的矩陣為例如,由程序建議的矩陣"BL0SUM 62"),由程 序直接計(jì)算出待比較的兩個(gè)序列之間的同一性百分比。
[0086] 對(duì)于任何給定的靶抗原,技術(shù)人員還可使用公共可得的搜索和比對(duì)工具,例如 BLAST程序,其中靶抗原作為單個(gè)查詢序列。從返回的結(jié)果,可確定多肽抗原是否表現(xiàn)出與 來自相關(guān)駱駝科物種(即抗原結(jié)合多肽的高變環(huán)和互補(bǔ)決定區(qū)來源于其的駱駝科物種)的 蛋白質(zhì)具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
[0087] 在本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案中,在其將靶抗原與比較物駱駝科動(dòng)物蛋白質(zhì)相 比較的"序列比較窗口"必須是包括至少抗原結(jié)合多肽之表位的靶抗原的區(qū)。所述序列比 較可以是,例如,靶蛋白質(zhì)的至少20個(gè)氨基酸,或至少30個(gè)氨基酸,或至少50個(gè)氨基酸,或 至少100個(gè)氨基酸的連續(xù)序列,其包含抗原結(jié)合多肽的表位。
[0088] 在某些實(shí)施方案中,序列比較窗口可包括包含抗原結(jié)合多肽之表位的靶抗原的至 少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。
[0089] 在另一些實(shí)施方案中,序列比較窗口可以是全長的靶抗原,其通過限定將包括抗 原結(jié)合多肽的表位,即使表位的確切特征/位置未知。
[0090] 在每一個(gè)前述實(shí)施方案中,所述靶抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比較物蛋 白質(zhì)中存在之表位具有基本上相同結(jié)構(gòu)的表位(對(duì)于抗原結(jié)合多肽)。在線性表位的情況 下,形成表位的氨基酸序列可以是在靶抗原與比較物駱駝科動(dòng)物蛋白質(zhì)之間100%保守的。
[0091] 高度保守抗原可以是基本上來自任何物種的多肽,所述物種包括但不限于人、非 人靈長類動(dòng)物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、牛或雞。然而,在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中, 所述高度保守抗原可以是人多肽,例如治療靶標(biāo)或生物標(biāo)志物。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方 案中,所述高度保守抗原可以是治療或診斷相關(guān)的靶抗原。人多肽的確切性質(zhì)不是實(shí)質(zhì)問 題;本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生針對(duì)人多肽的抗體的平臺(tái),所述人多肽是"高度保守的"無論人 多肽的確切特征如何。人多肽(可針對(duì)其產(chǎn)生本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽)的特征在于其與天 然駱駝科動(dòng)物抗原的相似程度(在氨基酸序列中)。通過非限制性實(shí)例的方式,一個(gè)可針 對(duì)其產(chǎn)生抗體的"高度保守的"人多肽是高遷移率族1(thehighmobilitygroupbox1, HMGB1)蛋白質(zhì),其是在人與小鼠之間99%保守的并且在人與大羊駝之間97%保守的。 [0092] 在另一些實(shí)施方案中,高度保守抗原可以是非多肽抗原,例如糖類抗原(例如,寡 糖或多糖)或者包含多肽和糖類組分兩者的抗原,例如,糖蛋白。在靶抗原是糖蛋白的情況 下,糖蛋白靶抗原可表現(xiàn)出與同源的駱駝科動(dòng)物蛋白質(zhì)的糖基化模式基本上相同的糖基化 模式。抗原結(jié)合分子所結(jié)合的抗原決定簇可以是糖類表位或者其可以是由多肽決定簇(例 如一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基)和糖類決定簇(例如,糖蛋白的寡糖/聚糖側(cè)鏈的一個(gè)或更 多個(gè)糖部分)的組合所形成的表位。
[0093]與駱駝科動(dòng)物自身抗原和駱駝科動(dòng)物來源抗原結(jié)合的抗原結(jié)合多狀
[0094] 在本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具 有至少90%氨基酸序列同一性的靶抗原可以是駱駝科動(dòng)物自身抗原或駱駝科動(dòng)物來源抗 原。在由駱駝科動(dòng)物物種的主動(dòng)免疫產(chǎn)生的抗原結(jié)合多肽的情況下,術(shù)語"自身抗原"是指 天然駱駝科動(dòng)物抗原,即,天然存在于同一駱駝科動(dòng)物物種中的抗原。例如,在由大羊駝的 主動(dòng)免疫產(chǎn)生抗原結(jié)合多肽的情況下,術(shù)語"自身抗原"是指天然大羊駝抗原,即,天然存在 于大羊駝中的抗原。
[0095] 駱駝科動(dòng)物(例如,大羊駝)自身抗原可包括多肽、肽、多糖、糖蛋白、多核苷酸 (例如,DNA)、抗原等,其中多肽自身抗原是特別優(yōu)選的。"多肽自身抗原"可包括天然駱駝 科動(dòng)物多肽還有駱駝科動(dòng)物多肽的合成形式,例如重組表達(dá)的多肽。
[0096] 本文所使用的術(shù)語"駱駝科動(dòng)物來源抗原"是指靶抗原,其是來源于天然駱駝科動(dòng) 物抗原的變體,所述變體在結(jié)構(gòu)/序列上與駱駝科動(dòng)物抗原高度相似,例如駱駝科動(dòng)物多 肽的經(jīng)改造的序列變體。駱駝科來源多肽抗原可具有與其所來源的天然駱駝科動(dòng)物蛋白 質(zhì)的氨基酸序列高度類似的氨基酸序列,例如氨基酸序列具有與天然駱駝科動(dòng)物多肽至少 90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %,或者甚至至少99 %的同一性。
[0097] 抗獨(dú)特型
[0098] 在一個(gè)特別重要的實(shí)施方案中,抗原結(jié)合多肽可以是抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽(例 如,抗獨(dú)特型抗體或其抗原結(jié)合片段),其與包含獲得自駱駝科物種之抗體的可變區(qū)的靶抗 原結(jié)合。駱駝科來源抗體(抗獨(dú)特型與其結(jié)合)可以是常規(guī)的駱駝科動(dòng)物抗體(即,包含 成對(duì)的VH和VL結(jié)構(gòu)域的駱駝科動(dòng)物抗體)或者只有重鏈的抗體(即包含VHH結(jié)構(gòu)域的駱 駝科動(dòng)物抗體)。在其中產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽的駱駝科動(dòng)物物種可與抗體可變區(qū)所 來源的駱駝科動(dòng)物物種相同。因此,通過非限制性實(shí)例的方式,一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是大羊 駝來源的抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽(例如,大羊駝抗獨(dú)特型抗體),其與大羊駝來源抗體的可 變區(qū)中的表位(靶抗原)結(jié)合。形成抗獨(dú)特型抗體的靶抗原之大羊駝來源的抗體可以是常 規(guī)大羊駝抗體或者只有重鏈的大羊駝抗體。
[0099] 抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽所結(jié)合的駱駝科動(dòng)物來源的(例如,大羊駝來源的)抗體 之可變區(qū)中的表位可位于駱駝科動(dòng)物來源的(例如,大羊駝來源的)常規(guī)抗體的VH結(jié)構(gòu)域 中,或者駱駝科動(dòng)物來源的(例如,大羊駝來源的)常規(guī)抗體的VL中,或者所述表位可由駱 駝科動(dòng)物來源的(例如,大羊駝來源的)常規(guī)抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域兩者中的氨基 酸來形成??躬?dú)特型抗原結(jié)合多肽的"表位"最通常地由其所結(jié)合的抗體可變區(qū)的CDR來 形成。
[0100] 形成抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽之靶向抗原的駱駝科動(dòng)物來源的(例如,大羊駝來源 的)常規(guī)抗體的可變區(qū)可來源于天然駱駝科動(dòng)物(例如,大羊駝)常規(guī)抗體,例如通過采用 目的抗原主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物(例如,大羊駝)所產(chǎn)生的抗體,或者實(shí)際上其可以是天然駱 駝科動(dòng)物(例如,大羊駝)常規(guī)抗體的合成的或經(jīng)改造的序列變體。因此,在本文的上下 文中,"常規(guī)的駱駝科動(dòng)物來源抗體的可變區(qū)"不僅包括天然駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的可變區(qū) (即,與駱駝科動(dòng)物中產(chǎn)生的抗體具有相同序列),而且涵蓋經(jīng)改造的變體,例如相對(duì)于天 然駱駝科動(dòng)物序列,在相關(guān)的框架區(qū)和/或CDR中具有氨基酸替換的變體,前提是經(jīng)改造的 變體仍可保持與天然駱駝科動(dòng)物來源的常規(guī)抗體的可變結(jié)構(gòu)域(VH和/或VL)具有最小至 少90%的氨基酸序列同一性。在這樣的實(shí)施方案中,用于評(píng)估%氨基酸序列同一性的序列 比較窗口可包括整個(gè)VH結(jié)構(gòu)域和整個(gè)VL結(jié)構(gòu)域。
[0101] W0 2010/001251描述了駱駝科動(dòng)物(并且特別是大羊駝)作為用于產(chǎn)生針對(duì)一系 列靶抗原的常規(guī)、四鏈抗體之平臺(tái)的用途,所述靶抗原包括治療目的的人多肽靶標(biāo)。那個(gè)申 請(qǐng)描述的是許多用于產(chǎn)生針對(duì)目的靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體的技術(shù)。一旦已經(jīng)分離出 對(duì)靶抗原具有適當(dāng)結(jié)合特異性的天然駱駝科動(dòng)物(例如,大羊駝)常規(guī)抗體,通常對(duì)在天然 駱駝科動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域中的一級(jí)氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)改變以提高其特性, 例如使其更適于人類治療用途。這樣的改變可包括在VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的框架區(qū) 內(nèi)的氨基酸替換,并且還包括在有助于抗原結(jié)合位點(diǎn)的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)或更 多個(gè)CDR中的氨基酸替換。如上文所述,抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽的"表位"最通常是由其所 結(jié)合的抗體可變區(qū)的CDR來形成的。因此,還期望將通過用來自同一物種的靶抗體的可變 區(qū)來主動(dòng)免疫(例如,用大羊駝Fab來免疫)駱駝科動(dòng)物物種(例如,大羊駝)所產(chǎn)生的抗 獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽與那些可變區(qū)的種系化變體(例如,大羊駝Fab的種系化形式)相結(jié) 合,特別地如果將為了"種系化"目的所引入的氨基酸替換限制于框架區(qū),那么就使得CDR 在序列和結(jié)構(gòu)構(gòu)象方面基本保持不變。
[0102] 本發(fā)明現(xiàn)在提供了通過其產(chǎn)生高特異性、高親和力的抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽的方 法,所述抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽具有對(duì)常規(guī)駱駝科動(dòng)物來源抗體的可變區(qū)的結(jié)合特異性, 即使考慮后者可為由于免疫耐受難以靶向的駱駝科動(dòng)物自身抗原。
[0103]如本文所述的抗獨(dú)特型抗原結(jié)合多肽的一個(gè)主要實(shí)際應(yīng)用是作為對(duì)于旨在用作 人治療劑之駱駝科動(dòng)物來源抗體的藥代動(dòng)力學(xué)研究的工具。
[0104]抗原結(jié)合多狀的結(jié)構(gòu)
[0105] 只要VH和VL結(jié)構(gòu)域都存在,那么本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽就可以采用多種不同的 實(shí)施方案。因此,在一些非限制性的實(shí)施方案中,抗原結(jié)合多肽可以是免疫球蛋白、抗體或 抗體片段。本文的術(shù)語"抗體"以最廣義來使用,并涵蓋但不限于單克隆抗體(包括全長的 單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體),只要它們表現(xiàn)出對(duì)靶抗原 具有適當(dāng)?shù)奶禺愋约纯?。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指獲得自基本同源的抗體之群 體的抗體,即包含在該群體中的各個(gè)抗體是相同的,除了可以少量存在的可能的天然突變 以外。單克隆抗體針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)具有高度特異性。此外,與常規(guī)的(多克隆)抗體制 劑(其通常包含針對(duì)抗原上不同決定簇(表位)的不同抗體)不同的是,每個(gè)單克隆抗體 針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇或表位。
[0106]"抗體片段"包含全長抗體的一部分,一般為其抗原結(jié)合或可變結(jié)構(gòu)域。抗體片 段的實(shí)例包括?&13、?&13'、?(&13')2、雙特異性? &13'8以及?¥片段、雙抗體((11&13 〇(^)、 線性抗體、單鏈抗體分子、單鏈可變片段(SCFV)和由抗體片段形成的多特異性抗體(參見 Holliger 和 Hudson,Nature Biotechnol. 23 :1126-36 (2005),其內(nèi)容通過引用并入本文)。 [0107]在一些非限制性實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的抗體和抗體片段可包含CH1結(jié)構(gòu)域和 /或CL結(jié)構(gòu)域(其氨基酸序列完全或基本上是人的)。當(dāng)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽是旨在用 于人治療用途的抗體時(shí),抗體的整個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域或者至少其一部分通常具有完全或基本上 為人的氨基酸序列。因此,本發(fā)明的抗體必須包含VH和VL結(jié)構(gòu)域,其至少一個(gè)包含來源于 駱駝科的至少一個(gè)高變環(huán),但CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域(以 及CH4結(jié)構(gòu)域,如果存在的話)中的一個(gè)或更多個(gè)或者任意組合的氨基酸序列可完全或基 本上是人的。
[0108]有利地,CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域(以及CH4結(jié)構(gòu) 域,如果存在的話)可以都具有完全或基本上為人的氨基酸序列。就人源化或嵌合抗體或 抗體片段的恒定結(jié)構(gòu)域而言,術(shù)語"基本上為人的"是指與人恒定結(jié)構(gòu)域具有至少90%、或 至少95%、或至少97%、或至少99%的氨基酸序列同一性。在本文的上下文中,術(shù)語"人的 氨基酸序列"是指由人免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列,其包括種系的、重排的和體細(xì)胞 突變的基因。本發(fā)明還涵蓋這樣的多肽,其包含已被改變的"人"序列恒定結(jié)構(gòu)域(通過一 個(gè)或更多個(gè)氨基酸的添加、缺失或者替換來對(duì)于人序列進(jìn)行改變)。
[0109]正如本文別處所討論的,預(yù)想到可以在重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(特別是 在Fc區(qū)內(nèi))內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換、插入或缺失。氨基酸的替換可導(dǎo)致使用 不同的天然存在氨基酸或者使用非天然的或經(jīng)修飾的氨基酸來取代被替換的氨基酸。其 它結(jié)構(gòu)修飾也是允許的,例如改變糖基化模式(例如通過添加或缺失N-或0-連接的糖基 化位點(diǎn))。取決于抗體的預(yù)期用途,可以期望修飾本發(fā)明抗體對(duì)Fc受體的結(jié)合特性,例如 用來調(diào)節(jié)效應(yīng)功能。例如,可以將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)中,從而使該區(qū)中形成鏈間二硫 鍵。由此產(chǎn)生的同源二聚體抗體可具有提高的內(nèi)化能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)之細(xì)胞殺 傷和抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron等,J.Exp. Med. 176:1191-1195(1992)以及 Shopes,B. J. Immunol. 148 :2918-2922(1992)?;蛘?,可以將抗體改造成具有雙Fc區(qū),從而 可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解和ADCC的能力。參見Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)。本發(fā)明還預(yù)期包含本文所述抗體的免疫綴合物,其中所述抗體與細(xì)胞毒劑 (例如化療劑、毒素(例如,細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶促活性毒素,或其片段)或放射 性同位素(即放射性綴合物))相綴合。還可以改造Fc區(qū)以延長半衰期。
[0110] 在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明可涵蓋與靶抗原特異性結(jié)合的嵌合駱駝科/人抗體, 所述靶抗原是來自所述駱駝科物種的自身抗原或者表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白 質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。一些優(yōu)選的實(shí)施方案包括嵌合抗體,其中 VH和VL結(jié)構(gòu)域完全是駱駝科動(dòng)物序列(例如大羊駝或羊駝),而抗體的其余部分完全是人 序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明還涵蓋"種系化"的駱駝科抗體以及駱駝科/人嵌 合抗體,其中VH和VL結(jié)構(gòu)域相比于通過主動(dòng)免疫獲得的駱駝科VH和VL結(jié)構(gòu)域來說在框 架區(qū)中包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換。通過使用在人種系編碼的VH或VL結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的 等效殘基來取代起始駱駝科VH或VL結(jié)構(gòu)域中的錯(cuò)配氨基酸殘基,"種系化"方法(如在W0 2010/001251和W0 2011/080350中所述,其通過引用并入本文)提高了與人種系VH或VL 結(jié)構(gòu)域的%序列同一性。
[0111] 本發(fā)明還進(jìn)一步涵蓋CDR移植的抗體,其中將來源于與靶抗原(其是來自所述駱 駝科物種的自身抗原或者表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序 列同一性的多肽抗原)特異性結(jié)合的駱駝科抗體(例如通過使用靶抗原進(jìn)行主動(dòng)免疫產(chǎn)生 的駱駝科抗體或者由駱駝科動(dòng)物的基因編碼的抗體)的CDR(或高變環(huán))移植到人VH和VL 框架上,而抗體的其余部分還是完全人來源的。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明種系化的、嵌合的和CDR移植的抗體(特別是包含來源于使用靶抗原 對(duì)駱駝科進(jìn)行主動(dòng)免疫獲得之高變環(huán)的抗體)可以使用常規(guī)的重組DNA操作和表達(dá)技術(shù)容 易地產(chǎn)生,其利用經(jīng)改造的原核和真核宿主細(xì)胞(包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳 動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞,其中的一些如本文所述并在所附實(shí)施例中說明)以產(chǎn)生目 的多肽。
[0113] 本發(fā)明還進(jìn)一步延伸至這樣的抗原結(jié)合多肽,其中VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的 高變環(huán)或CDR獲得自駱駝科,但相對(duì)于駱駝科動(dòng)物編碼的序列來說,其中將至少一個(gè)所述 (駱駝科動(dòng)物來源的)高變環(huán)或⑶R已被改造成包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、添加或者 缺失。這些變化包括高變環(huán)/⑶R的"人源化"。已經(jīng)以這種方式改造的駱駝科動(dòng)物來源之 HV/CDR仍可以表現(xiàn)出與駱駝科動(dòng)物編碼的HV/CDR之氨基酸序列"基本一致"的氨基酸序 列。在本文的上下文中,"基本一致"可允許與駱駝科動(dòng)物編碼的HV/CDR有不超過一個(gè),或 不超過兩個(gè)氨基酸序列錯(cuò)配。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是任何同種型,所述抗體與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗 原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。 用于人類治療用途的抗體通常為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型,通常是IgG型,在這種情況下, 其可屬于IgG 1、IgG2a和b、I gG3或IgG4四個(gè)亞類中的任何。在這些亞類中的每一個(gè)中,允 許在Fc部分內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換、插入或缺失,或者進(jìn)行其它結(jié)構(gòu)修飾,從 而例如提高或降低Fc依賴的功能。
[0115] 與靶抗原(其是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序 列同一性的多肽抗原)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合多肽可用于廣泛的應(yīng)用中,包括在研究中以 及在診斷和/或治療疾病中。由于與天然人抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域具有高度的氨基酸序列 同一性和高度的結(jié)構(gòu)同源性(特別是如在人抗體中發(fā)現(xiàn)的正確的典型折疊的組合),本發(fā) 明的抗原結(jié)合多肽(特別是以單克隆抗體的形式)將發(fā)現(xiàn)作為人治療劑的特別用途。
[0116] 多核苷酸、載體和重纟目表汰
[0117] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗原結(jié)合多肽的多核苷酸分子、包含與調(diào)節(jié)序列有效 連接的編碼本發(fā)明抗原結(jié)合多肽之核苷酸序列的表達(dá)載體,以及包含該表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),所述調(diào)節(jié)序列允許抗原結(jié)合多肽在宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表 達(dá)。
[0118] 編碼本發(fā)明抗原結(jié)合多肽的多核苷酸分子包括例如重組DNA分子。
[0119] 如本文所使用的術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"或"多核苷酸分子"可互換使用,其是指 任何DNA或RNA分子,無論是單鏈或雙鏈的,并且如果是單鏈的話,還包括其互補(bǔ)序列的分 子。在討論核酸分子時(shí),本文中可根據(jù)以5'至3'方向提供序列的標(biāo)準(zhǔn)慣例來描述特定 核酸分子的序列或結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,核酸或多核苷酸是"分離"的。當(dāng)用 于核酸分子時(shí),該術(shù)語是指將核酸分子從其來源之生物體的天然存在基因組中與其緊密相 鄰的序列分離出來。例如,"分離的核酸"可以包括插入到載體(如質(zhì)?;虿《据d體)中的 DNA分子,或者是整合到原核或真核細(xì)胞或非人類宿主生物體之基因組DNA中的DNA分子。 當(dāng)用于RNA時(shí),"分離的多核苷酸"主要是指由上文定義的分離的DNA分子編碼的RNA分子。 或者,該術(shù)語可指這樣的RNA分子,其已經(jīng)被從其它的核酸(在自然狀態(tài)下(即在細(xì)胞或組 織中)所述RNA分子與其他核酸聯(lián)系(associate)在一起)純化/分離出來。分離的多核 苷酸0NA或RNA)還可表示通過生物或合成手段直接產(chǎn)生,并在其生產(chǎn)過程中與存在的其 它組分分開的分子。
[0120] 在W0 2010/001251和W0 2011/080350中描述了用于根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽 之重組生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),其內(nèi)容通過引用整體地并入本文。
[0121] 應(yīng)注意,術(shù)語"宿主細(xì)胞"一般是指培養(yǎng)的細(xì)胞系。將已經(jīng)引入編碼根據(jù)本發(fā)明的 抗原結(jié)合多肽之表達(dá)載體的完整人類明確地排除在本發(fā)明的范圍以外。
[0122] 在一個(gè)重要的方面,本發(fā)明還提供了生產(chǎn)重組抗原結(jié)合多肽的方法,其包括在允 許所述抗原結(jié)合多肽表達(dá)的條件下,培養(yǎng)包含編碼重組抗原結(jié)合多肽之多核苷酸(例如表 達(dá)載體)的宿主細(xì)胞(或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)),并回收所表達(dá)的抗原結(jié)合多肽。該重組表達(dá)方 法可用于根據(jù)本發(fā)明抗原結(jié)合多肽(包括旨在用于人類治療用途的單克隆抗體)的大規(guī)模 生產(chǎn)。用于大規(guī)模生產(chǎn)適用于體內(nèi)治療用途之重組抗體的合適載體、細(xì)胞系和生產(chǎn)方法都 是在本領(lǐng)域通??傻玫模楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
[0123] 本發(fā)明的另一些方面涉及測(cè)試藥盒,包括診斷藥盒等,其包含根據(jù)本發(fā)明的抗原 結(jié)合多肽,還有包含根據(jù)本發(fā)明之抗原結(jié)合多肽的藥物制劑。
[0124] 當(dāng)抗原結(jié)合多肽旨在用于診斷用途時(shí)(例如,當(dāng)所述抗原結(jié)合多肽特異性針對(duì)作 為疾病狀態(tài)或疾病易感性之生物標(biāo)志物的抗原時(shí)),然后可方便地提供所述抗原結(jié)合多肽 作為測(cè)試藥盒的組分。診斷測(cè)試通常采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定形式,如ELISA、放射免疫測(cè)定、 Elispot等。這種測(cè)試藥盒的組分可取決于測(cè)試或測(cè)定(其旨在使用本發(fā)明的抗原結(jié)合多 肽來實(shí)施)的性質(zhì)而有所不同,但通常還包括使用本發(fā)明抗原結(jié)合多肽進(jìn)行免疫測(cè)定所需 的另外試劑。用作診斷試劑的抗原結(jié)合多肽可帶有顯示標(biāo)記(revealing lable),如突光部 分、酶促標(biāo)記或放射性標(biāo)記。
[0125] 通常將用于體內(nèi)治療用途的抗原結(jié)合多肽與一種或更多種可藥用稀釋劑、載體或 賦形劑一起配制成藥物劑型(Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版,Osol, A.編,1980)。通常將根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽配制成無菌水溶液,以對(duì)有此需要的哺乳 動(dòng)物對(duì)象(通常是人患者)靜脈內(nèi)、或通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、腫瘤內(nèi)、經(jīng)口、腫瘤周邊 (peritumoral)、皮下、滑膜內(nèi)(intra-synovial)、鞘內(nèi)、表面、舌下或吸入途徑施用。為預(yù)防 或治療疾病,抗原結(jié)合多肽的合適劑量將取決于待治療之疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和 臨床病程,以及患者的年齡、體重和病史,并由主治醫(yī)師判斷確定。
[0126] 抗原結(jié)合多狀的牛產(chǎn)方法
[0127] 本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及用于生產(chǎn)針對(duì)目的靶抗原具有高親和力的抗原結(jié)合 多肽(特別是單克隆抗體)的方法,其中所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0128] 因此,本發(fā)明方法用于制備與靶抗原特異性結(jié)合的重組抗原結(jié)合多肽,所述抗原 結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或 互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)獲得自駱駝科物種,所述方法包括以下步驟:
[0129] (a)免疫駱駝科物種(使用靶抗原),從而產(chǎn)生針對(duì)所述靶抗原的常規(guī)抗體;
[0130] (b)分離駱駝科核酸,其編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之駱駝科常規(guī)抗體VH和/或 VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR);
[0131] (c)制備包含編碼如下高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)之核苷酸序列的多核苷酸,所述高變 環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)具有與由步驟(a)分離的核酸編碼的高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)一致的氨基酸 序列,所述多核苷酸編碼包含與所述靶抗原免疫反應(yīng)(或特異性結(jié)合)之VH結(jié)構(gòu)域和VL 結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽;以及
[0132] (d)由步驟(c)的重組多核苷酸來表達(dá)所述抗原結(jié)合多肽,其中所述抗原結(jié)合多 肽與部分(b)的駱駝科常規(guī)抗體不一致,特征在于所述靶抗原表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物 種的蛋白質(zhì)具有至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的氨基酸序列同一性。
[0133] 該方法的第一步驟包括對(duì)駱駝科物種進(jìn)行主動(dòng)免疫以引起針對(duì)靶抗原的免疫應(yīng) 答,從而產(chǎn)生與所述靶抗原免疫反應(yīng)的駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體。對(duì)駱駝科動(dòng)物免疫的方案描 述于所附實(shí)施例中。用于免疫的抗原物質(zhì)可以是靶抗原的純化形式,例如重組表達(dá)的多肽 或其免疫原性片段。然而,也可使用靶抗原的未加工制劑(例如表達(dá)或編碼所述靶抗原的 分離的細(xì)胞或組織制劑、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞上清液或級(jí)分(例如細(xì)胞膜)等,或脂質(zhì)顆粒、 珠、小泡或在其表面上含有抗原的其它顆粒)或者使用編碼所述靶抗原的多核苷酸進(jìn)行免 疫(DNA免疫)。該方法通常涉及駱駝科物種(包括,但不限于,大羊駝和羊駝)動(dòng)物的免 疫,并且有利的是這些動(dòng)物屬于完全遠(yuǎn)系種群(outbred population)。然而,還預(yù)期使用包 含駱駝科動(dòng)物常規(guī)Ig基因座,或至少其一部分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)。
[0134] 基于駱駝科動(dòng)物主動(dòng)免疫的方法的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)出于所有駱駝科物種都可以以 大的遠(yuǎn)系種群(其中動(dòng)物個(gè)體都有不同的遺傳背景)來維持的事實(shí)。因此,可采用主動(dòng)免 疫來引起針對(duì)目的抗原之強(qiáng)的和多樣的免疫應(yīng)答,并從中可獲得多樣的潛在抗原結(jié)合分子 池(pool)。如所附實(shí)施例所示,駱駝科動(dòng)物的主動(dòng)免疫可產(chǎn)生具有高度免疫多樣性的與高 度保守靶抗原(例如,可與駱駝科動(dòng)物多肽共享大于90%氨基酸序列同一性的多肽抗原) 結(jié)合的Fab片段。
[0135] 在使用靶抗原進(jìn)行主動(dòng)免疫后,可從經(jīng)免疫的動(dòng)物中分離出外周血淋巴細(xì)胞或活 檢樣品(例如淋巴結(jié)或脾活檢樣品),并進(jìn)行篩選用于產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物 抗體。如實(shí)施例中所示,該階段中可使用例如淘選(panning)或FACS分選的富集技術(shù)以減 少待篩選的B細(xì)胞庫的復(fù)雜性。然后,選出抗原特異性B細(xì)胞并用于提取總RNA以及隨后 的cDNA合成。編碼天然駱駝科動(dòng)物VH和VL結(jié)構(gòu)域的核酸(特異性針對(duì)靶抗原)可通過 PCR進(jìn)行分尚。
[0136] 可以將編碼駱駝科動(dòng)物VH和VL結(jié)構(gòu)域的核酸直接克隆到用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明之 抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體中。特別地,可以將這些序列克隆到還編碼人抗體恒定區(qū)或其一 部分的表達(dá)載體中以產(chǎn)生嵌合抗體。然而,通常是在克隆和表達(dá)人類恒定區(qū)序列之前,對(duì)分 離的駱駝科動(dòng)物VH和VL序列進(jìn)行進(jìn)一步操作。
[0137] 第一步,可使用候選的駱駝科動(dòng)物VH和VL序列(主動(dòng)免疫后分離的)制備駱駝 科動(dòng)物文庫(例如Fab文庫,如所附實(shí)施例中所述的)。然后可針對(duì)與靶抗原的結(jié)合來篩選 文庫(例如使用噬菌體展示)??梢詫?duì)有前景的首選候選物針對(duì)與靶抗原的結(jié)合進(jìn)一步進(jìn) 行測(cè)試,例如使用Biacore或合適的生物測(cè)定。最后,將最有前景的首選編碼VH和VL結(jié)構(gòu) 域的序列與編碼人抗體恒定區(qū)的序列進(jìn)行框內(nèi)融合克隆。
[0138] 用來編碼(駱駝科動(dòng)物來源的)HV/CDR的多核苷酸序列(例如用于本發(fā)明抗原結(jié) 合多肽的重組表達(dá))不需要與駱駝科動(dòng)物中天然編碼HV/⑶R的天然多核苷酸序列一致。因 此,本發(fā)明涵蓋/允許密碼子優(yōu)化以及在多核苷酸序列中涉及克隆和/或表達(dá)的其它變化, 這不改變所編碼的氨基酸序列。
[0139] 在某些實(shí)施方案中,可進(jìn)行"鏈改組(chain shuffling) ",其中將已知與目的抗原 結(jié)合的特定可變結(jié)構(gòu)域與一系列相反類型的可變結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)配對(duì)(即VH與VL文庫 配對(duì)或相反亦然)以產(chǎn)生文庫以及所得到的針對(duì)抗原親和力和/或特異性進(jìn)行測(cè)試的VH/ VL組合?;蛘?,VH結(jié)構(gòu)域文庫可隨機(jī)或以分級(jí)的方式與VL結(jié)構(gòu)域的文庫配對(duì),并測(cè)試所得 到的組合(參見Clackson等,Nature,卷352,624-638頁,1991)。在該方法中,所述文庫可 以是來自駱駝科動(dòng)物(其表現(xiàn)出對(duì)目的抗原具有免疫性(包括已被主動(dòng)免疫的動(dòng)物))的 重排VH和VL(Vk或VA)的文庫。所述鏈改組過程可增加免疫多樣性并產(chǎn)生具有顯著增 強(qiáng)的親和力的配對(duì)。
[0140] 在本發(fā)明的方法中,可對(duì)"天然的"駱駝科動(dòng)物來源VH和VL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行蛋白質(zhì)改 造以引入一個(gè)或更多個(gè)選擇性的氨基酸替換,通常引入框架區(qū)中。將這樣的替換引入"野生 型"駱駝科動(dòng)物序列的原因可以是(i)框架區(qū)的人源化,(ii)穩(wěn)定性、生物利用率、產(chǎn)物均 一性、組織滲透性的提高等,或者(iii)靶抗原結(jié)合的優(yōu)化。
[0141] 可根據(jù)廣泛接受的原則通過框架區(qū)中選擇性取代一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基來進(jìn) 行駱駝科動(dòng)物來源的VH和VL結(jié)構(gòu)域的"種系化"(如在W0 2010/001251和W0 2011/080350 中所說明的,其內(nèi)容通過引用特定地并入本文)。應(yīng)當(dāng)理解,為實(shí)現(xiàn)任何給定VH結(jié)構(gòu)域、VL 結(jié)構(gòu)域或其組合的可接受的"種系化"而進(jìn)行之氨基酸改變的確切特征將視具體情況而變 化,因?yàn)檫@將取決于來源于駱駝科之框架區(qū)的序列以及這些框架區(qū)與最對(duì)應(yīng)的人種系(或 體細(xì)胞突變的)框架區(qū)之間的起始同源性,并且也可能取決于形成抗原結(jié)合位點(diǎn)之高變環(huán) 的序列和構(gòu)象。種系化過程的總體目標(biāo)是產(chǎn)生這樣的分子,當(dāng)將其引入人對(duì)象中時(shí),其中的 VH和VL結(jié)構(gòu)域都表現(xiàn)出最小的免疫原性,而保留了由駱駝科編碼的親本VH和VL結(jié)構(gòu)域 (例如通過主動(dòng)免疫獲得的駱駝科動(dòng)物VH/VL)形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性和親和力。
[0142] f庫構(gòu)律的方法
[0143] 在一個(gè)相關(guān)方面,本發(fā)明還涵蓋產(chǎn)生編碼駱駝科常規(guī)抗體之VH和VL結(jié)構(gòu)域的表 達(dá)載體文庫的方法,所述方法包括以下步驟:
[0144] a)主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物,從而產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體;
[0145] b)從包含來自所述經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物的淋巴組織(例如循環(huán)B細(xì)胞)的樣品來制 備cDNA或基因組DNA ;
[0146] c)擴(kuò)增所述cDNA或基因組DNA的區(qū)域以獲得這樣的擴(kuò)增基因區(qū)段,每個(gè)基因區(qū)段 包含編碼駱駝科常規(guī)抗體之VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科常規(guī)抗體之VL結(jié)構(gòu) 域的核苷酸序列;以及
[0147] d)將c)中獲得的基因區(qū)段克隆到表達(dá)載體中,使得每個(gè)表達(dá)載體都包含編碼VH 結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,并且指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和所述VL結(jié) 構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽的表達(dá),由此得到表達(dá)載體文庫,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出與 來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90 %,或者至少95 %、96 %、97 %或98 %氨基酸序 列同一,丨生的多肽抗原。
[0148] 上述"文庫構(gòu)建"的方法也可構(gòu)成上述用于生產(chǎn)本發(fā)明抗原結(jié)合多肽之一般方法 的一部分。因此,被描述為涉及本發(fā)明的這一方面優(yōu)選或有利的任何特征也可被認(rèn)為涉及 一般方法是優(yōu)選或有利的,反之亦然,除非另有說明。
[0149] 在一個(gè)實(shí)施方案中,步驟a)中被擴(kuò)增的核酸包括從駱駝科動(dòng)物淋巴組織制備的 cDNA或基因組DNA,所述淋巴組織包括一種或更多種B細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞,或 其組合。循環(huán)B細(xì)胞是特別優(yōu)選的。外周血淋巴細(xì)胞(PBL)可用作編碼常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗 體之VH和VL結(jié)構(gòu)域的核酸的來源,即在PBL樣品中存在足夠量的(表達(dá)抗體的)漿細(xì)胞以 使得可以進(jìn)行直接擴(kuò)增。這是有利的,因?yàn)镻BL可從動(dòng)物(駱駝科動(dòng)物)采集的全血樣品 制備。這就避免了需要使用侵入性程序來獲取組織活檢樣品(例如,來自于脾或淋巴結(jié)), 并且這意味著采樣程序可視需要而經(jīng)常重復(fù)進(jìn)行,同時(shí)對(duì)動(dòng)物的影響最小。例如,可以主動(dòng) 免疫駱駝科動(dòng)物,從該動(dòng)物中抽取第一血樣,并制備PBL,然后使用"加強(qiáng)"劑量的同一抗原 或不同抗原第二次免疫同一動(dòng)物,然后抽取第二血樣,并制備PBL。
[0150] 因此,該方法的一個(gè)特定實(shí)施方案可包括:制備來自駱駝科動(dòng)物之含PBL的樣品, 從PBL制備cDNA或基因組DNA,并利用該cDNA或基因組DNA作為模板來擴(kuò)增編碼駱駝科動(dòng) 物常規(guī)抗體之VH或VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方案中,淋巴組織(例如循環(huán)B細(xì) 胞)獲得自已經(jīng)被主動(dòng)免疫的駱駝科動(dòng)物,如本文別處所述??俁NA(或mRNA)可從淋巴組 織樣品(例如外周血細(xì)胞或組織活檢樣品)中方便地制備,并且通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)換為cDNA。 還可使用基因組DNA作為起始材料。
[0151] 本發(fā)明的這一方面涵蓋用于構(gòu)建文庫的多樣性文庫方法和B細(xì)胞選擇方法。在一 種多樣性文庫方法中,可從由淋巴組織制備的核酸擴(kuò)增編碼VH和VL之基因區(qū)段的庫,而不 需任何的事先B細(xì)胞選擇。在一種B細(xì)胞選擇方法中,可在核酸提取和擴(kuò)增編碼VH和VL 之基因區(qū)段之前,選擇展示具有期望抗原結(jié)合特性之抗體的B細(xì)胞。
[0152] 可使用多種常規(guī)方法來選擇表達(dá)具有期望抗原結(jié)合特性之抗體的駱駝科動(dòng)物B 細(xì)胞。例如,B細(xì)胞可被熒光標(biāo)記的單克隆抗體(mAb,特異性識(shí)別來源于大羊駝或其它駱駝 科動(dòng)物的常規(guī)抗體)和其它熒光染料標(biāo)記的靶抗原染色以用于常規(guī)IgG的細(xì)胞表面展示。 然后,可通過FACS分離各雙陽性B細(xì)胞,并且從各個(gè)細(xì)胞中提取總RNA(或基因組DNA)。 或者,可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外增殖,并可篩選含有分泌的IgG的培養(yǎng)上清液,以及從陽性細(xì)胞 提取總RNA(或基因組DNA)。在另一種方法中,各個(gè)B細(xì)胞可經(jīng)特定基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化或與腫 瘤細(xì)胞系來融合以產(chǎn)生可以"根據(jù)需要(at will)"生長的細(xì)胞系,隨后從這些細(xì)胞制備總 RNA (或基因組DNA)。
[0153] 除了通過FACS進(jìn)行分選,還可在固定化的單克隆抗體(針對(duì)駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗 體)并隨后在固定化的靶抗原上對(duì)表達(dá)常規(guī)IgG的靶標(biāo)特異性B細(xì)胞進(jìn)行"淘選"??蓮目?原特異性B細(xì)胞池提取RNA (或基因組DNA),或者可轉(zhuǎn)化這些池并可通過有限稀釋或FACS 克隆出單個(gè)細(xì)胞。
[0154] B細(xì)胞選擇方法可包括陽性選擇或陰性選擇。無論是使用不進(jìn)行任何B細(xì)胞選 擇的多樣性文庫方法或是使用B細(xì)胞選擇方法,對(duì)從淋巴組織制備的核酸(cDNA或基因組 DNA)進(jìn)行擴(kuò)增步驟,從而擴(kuò)增編碼各VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段。
[0155] 可將從淋巴組織(例如外周B細(xì)胞或組織活檢樣品)提取的總RNA轉(zhuǎn)化成隨機(jī)引 物cDNA,或者寡dT引物,可用于合成cDNA,或者Ig特異性寡核苷酸引物可用于合成cDNA, 或者可在cDNA合成前使用寡dT纖維素從總RNA純化mRNA ( S卩,聚A RNA)。可將從B細(xì)胞 分離的基因組DNA用于PCR。
[0156] 可使用于可變區(qū)5'端退火的FR1引物組合CH1或Ck/CA區(qū)3'端退火的引物進(jìn) 行編碼至少VH或VL的重鏈和輕鏈(k和A)基因區(qū)段的PCR擴(kuò)增,其優(yōu)勢(shì)在于:就這些恒 定結(jié)構(gòu)域引物而言,每種類型只需要一種引物。該方法使駱駝科動(dòng)物的Fab得以克隆?;?者,可使用于可變區(qū)的3'端退火的一系列FR4引物再次克隆Fab (融合到編碼恒定區(qū)的載 體中)或scFv (單鏈Fv,其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)通過柔性的接頭序列相連);或者,可在 這樣的表達(dá)載體中克隆可變區(qū),所述表達(dá)載體允許產(chǎn)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上展示的全長IgG 分子。
[0157] 通常擴(kuò)增以兩步進(jìn)行,在使用非標(biāo)記引物的第一步中使用大量的cDNA(以保持多 樣性),并且在第二步中,使用經(jīng)標(biāo)記的引物(其是延伸引物,在5'端引入了限制性位點(diǎn)以 進(jìn)行克?。﹥H在少數(shù)幾個(gè)循環(huán)中對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行再次擴(kuò)增。在第二擴(kuò)增步驟之前,可將第一 擴(kuò)增步驟(非標(biāo)記的引物)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行凝膠純化以去除多余的引物?;蛘?,可引 入啟動(dòng)子序列,其使得可以轉(zhuǎn)錄成RNA用于核糖體展示。除了限制性位點(diǎn)以外,還可以引入 重組位點(diǎn)(如Cre-Lox或T0P0位點(diǎn)),其允許定點(diǎn)插入到適當(dāng)?shù)妮d體中。
[0158] 然后,可將編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)VH和VL結(jié)構(gòu)域的經(jīng)擴(kuò)增基因區(qū)段克隆到適合于 表達(dá)VH/VL組合為功能性抗原結(jié)合多肽的載體中。例如,首先,可將來自B細(xì)胞池(或未進(jìn) 行任何B細(xì)胞選擇的其它淋巴組織)的經(jīng)擴(kuò)增VHCH1/VKCK/VLCL基因區(qū)段分別克隆為單獨(dú) 的文庫(最初的文庫),然后在第二步中,可通過切下輕鏈片段并將其連接到編碼重鏈片段 的載體中組裝成Fab或scFv文庫。所述兩步程序支持大型文庫的構(gòu)建,因?yàn)镻CR產(chǎn)物的克 隆是相對(duì)低效的(由于限制性酶的消化效果欠佳所致)。通過基于擴(kuò)增子序列中少部分重 疊的重疊剪接延伸PCR(splicing-by-〇verlap extension,SOE)可生成編碼scFv的DNA片 段;在PCR中,通過將編碼VH和VL的擴(kuò)增子與編碼接頭的小DNA片段混合,由于其重疊序 列而形成單個(gè)DNA片段。
[0159] 可以將包含編碼VH和VL之基因區(qū)段的擴(kuò)增子克隆到噬菌體或噬菌粒載體中,其 允許通過使用基于噬菌體展示的選擇方法來選擇靶標(biāo)特異性抗體片段。或者,可將擴(kuò)增子 克隆到允許在酵母細(xì)胞上(如Fab、scFv或全長IgG)或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上(如IgG)展示 的表達(dá)載體中。
[0160] 在另一些實(shí)施方案中,可通過使用核糖體展示的擴(kuò)增子來避免克隆,其中在擴(kuò)增 引物中包含17(或其它)啟動(dòng)子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在針對(duì)結(jié)合靶抗原的選擇后,克隆 該池并對(duì)各個(gè)克隆進(jìn)行分析。因?yàn)槲膸斓目寺『褪删w的選擇僅限于1〇 1(1至10 12個(gè)克隆, 所以從理論上講,與噬菌體展示文庫方法相比,使用該方法可采樣到更多的免疫庫(immune repertoire)〇
[0161] 當(dāng)使用B細(xì)胞分選時(shí),可將包含單個(gè)靶標(biāo)特異性B細(xì)胞之編碼VH或VL的基因區(qū) 段的擴(kuò)增子直接克隆到細(xì)菌或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中用于產(chǎn)生抗體片段(scFv或Fab)或甚 至全長的IgG。
[0162] 在"文庫構(gòu)建"方法的一個(gè)特定的非限制性實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了用于生產(chǎn) 編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體之VH和VL結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體文庫的方法,所述方法包括以下步 驟:
[0163] a)主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物,從而產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體;
[0164] b)從包含來自所述經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物(包括但不限于大羊駝或羊駝)的淋巴組織 (例如循環(huán)B細(xì)胞)的樣品制備cDNA或基因組DNA ;
[0165] c)擴(kuò)增所述cDNA或基因組DNA的區(qū)域以獲得這樣的擴(kuò)增基因區(qū)段,每個(gè)基因區(qū)段 包含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體之VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體 之VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列;以及
[0166] d)將c)中獲得的基因區(qū)段克隆到表達(dá)載體中,使得每個(gè)表達(dá)載體都包含編碼VH 結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,并且指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和所述VL結(jié) 構(gòu)域之抗原結(jié)合多肽的表達(dá),由此得到表達(dá)載體文庫,其特征在于所述抗原結(jié)合多肽與靶 抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%,或 者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0167] 上述方法可用于制備駱駝科動(dòng)物編碼之VH和VL結(jié)構(gòu)域(特別是大羊駝和羊駝的 VH和VL結(jié)構(gòu)域)的文庫,其適于將VH/VL組合表達(dá)為有功能的抗原結(jié)合多肽,例如以scFv、 Fab或全長抗體的形式。
[0168] 根據(jù)上述方法制備的編碼駱駝科動(dòng)物(包括但不限于大羊駝或羊駝)VH和VL結(jié) 構(gòu)域的表達(dá)載體文庫也構(gòu)成了本發(fā)明主題的一部分。
[0169] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了編碼Fab或scFv分子的噬菌體載體文 庫,其中所述文庫中編碼的每個(gè)Fab或scFv均包含駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的VH結(jié)構(gòu)域和駱 駝科動(dòng)物常規(guī)抗體的VL結(jié)構(gòu)域。
[0170] 在一個(gè)實(shí)施方案中,文庫是"多樣性"文庫,其中所述文庫中的大部分克隆編碼具 有獨(dú)特氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域和/或具有獨(dú)特氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域,包括駱駝科動(dòng)物 VH結(jié)構(gòu)域和駱駝科動(dòng)物VL結(jié)構(gòu)域的多樣性文庫。因此,就VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的氨 基酸序列而言,多樣性文庫中的大部分克隆(例如大于90% )編碼的VH/VL對(duì)與同一文庫 中編碼的任何其它VH/VL對(duì)是不同的。
[0171] 本發(fā)明還包括涵蓋編碼VH和VL之基因區(qū)段的表達(dá)載體,所述基因區(qū)段分離自駱 駝科動(dòng)物(例如大羊駝或羊駝)之單獨(dú)選出的B細(xì)胞。
[0172] 在另一個(gè)方面,本發(fā)明還提供了選擇如下表達(dá)載體的方法,所述表達(dá)載體編碼與 靶抗原免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合多肽,所述方法包括以下步驟:
[0173] i)提供表達(dá)載體文庫,其中所述文庫中的每個(gè)載體都包含編碼VH結(jié)構(gòu)域的基因 區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,其中所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)來自于 駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體,并且其中所述文庫中的每個(gè)載體都指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié) 構(gòu)域之抗原結(jié)合多肽的表達(dá);
[0174] ii)就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由所述文庫編碼的抗原結(jié)合多肽,并由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體,其特征在于所述抗原結(jié)合 多肽與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少 90%,或者至少95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0175] 本發(fā)明的此方法涵蓋從編碼VH/VL對(duì)的克隆文庫篩選/選擇與靶抗原免疫反應(yīng)的 克隆,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一 性的多肽抗原。所述方法還可涵蓋文庫構(gòu)建,其可使用如上所述的文庫構(gòu)建方法進(jìn)行。如 下所述,可針對(duì)所選克隆進(jìn)行任選的下游處理/優(yōu)化步驟。該選擇和篩選的方法也可構(gòu)成 上述用于生產(chǎn)本發(fā)明抗原結(jié)合多肽之一般方法的一部分。因此,被描述為涉及本發(fā)明的這 一方面的優(yōu)選或有利的任何特征也可被認(rèn)為涉及一般方法是優(yōu)選或有利的,反之亦然,除 非另有說明。
[0176] 與靶抗原免疫反應(yīng)之克降的篩詵和詵擇
[0177] 篩選/選擇通常包括將由文庫中克隆編碼的表達(dá)產(chǎn)物(即以抗原結(jié)合多肽形式的 VH/VL對(duì),例如Fab、scFv或抗體)與靶抗原接觸,并選擇所編碼的VH/VL對(duì)表現(xiàn)出期望的 抗原結(jié)合特性(即與靶抗原結(jié)合)的一個(gè)或更多個(gè)克隆,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述 駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0178] 噬菌體展示文庫可在固定化的靶抗原或可溶性(通常是生物素化的)的靶抗原上 進(jìn)行選擇。由于其以單體存在并在噬菌體上以單價(jià)展示,所以Fab形式允許親和力驅(qū)動(dòng)的 選擇,這對(duì)于scFv (由于聚集并在噬菌體上以多價(jià)展示的結(jié)果)和IgG(二價(jià)形式)是不適 用的。通常需要兩到三輪的選擇才能獲得足夠富集的靶標(biāo)特異性結(jié)合物。
[0179] 親和力驅(qū)動(dòng)的選擇可通過在后續(xù)幾輪選擇中降低靶抗原量來進(jìn)行,而使用非生物 素化靶標(biāo)進(jìn)行延長洗滌能夠鑒定出具有極佳親和力的結(jié)合物。
[0180] 該選擇程序能讓使用者追蹤(home in on)某些表位;而從固定化祀標(biāo)上洗脫噬菌 體克隆的經(jīng)典方法是基于pH休克(其使得抗體片段和/或靶標(biāo)變性),與針對(duì)靶抗原的參 照mAb或可溶性受體或細(xì)胞因子的競(jìng)爭導(dǎo)致展示出與靶標(biāo)相關(guān)表位結(jié)合的抗體片段的噬 菌體得以洗脫(這自然也適用于其它展示系統(tǒng),包括B細(xì)胞選擇方法)。
[0181] 使用從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液制備的周質(zhì)級(jí)分(片段從細(xì)胞中"泄漏"入其中),可將 從選擇產(chǎn)物中取得的單個(gè)克隆用于小規(guī)??乖Y(jié)合多肽(例如抗體片段)的生產(chǎn)。表達(dá)可 由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如lac啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng),這意味著添加誘導(dǎo)劑(IPTG)后,啟動(dòng)片段的產(chǎn) 生。前導(dǎo)序列確保了片段向周質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),其中將片段適當(dāng)?shù)卣郫B并形成分子內(nèi)二硫橋。
[0182] 由此產(chǎn)生的粗蛋白級(jí)分可用于靶標(biāo)結(jié)合測(cè)定,例如ELISA。對(duì)于結(jié)合研究來說,從 單個(gè)克隆制備的噬菌體可用來克服Fab的低表達(dá)產(chǎn)量(其通常給出非常低的結(jié)合信號(hào))。 還可以使用體外受體-配體結(jié)合測(cè)定來篩選這些蛋白質(zhì)級(jí)分,以鑒定拮抗抗體;可以使用 基于ELISA的受體-配體結(jié)合測(cè)定,還可以使用如Alphascreen的高通量測(cè)定。也可以在 放射性標(biāo)記的配體結(jié)合測(cè)定中進(jìn)行篩選,其中將過表達(dá)受體之細(xì)胞系的膜級(jí)分固定;后一 測(cè)定極其靈敏,因?yàn)橹恍枰つ柫康姆派湫约?xì)胞因子,這意味著粗蛋白質(zhì)級(jí)分中存在極 少量的拮抗性Fab就會(huì)給出陽性讀數(shù)?;蛘撸蓱?yīng)用FACS來篩選抗體,其抑制了熒光標(biāo)記 的細(xì)胞因子與細(xì)胞上表達(dá)的其受體的結(jié)合,而FMAT是該方法的高通量變體。
[0183] 可以將存在于周質(zhì)級(jí)分中的或者通過其六組氨酸標(biāo)簽上的IMAC部分純化的或者 通過蛋白G(已知與Fab的CH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合)進(jìn)行部分純化的Fab直接用于使用細(xì)胞的生 物測(cè)定(其對(duì)細(xì)菌雜質(zhì)不敏感)中;或者,可以在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中再克隆來自單個(gè)大腸桿菌 (E. coli)細(xì)胞的Fab以用于Fab或IgG的表達(dá),并隨后在生物測(cè)定中進(jìn)行篩選。
[0184] 在鑒定陽性表達(dá)載體克?。淳幋a與期望靶抗原結(jié)合的功能性VH/VL組合的克 ?。┖螅R?guī)地確定該可變區(qū)的核苷酸序列,并據(jù)此推導(dǎo)出所編碼的VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基 酸序列。
[0185] 如果需要,可將Fab (或scFv)編碼區(qū)再克隆到另一表達(dá)平臺(tái)(例如,細(xì)菌表達(dá)載 體(除了沒有用于在噬菌體上展示所必需的基因3以外,其與噬菌粒載體相同))中,這實(shí) 現(xiàn)更大量的編碼片段的生產(chǎn)和純化。
[0186] 可通過表面胞質(zhì)基因共振(例如Biacore)或經(jīng)由其它方法確定純化的Fab (或 scFv)的靶標(biāo)結(jié)合親和力以及使用體外受體-配體結(jié)合測(cè)定和基于細(xì)胞的測(cè)定來測(cè)試中和 效力。
[0187] 抗原結(jié)合的家族(特別是拮抗性Fab (或scFv))可基于序列分析(主要是VH,特 別是VH結(jié)構(gòu)域的CDR3的長度和氨基酸序列)來鑒定。
[0188] 效力優(yōu)化
[0189] 如有需要,可對(duì)通過篩選/選擇鑒定出的編碼對(duì)期望靶抗原具有親和力的VH/VL 組合之克隆進(jìn)行下游步驟,其中對(duì)親和力和/或中和效力進(jìn)行優(yōu)化。
[0190] 每個(gè)VH家族表現(xiàn)最佳的成員的效力優(yōu)化可以通過輕鏈改組、重鏈改組或其組合 來實(shí)現(xiàn),從而選出在動(dòng)物中天然存在的親和力變體。這在一些實(shí)施方案中是特別有利的,其 中最初的駱駝科動(dòng)物VH/VL結(jié)構(gòu)域選自主動(dòng)免疫的駱駝科動(dòng)物,因?yàn)榭墒褂脧耐唤?jīng)免疫 動(dòng)物制備的原始文庫來進(jìn)行鏈改組,從而篩選在同一經(jīng)免疫動(dòng)物中產(chǎn)生的親和力變體。
[0191] 對(duì)于輕鏈改組而言,可使用編碼具有期望抗原結(jié)合特性的VH/VL對(duì)(例如拮抗性 Fab)的VH區(qū)(或VHCH1)的基因區(qū)段來構(gòu)建文庫,其中該編碼VH的單個(gè)基因區(qū)段與文庫 (克隆最初從該文庫中選擇)中的輕鏈庫組合。例如,如果編碼VH的區(qū)段選自通過進(jìn)行主 動(dòng)免疫而引起針對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答之駱駝科動(dòng)物制備的文庫(例如,F(xiàn)ab文庫),那么可 通過將該VH編碼區(qū)段與同一經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物的輕鏈(VL)庫組合來構(gòu)建"鏈改組"文庫。 然后,可利用所得到的文庫來選擇靶抗原,但要在嚴(yán)格的條件(低靶標(biāo)濃度,使用溶液中非 生物素化的靶標(biāo)進(jìn)行徹底洗滌)下,以確保分離出最高親和力的變體。周質(zhì)級(jí)分的解離速 率篩選(off-rate screening)也可有助于鑒定改善的克隆。在經(jīng)過序列分析并再克隆到 細(xì)菌生產(chǎn)載體中后,可對(duì)純化的經(jīng)選擇Fab進(jìn)行親和力(例如通過表面胞質(zhì)基因共振)和 效力(例如通過生物測(cè)定)的測(cè)試。
[0192] 可通過將輕鏈改組后選擇之克隆的編碼輕鏈(VL)的基因區(qū)段克隆回來自于同一 動(dòng)物(原始VH/VL編碼克隆從中選擇)的原始重鏈文庫來進(jìn)行重鏈改組?;蛘?,可使用CDR3 特異性寡核苷酸引物來擴(kuò)增VH區(qū)家族,其可被克隆為與拮抗性Fab的輕鏈組合的庫。然后 親和力驅(qū)動(dòng)的選擇和解離速率篩選可鑒定該家族內(nèi)表現(xiàn)最優(yōu)的VH。
[0193] 應(yīng)當(dāng)理解,輕鏈改組和重鏈改組步驟在實(shí)際中可以以任一順序進(jìn)行,即可先進(jìn)行 輕鏈改組,隨后進(jìn)行重鏈改組,或可先進(jìn)行重鏈改組,隨后進(jìn)行輕鏈改組。這兩種可能性均 涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其他情況下,可不必同時(shí)進(jìn)行輕鏈改組和重鏈改組,因此還涵蓋 了僅包括輕鏈改組或僅包括重鏈改組的方法。
[0194] 由具有改善的親和力和效力的VH/VL對(duì)(例如Fab)的輕鏈或重鏈,特別地,⑶R的 序列可用于生成經(jīng)改造的變體(其中組合了單個(gè)Fab的突變)。已知突變通??梢辕B加,這 意味著將這些突變進(jìn)行組合可得到甚至更高的親和力。
[0195] 為人類治療用涂而講斗于的矛中系m口格式什,(formatting)
[0196] 可以使選定的編碼表現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合特性之VH/VL對(duì)的表達(dá)克?。ɡ缇幋a scFv或Fab的噬菌體克隆)的VH和VL編碼基因區(qū)段進(jìn)行下游處理步驟并再克隆到另外的 表達(dá)平臺(tái),例如編碼適合于人類治療用途之抗原結(jié)合多肽形式的載體(例如,具有完全人 恒定結(jié)構(gòu)域的全長抗體)中。
[0197] 可將有前景的"首選(lead) "經(jīng)選擇克隆改造成在編碼VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域 的核苷酸序列中引入一個(gè)或更多個(gè)變化,所述變化可改變或可不改變編碼的VH結(jié)構(gòu)域和/ 或VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。VH或VL結(jié)構(gòu)域序列中的這些變化可根據(jù)本文中別處所述的任 何目的進(jìn)行改造,包括種系化或人源化、密碼子優(yōu)化、增強(qiáng)的穩(wěn)定性和優(yōu)化的親和力等。
[0198] 本文所述的種系化的一般原則同樣適用于本發(fā)明的該實(shí)施方案。例如,可以在其 框架區(qū)(FR)中通過應(yīng)用文庫方法來將包含駱駝科動(dòng)物編碼的VH和VL結(jié)構(gòu)域的首選克隆 種系化。如W0 2010/001251和W0 2011/080350中所述,在與最接近的人種系(針對(duì)VH和 VL)以及與具有相同⑶R1和⑶R2典型折疊的其它人種系比對(duì)之后,即可鑒定在FR中被改 變的殘基,并選擇優(yōu)選的人殘基。雖然種系化可以包括使用來自于最匹配人種系的等效殘 基來取代駱駝科動(dòng)物編碼的殘基,但是這不是必需的,也可使用來自于其它人種系的殘基。
[0199] 一旦已知首選的VH和VL結(jié)構(gòu)域(需要時(shí),在效力優(yōu)化后)的氨基酸序列,即可設(shè) 計(jì)VH和VL的合成基因,其中與人種系不同的殘基被優(yōu)選的人殘基(來自于最匹配的人種 系,或使用出現(xiàn)在其它人種系中的殘基,或者甚至是駱駝科動(dòng)物野生型的殘基)取代。在該 階段,可以將編碼可變結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段再克隆到表達(dá)載體中,其中使其在基因合成中或 通過克隆到合適的展示載體中而與人的Fab恒定區(qū)融合。
[0200] 可將所得的VH和VL合成基因重組到Fab文庫中,或者可將經(jīng)種系化的VH與野生 型VL重組(反之亦然,稱為"雜合"文庫)。親和力驅(qū)動(dòng)的選擇允許分離出表現(xiàn)最優(yōu)的種系 化形式,就"雜合"文庫而言,可將表現(xiàn)最優(yōu)的種系化VH與表現(xiàn)最優(yōu)的種系化VL進(jìn)行重組。 [0201] 可使用經(jīng)種系化之Fab的氨基酸和核苷酸序列信息來生成經(jīng)密碼子優(yōu)化的合 成基因以產(chǎn)生優(yōu)選同種型(IgGl (適用于ADCC和CDC)、IgG2 (適用于有限的效應(yīng)功能)、IgG4(類似于IgG2,但當(dāng)單價(jià)結(jié)合時(shí)需要))的全長人IgG。對(duì)于非長期的應(yīng)用和快速指示, 也可產(chǎn)生細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的人Fab。
[0202] 在一個(gè)具體的非限制性實(shí)施方案中,組合上述方法步驟,本發(fā)明提供了生產(chǎn)編碼 與靶抗原免疫反應(yīng)之嵌合抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體的方法,所述方法包括以下步驟:
[0203] a)主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物(包括但不限于大羊駝或羊駝),從而產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的 常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體;
[0204] b)從包含來自于所述經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物的淋巴組織(例如循環(huán)B細(xì)胞)的樣品制 備cDNA或基因組DNA;
[0205] c)擴(kuò)增所述cDNA或基因組DNA的區(qū)域以獲得如下經(jīng)擴(kuò)增的基因區(qū)段,每個(gè)基因區(qū) 段包含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體之VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗 體之VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列;
[0206] d)將c)中獲得的基因區(qū)段克隆到表達(dá)載體中,使得每個(gè)表達(dá)載體包含編碼VH結(jié) 構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,并且指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的 抗原結(jié)合多肽的表達(dá),由此產(chǎn)生了表達(dá)載體文庫;
[0207] e)就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由步驟d)中獲得的文庫編碼的抗原結(jié)合 多肽,并且由此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體;
[0208] f)任選地,進(jìn)行輕鏈改組步驟和/或重鏈改組步驟以選擇表達(dá)載體,所述表達(dá)載 體編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)的經(jīng)效力優(yōu)化的抗原結(jié)合多肽;
[0209] g)任選地,對(duì)編碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和/或編 碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段進(jìn)行種系化和/或密碼子優(yōu)化;以 及
[0210] h)將編碼部分e)或f)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段或步驟g)中產(chǎn)生的經(jīng) 種系化和/或密碼子優(yōu)化的VH基因區(qū)段以及編碼部分e)或f)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的 基因區(qū)段或步驟g)中產(chǎn)生的經(jīng)種系化和/或密碼子優(yōu)化的VL基因區(qū)段克隆到另一表達(dá)載 體中,并與編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列進(jìn)行有效連接,從而產(chǎn)生 編碼包含與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域相融合的所述VH和VL結(jié)構(gòu)域之嵌合抗原結(jié) 合多肽的表達(dá)載體,其特征在于所述抗原結(jié)合多肽與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是表 現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90 %,或者至少95 %、96%、97 %或98 %氨 基酸序列同一'丨生的多肽抗原。
[0211] 本發(fā)明還延伸到根據(jù)上述方法制備的表達(dá)載體,并延伸到產(chǎn)生與靶抗原免疫反應(yīng) 之抗原結(jié)合多肽的方法,所述方法包括以下步驟:
[0212] a)使用上述方法制備編碼與靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體;
[0213] b)在允許所編碼的抗原結(jié)合多肽表達(dá)的條件下,將所述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞或 無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中;以及
[0214]c)回收所表達(dá)的抗原結(jié)合多肽,其特征還在于所述抗原結(jié)合多肽與靶抗原特異 性結(jié)合,所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%,或者至少 95%、96%、97%或98%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
[0215] 在一個(gè)實(shí)施方案中,后一方法涵蓋通過重組表達(dá)進(jìn)行的本發(fā)明抗原結(jié)合多肽的批 量生產(chǎn),特別是旨在用作藥學(xué)活性劑之治療性抗體的批量生產(chǎn)。在這樣的實(shí)施方案中,選擇 步驟a)中制備的表達(dá)載體和步驟b)中使用的宿主細(xì)胞/表達(dá)系統(tǒng)以適于大規(guī)模生產(chǎn)旨在 向人患者施用的重組抗體。用于該目的的合適載體和表達(dá)系統(tǒng)的一般特征是本領(lǐng)域公知 的。
[0216] 將參照以下非限制性實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0217]實(shí)駘實(shí)施例
[0218]實(shí)施例1-針對(duì)HMGB1的抗體
[0219] 1. 1靶抗原
[0220] 該實(shí)施例的靶抗原是高遷移率族1 (HMGB1),在幾乎所有細(xì)胞類型的細(xì)胞核和細(xì)胞 質(zhì)中高度保守的、普遍存在的蛋白質(zhì)。人和小鼠HMGB1具有215aa的長度和97%的序列同 一性。HMGB1是非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因功能調(diào)節(jié)子,但是其還可作為警報(bào)素 (alarmin)〇
[0221] 已將HMGB1與炎性病癥相聯(lián)系,例如膿毒癥(sepsis)、SLE和RA,以及多種癌癥。
[0222] 專注于該靶標(biāo)的原因之一為其是極度保守的靶標(biāo)并且由于免疫系統(tǒng)移除自身 抗體而難以通過主動(dòng)免疫產(chǎn)生抗體。HMGB1是高度保守的,如由在人與小鼠/大鼠蛋 白質(zhì)之間有97%的氨基酸序列同一性的事實(shí)所說明。為了評(píng)估人與大羊駝HMGB1之 間的保守度,在來自羊騎(Lama pacos)的全基因組鳥槍序列數(shù)據(jù)庫(Whole Genome Shotgun sequence database)上用人 HMGB1 序列來進(jìn)行同源 BLAST 檢索(www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/206581138) 〇這些檢索鑒定了三個(gè)基因組序列,其中一個(gè)包含前 兩個(gè)外顯子(序列ID:ABRR01273630. 1)并且另一個(gè)編碼第四個(gè)和最后一個(gè)外顯子(序 列ID:ABRR01273631.1),而基因的中間部分是由另一個(gè)命中(hit)編碼的(序列ID: ABRR01227803. 1),表明大羊駝HMGB1基因的組織與人基因組織相同。人與大羊駝HMGB1之 間的總序列同一性是96%,盡管已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了來自全基因組鳥槍數(shù)據(jù)庫的序列不是完全可靠 的并且可包含測(cè)序誤差。
[0223]1. 2免疫大羊駝
[0224] 使用弗氏不完全佐劑用重組HMGBl(HMGBiotech,HM114)對(duì)四只大羊駝進(jìn)行免疫。 在第一次注射期間,給予80 y g的靶蛋白質(zhì),隨后進(jìn)行每兩周施用一次40 y g的靶蛋白質(zhì)的 四次注射。在最后一次注射之后三天,取400ml血液進(jìn)行PBL的純化。
[0225]1. 3 構(gòu)律 Fab t?庫
[0226] 將從用在費(fèi)氏不完全佐劑中之HMGB1抗原免疫的四只大羊駝中分離的PBL用于 尺隱提取,使用由〇6他 &^11等,1.81〇1.〇16111.274,1999描述的兩步克隆方案在噬菌粒 (pCB3)中進(jìn)行Fab的RT-PCR和PCR克隆。對(duì)于抗體庫的擴(kuò)增而言,應(yīng)用在W0 2010/001251 中所述的擴(kuò)增引物。
[0227] 使用兩步PCR來構(gòu)建獨(dú)立的VAC入和VkCk文庫,其中用未標(biāo)記的引物進(jìn)行25 個(gè)循環(huán),接著用這些引物的標(biāo)記形式(包含用于庫克隆的限制性位點(diǎn))進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。使 用同一方法平行建立VHCH1文庫。用于VH、VX和Vk基因擴(kuò)增的一系列引物可見于TO 2010/001251中。在pCB3中制造初級(jí)重鏈和輕鏈文庫,這些文庫的大小范圍為從IX 107個(gè) 至 3X 108個(gè)克隆(colony)。
[0228] 接著,將來自初級(jí)VACX和VkCk文庫的輕鏈編碼插入物分別再克隆到VHCH1 表達(dá)載體中以分別產(chǎn)生"A"和" K"Fab文庫。通過PCR常規(guī)進(jìn)行的文庫質(zhì)量控制觀察具 有全長Fab插入的克隆的百分比。所獲得的Fab文庫是大的,具有2X108至9X108個(gè)克隆 的大小。從每個(gè)文庫隨機(jī)測(cè)試的大量克隆包含全長Fab序列,表明文庫的高質(zhì)量。
[0229]1. 4HMGB1特異件Fab的詵擇
[0230] 使用噬菌體展示來募集(recruit)與直接包被的HMGB1相結(jié)合的不同組(panel) 的大羊駝Fab。在四輪選擇之后,通過使用胰蛋白酶洗脫獲得了良好的富集。
[0231] 使來源于這些選擇的各克隆在96深孔板中生長(1ml表達(dá))并且制備噬菌體并在 噬菌體結(jié)合 ELISA 中測(cè)試。簡言之,在 HMGBl(100ng/100ii 1,Genway (10-663-46237))和 酪蛋白包被的孔上孵育來源于各克隆的噬菌體以測(cè)定針對(duì)HMGB1的特異性結(jié)合。使用抗 M13-HRP 抗體(GE Healthcare,27-9421-01)來檢測(cè)噬菌體結(jié)合。
[0232] 為了測(cè)試與HMGB1特異性結(jié)合的克隆的序列多樣性,進(jìn)行指紋圖譜 (fingerprint)分析。因此,通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)來擴(kuò)增這些克隆之編碼Fab的插入物。用 限制性內(nèi)切酶Haelll和Alul來消化PCR片段并且將所消化的樣品在2. 5%的瓊脂糖凝膠 上跑樣。一些克隆/指紋圖譜出現(xiàn)了多次(結(jié)果未示出),但是總體而言,多樣性很高。
[0233] 使具有獨(dú)特指紋圖譜的克隆再次在96深孔板中生長(1ml表達(dá))并且制備噬菌 體和周質(zhì)提取物,其分別在噬菌體ELISA和Fab ELISA中對(duì)HMGB1結(jié)合再測(cè)試(數(shù)據(jù)未示 出)。在這兩種情況下,大多數(shù)克隆的HMGB1結(jié)合再次取得了陽性。
[0234] 對(duì)于每個(gè)克隆,測(cè)定了VH和VX二者或Vk片段的序列?;贖CDR3序列總共獲 得了 6個(gè)不同VH家族,其包含VH和V A親和力變體,即含有體細(xì)胞突變。發(fā)現(xiàn)了含有V入 和Vk輕鏈的兩種克隆。
[0235] 表1.所有HMGB1結(jié)合克隆之最接近的人種系和%人同一性以及%人同源性。
[0236]
【權(quán)利要求】
1. 分離的抗原結(jié)合多肽,其包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL 結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)獲得自駱駝科(Camelidae)物種的VH或 VL結(jié)構(gòu)域,其特征在于所述抗原結(jié)合多肽與靶抗原特異性結(jié)合,所述靶抗原是在序列比較 窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原, 所述序列比較窗口至少包括所述抗原結(jié)合多肽之表位,或者包括包含所述抗原結(jié)合多肽之 表位的所述靶抗原的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域,或者全長的所述靶抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述靶抗原是高度保守抗原,其 中所述高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽,所述多肽在所述序列比較 窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質(zhì)具有至少90 %的氨基酸序列同一性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述高度保守抗原在所述序列比 較窗口表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質(zhì)具有至少95 %的氨基酸序列同一性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述高度保守抗原是來自選 自以下之物種的多肽:人、非人靈長類動(dòng)物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、牛或雞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述高度保守抗原 是人多膚。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述靶抗原是來自所述駱駝科物 種的自身抗原或者在所述序列比較窗口表現(xiàn)出與所述駱駝科自身抗原具有至少90 %氨基 酸序列同一性的駱駝科動(dòng)物來源的抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述靶抗原是獲得自所述駱駝科 物種之抗體的可變區(qū)或者在包括所述抗體整個(gè)可變區(qū)的序列比較窗口表現(xiàn)出與獲得自所 述駱駝科物種之抗體的可變區(qū)具有至少90%氨基酸序列同一性的變體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述駱駝科物種選 自駱駝、大羊駝、單峰駝、駱馬、原駝和羊駝。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中所述駱駝科物種是大羊駝(Lama glama)〇
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其中在所述VH結(jié)構(gòu)域和 所述VL結(jié)構(gòu)域兩者中的每個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)均獲得自駱駝科物種的VH或VL結(jié)構(gòu)域。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其是嵌合多肽,所述嵌合 多肽包含具有由人免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列或與其具有至少90%同一性的氨基 酸序列的至少一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域,或者所述嵌合多肽包含人抗體的完整恒定區(qū)。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的抗原結(jié)合多肽,其是與所述靶抗原特異 性結(jié)合的嵌合羊駝屬-人抗體,所述抗原結(jié)合多肽包含成對(duì)的VH和VL結(jié)構(gòu)域,其中所述VH 結(jié)構(gòu)域和所述VL結(jié)構(gòu)域各自與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)IgG恒定結(jié)構(gòu)域配對(duì),并且其中所述 VH和VL結(jié)構(gòu)域包含來源于通過使用所述靶抗原主動(dòng)免疫所述羊駝屬物種所獲得之常規(guī)抗 體的高變環(huán)。
13. 多核苷酸分子,其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合多肽,或者編 碼所述抗原結(jié)合多肽的片段,所述片段包含獲得自駱駝科物種之VH或VL結(jié)構(gòu)域的至少一 個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
14. 表達(dá)載體,其包含與允許所述抗原結(jié)合多肽在宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá) 的調(diào)節(jié)序列有效連接的權(quán)利要求13所述的多核苷酸分子。
15. 宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),其包含權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體。
16. 生產(chǎn)重組抗原結(jié)合多肽的方法,其包括在允許所述抗原結(jié)合多肽表達(dá)的條件下培 養(yǎng)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)并且回收所表達(dá)的抗原結(jié)合多肽。
17. 藥物制劑,其包含根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合多肽和至少一種 可藥用稀釋劑、賦形劑或載體。
18. 用于制備與靶抗原特異性結(jié)合的重組抗原結(jié)合多肽的方法,所述抗原結(jié)合多肽包 含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域,其中所述VH結(jié)構(gòu)域或所述VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)高變環(huán)或互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)獲得自駱駝科物種,所述方法包括以下步驟: (a) 免疫駱駝科物種,由此產(chǎn)生針對(duì)所述靶抗原的常規(guī)抗體; (b) 分離駱駝科核酸,其編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)的駱駝科常規(guī)抗體的VH和/或VL 結(jié)構(gòu)域之至少一個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R); (c) 制備包含編碼如下高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)之核苷酸序列的多核苷酸,所述高變環(huán)或 互補(bǔ)決定區(qū)具有與由步驟(a)分離的核酸編碼的高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)一致的氨基酸序列, 所述多核苷酸編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)(或特異性結(jié)合)之包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域 的抗原結(jié)合多肽;以及 (d) 由步驟(c)的重組多核苷酸表達(dá)所述抗原結(jié)合多肽,其中所述抗原結(jié)合多肽與部 分(b)的駱駝科常規(guī)抗體不一致,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種 的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中步驟(b)包括分離編碼所述抗體的VH結(jié)構(gòu)域 和/或VL結(jié)構(gòu)域的駱駝科核酸以及改變所述核酸的序列使得其編碼具有一個(gè)或更多個(gè)氨 基酸替換、缺失或者添加的VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法,其中在步驟(c)中制備的所述重組多核苷酸還 包含編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述駱駝科物種是駱駝、大羊駝、 單峰駝、駱馬、原駝或羊駝。
22. 用于生產(chǎn)編碼駱駝科常規(guī)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域之表達(dá)載體文庫的方法,所述方法 包括以下步驟: a) 主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物,從而產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗體; b) 由包含來自所述經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物的淋巴組織(例如循環(huán)B細(xì)胞)的樣品制備cDNA 或基因組DNA ; c) 擴(kuò)增所述cDNA或基因組DNA的區(qū)域以獲得這樣的經(jīng)擴(kuò)增基因區(qū)段,每個(gè)基因區(qū)段包 含編碼駱駝科常規(guī)抗體之VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科常規(guī)抗體之VL結(jié)構(gòu)域 的核苷酸序列;以及 d) 將c)中獲得的所述基因區(qū)段克隆到表達(dá)載體中,使得每個(gè)表達(dá)載體都包含編碼VH 結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,并且指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和所述VL結(jié) 構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽的表達(dá),由此得到表達(dá)載體文庫,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出與 來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
23. 用于制備編碼與靶抗原免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合多肽之表達(dá)載體的方法,所述方法包 括以下步驟: i) 使用權(quán)利要求22所述的方法制備表達(dá)載體文庫; ii) 就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由所述文庫編碼的抗原結(jié)合多肽,并由此選擇 編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出 與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法,其包括另外的步驟iii),在所述步驟iii)中將編碼 部分(ii)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼部分(ii)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的 基因區(qū)段克隆到另外的表達(dá)載體中,與編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的核苷酸序 列有效連接,由此產(chǎn)生編碼包含與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域相融合的步驟ii)中 所選VH和VL結(jié)構(gòu)域之嵌合抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法,其中在克隆到所述另外的表達(dá)載體之前,改造編碼 部分(ii)中所選載體之所述VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和/或編碼部分(ii)中所選載體之所 述VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段以在編碼所述VH和/或所述VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列中引入一個(gè) 或更多個(gè)變化。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法,其還包括輕鏈改組方法,所述輕鏈改組方法包括以 下步驟: iii) 制備表達(dá)載體的第二文庫,其中所述文庫中的每個(gè)載體包含編碼VL結(jié)構(gòu)域的基 因區(qū)段和編碼步驟ii)中所選表達(dá)載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段; iv) 就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由所述第二文庫編碼的抗原結(jié)合多肽,并且由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法,其包括另外的步驟V),在所述步驟V)中將編碼部分 (iv)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼部分(iv)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的基因 區(qū)段克隆到另外的表達(dá)載體中,與編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列有 效連接,由此產(chǎn)生編碼包含與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域相融合的步驟iv)中所選 VH和VL結(jié)構(gòu)域之嵌合抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法,其中在克隆到所述另外的表達(dá)載體之前,改造編碼 部分(iv)中所選載體之所述VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和/或編碼部分(iv)中所選載體之所 述VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段以在編碼所述VH和/或所述VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列中引入一個(gè) 或更多個(gè)變化。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法,其還包括重鏈改組方法,所述重鏈改組方法包括以 下步驟: V)制備表達(dá)載體的第三文庫,其中所述文庫中的每個(gè)載體包含編碼VH結(jié)構(gòu)域的基因 區(qū)段和編碼步驟iv)中所選表達(dá)載體之所述VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段; vi)就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由所述第三文庫編碼的抗原結(jié)合多肽,并且由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法,其包括另外的步驟vii),在所述步驟vii)中將編碼 部分(vi)中所選載體之所述VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼部分(vi)中所選載體之所述VL 結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段克隆到另外的表達(dá)載體中,與編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的 核苷酸序列有效連接,由此產(chǎn)生編碼包含與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域相融合的步 驟Vi)中所選載體的VH和VL結(jié)構(gòu)域之嵌合抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法,其中在克隆到所述另外的表達(dá)載體之前,改造編碼 部分(vi)中所選載體之所述VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和/或編碼部分(vi)中所選載體之所 述VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段以在編碼所述VH和/或所述VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列中引入一個(gè) 或更多個(gè)變化。
32. 用于生產(chǎn)編碼與靶抗原免疫反應(yīng)之嵌合抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體的方法,所述方 法包括以下步驟: a) 主動(dòng)免疫駱駝科動(dòng)物(大羊駝或羊駝),從而產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的常規(guī)駱駝科動(dòng)物抗 體; b) 從包含來自于所述經(jīng)免疫駱駝科動(dòng)物的淋巴組織(例如循環(huán)B細(xì)胞)的樣品制備 cDNA或基因組DNA ; c) 擴(kuò)增所述cDNA或基因組DNA的區(qū)域以獲得這樣的經(jīng)擴(kuò)增基因區(qū)段,每個(gè)基因區(qū)段包 含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體之VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動(dòng)物常規(guī)抗體之 VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列; d) 將c)中獲得的所述基因區(qū)段克隆到表達(dá)載體中,以使得每個(gè)表達(dá)載體包含編碼VH 結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和編碼VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段,并且指導(dǎo)包含所述VH結(jié)構(gòu)域和所述VL結(jié) 構(gòu)域的抗原結(jié)合多肽的表達(dá),由此產(chǎn)生表達(dá)載體文庫; e) 就與所述靶抗原的免疫反應(yīng)性,篩選由步驟d)中獲得的所述文庫編碼的抗原結(jié)合 多肽,并且由此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的表達(dá)載體; f) 任選地,進(jìn)行輕鏈改組步驟和/或重鏈改組步驟以選擇表達(dá)載體,所述表達(dá)載體編 碼與所述靶抗原免疫反應(yīng)之經(jīng)效力優(yōu)化的抗原結(jié)合多肽; g) 任選地,對(duì)編碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段和/或編碼步 驟e)或步驟f)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段進(jìn)行種系化和/或密碼子優(yōu)化;以及 h) 將編碼部分e)或f)中所選載體之VH結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)段或者步驟g)中產(chǎn)生的經(jīng)種 系化和/或密碼子優(yōu)化的VH基因區(qū)段以及編碼部分e)或f)中所選載體之VL結(jié)構(gòu)域的基 因區(qū)段或者步驟g)中產(chǎn)生的經(jīng)種系化和/或密碼子優(yōu)化的VL基因區(qū)段克隆到另外的表達(dá) 載體中,與編碼人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列有效連接,從而產(chǎn)生編碼 包含與人抗體的一個(gè)或更多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域相融合的所述VH和VL結(jié)構(gòu)域之嵌合抗原結(jié)合多 肽的表達(dá)載體,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物種的蛋白質(zhì)具有至少 90 %氨基酸序列同一性的多肽抗原。
33. 用于生產(chǎn)與靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合多肽的方法,所述方法包括以下步驟: a) 使用權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)所述的方法制備編碼與靶抗原免疫反應(yīng)之抗原結(jié)合 多肽的表達(dá)載體; b) 在允許所編碼的抗原結(jié)合多肽表達(dá)的條件下,將所述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞或無細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)中;以及 c) 回收所表達(dá)的抗原結(jié)合多肽,其特征在于所述靶抗原是表現(xiàn)出與來自所述駱駝科物 種的蛋白質(zhì)具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽抗原。
34. 根據(jù)權(quán)利要求18至33中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述靶抗原如權(quán)利要求1至7中 任一項(xiàng)所限定。
【文檔編號(hào)】B01D15/18GK104520317SQ201380038485
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月20日
【發(fā)明者】約翰內(nèi)斯·約斯夫·威廉默斯·德哈德, 克里斯托夫·弗雷德里克·杰羅姆·布朗什托 申請(qǐng)人:阿爾金-X公司