一種單鏈dna核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單鏈DNA核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法，(1)化學(xué)共沉淀法得Fe3O4磁性納米粒子；(2)反相乳液交聯(lián)法得CS/Fe3O4磁性微球；(3)CS/Fe3O4磁性微球加入APTES得-NH2基修飾CS/Fe3O4磁性微球；(4)加入DTPA，在EDC和NHS作用下，得-COOH基修飾CS/Fe3O4磁性微球；(5)加入EDC等溶液，加入牛白蛋白溶液震蕩，得腺苷核酸適配體修飾CS/Fe3O4磁性微球。其克服了常規(guī)物理吸附方法的易脫落、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且顯著提高核酸適配體固載量。
【專利說明】一種單鏈DNA核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)分析測(cè)試領(lǐng)域，具體涉及一種單鏈DNA核酸適配體修飾殼聚糖/Fe3O4磁性微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]樣品分析的第一步為樣品前處理，樣品前處理是整個(gè)樣品分析過程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，所需時(shí)間約占整個(gè)分析時(shí)間的60%，并可能帶來的誤差占整個(gè)分析誤差30%以上，給分析工作帶來不利。傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)如索氏提取、液液萃取、柱色譜等，普遍存在效率低、費(fèi)時(shí)、有毒有機(jī)溶劑用量大及操作較繁瑣等問題，因此發(fā)展高效、快速、簡(jiǎn)單、綠色的樣品前處理技術(shù)尤為重要。生物樣品如尿液、血漿、組織等樣品組成復(fù)雜，存在基體干擾的多樣性和復(fù)雜性，因而還需要發(fā)展高親和力、高選擇性的樣品前處理技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)痕量或超痕量待測(cè)組分的分離與富集。
[0003]1990年Arther和Pawliszyn等提出一種新的樣品前處理技術(shù)_固相微萃取(SPME)，SPME是一種基于氣固吸附(吸收)和液固吸附(吸收)平衡的富集方法，利用分析物對(duì)活性固體表面有一定的吸附(吸收)親合力而達(dá)到分離富集目的的方法。自提出以來，SPME已迅速?gòu)V泛應(yīng)用于食品分析、藥物分析、環(huán)境分析等領(lǐng)域。磁性微球是近20年發(fā)展起來的一種新型功能材料，由磁性納米粒子與其他材料結(jié)合而成。一方面，磁性微球具有磁性納米粒子的超順磁性，可隨外加磁場(chǎng)變化而運(yùn)動(dòng)，從而能與體系快速分離?’另一方面，制備磁性微球的材料非常廣泛，還可通過化學(xué)修飾在微球表面引入各種功能基團(tuán)，如-C00H、-OH、-NH2、-CHO等，與蛋白質(zhì)、抗原、抗體相連接，應(yīng)用于蛋白分離純化、免疫診斷、固定化酶、細(xì)胞分選、靶向藥物等相關(guān)研究。SPME技術(shù)和磁性微球特點(diǎn)的結(jié)合可以發(fā)展一種新的樣品前處理技術(shù)一磁性固相微萃取，該方法基于在磁性物質(zhì)如Fe3O4磁性納米粒子的表面包覆不同材料來吸附、富集樣品中的待測(cè)物質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、效率高、成本低等突出優(yōu)點(diǎn)，為樣品前處理技術(shù)發(fā)展開辟新的途徑，受到分析化學(xué)學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0004]近幾十年，抗體技術(shù)迅速發(fā)展，基于抗體-抗原相互作用的生物識(shí)別體系在分析化學(xué)領(lǐng)域也獲得了較多應(yīng)用。但自從1990年核酸適配體出現(xiàn)以來，受到了研究者們極強(qiáng)的關(guān)注。核酸適配體是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)經(jīng)體外篩選得到的一段短的單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA)。適配體與各種配體的結(jié)合是基于單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的多樣性，它通過鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基間的配對(duì)和靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應(yīng)性折疊，形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，通過各種相互作用與配體間產(chǎn)生高特異性的結(jié)合力。例如，咖啡因與茶堿難以區(qū)分，因二者在結(jié)構(gòu)上只相差一個(gè)甲基。Jenison等從RNA庫(kù)中分離得到與茶堿的親和力比咖啡因高10000倍以上的茶堿適配體(Jenison R.D., Gill S.C., PardiA., and Polisky B.1994.Science263:1425-1429)。核酸適配體除了與抗體一樣能與相應(yīng)配體高效、專一地結(jié)合之外，還具有抗體無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如目標(biāo)物范圍廣、結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力高，穩(wěn)定性好、篩選制備方便、可復(fù)性等。至今篩選出能與目標(biāo)分子結(jié)合的適配體達(dá)到300種以上，這些目標(biāo)分子包括酶、抗體、生長(zhǎng)因子、抗生素、轉(zhuǎn)錄因子、氨基酸、核苷酸、肽、多肽、有機(jī)染料以及重金屬離子，甚至完整的病毒和病原體以及細(xì)胞。
[0005]核酸適配體由于具有上述眾多優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。適配體經(jīng)過化學(xué)修飾后可以固定在各種材料表面，如玻璃、金屬、磁性微球、硅膠、量子點(diǎn)等，應(yīng)用于各類分離技術(shù)，包括生化分析、適配子信標(biāo)、生物傳感器、生物質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳、親和色譜、熒光偏振分析、流式細(xì)胞分析、靶向治療等。Xiao等把一端修飾了亞甲基藍(lán)的凝血酶核酸適配體固載在電極上，這一方法對(duì)凝血酶的檢測(cè)限達(dá)到2X K^mol/L—1 (XiaoY, Lubin A A, Heeger A J, Plaxco K ff.Angew.Chem.1nt.Ed, 2005, 44:5456 - 5459)。Deng 等用特異結(jié)合三磷酸腺苷的適配子作為弱親和固定相分離環(huán)腺苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、腺苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷和腺苷，可實(shí)現(xiàn)高效分離(Deng Q, German I, Buchanan
D,Kennedy R T.Anal Chem.2001, 73: 5415 - 5421)。
[0006]殼聚糖(Chitosan，CS)是甲殼素部分脫乙?；玫綆д姾傻奶烊欢嗵?，無毒，無刺激性，無致敏性，無致突變作用，具有良好的生物相容性和生物降解性。殼聚糖分子中含有豐富的氨基和羥基，易于進(jìn)行化學(xué)修飾多種功能基團(tuán)，從而可以合成大量的殼聚糖衍生物。目前關(guān)于殼聚糖的改性研究主要包括?；Ⅳ然?、烷基化、酯化、西佛堿反應(yīng)和交聯(lián)等?；谠牧虾脱苌锏呢S富性，目前世界各國(guó)研究與開發(fā)的重點(diǎn)集中在殼聚糖的酶載體化。宋楊等采用化學(xué)改性與修飾微珠殼聚糖為載體，共價(jià)法偶聯(lián)牛胰蛋白酶，制成抑肽酶親和吸附劑，單位活力5190KIU/g(濕)，蛋白質(zhì)偶聯(lián)率60.5%，酶活性回收率55% (宋楊，侯司，趙輝等.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000, 27(1):82-86)ο
[0007]相對(duì)于殼聚糖磁性微球和核酸適配體在各自相關(guān)領(lǐng)域中的廣泛研究和應(yīng)用，將殼聚糖磁性微球與核酸適配體結(jié)合在一起應(yīng)用于固相微萃取技術(shù)，以殼聚糖磁性微球?yàn)檩d體提供較大的比表面積、良好的磁響應(yīng)性以及生物相容性，以核酸適配體為識(shí)別功能單元提高選擇性，應(yīng)用于生物樣品中痕量生物堿、抗生素或核苷酸類物質(zhì)的高選擇性、快速分離與富集，國(guó)內(nèi)外均未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明將殼聚糖易于改性和生物相容性好、核酸適配體特異選擇性強(qiáng)的特性與磁分離技術(shù)快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，制備得到一種基于單鏈DNA修飾殼聚糖磁性微球。該新型磁性微球可實(shí)現(xiàn)生物樣品中生物堿、抗生素或核苷酸類物質(zhì)高效、高選擇性、快速分離與富集，清除樣品基體干擾，從而降低檢出限，提高分析的準(zhǔn)確性和精度。
[0009]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種單鏈DNA修飾殼聚糖磁性微球的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0010](I)采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子；
[0011](2)采用反相乳液交聯(lián)法對(duì)步驟(1)制得的Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行殼聚糖(CS)包覆，得到粒徑均勻、分散性好、具有超順磁性的CS/Fe304磁性微球；
[0012](3)將步驟(2)制得的CS/Fe304磁性微球分散于無水乙醇中，加入3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，對(duì)所述CS/Fe304磁性微球表面進(jìn)行氨基改性，得到-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球；
[0013](4)將步驟(3)制得的-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球分散于水中，加入二乙基三胺五乙酸(DTPA)，在1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)作用下，通過酰胺反應(yīng)得到-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球；
[0014](5)將步驟(4)制得的-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球分散于Tris-HCl緩沖液中，加入EDC溶液、NHS溶液及腺苷核酸適配體溶液，室溫震蕩反應(yīng)一定時(shí)間，磁分離，加入牛白蛋白(BSA)溶液震蕩一段時(shí)間，消除非特異性吸附，磁分離，用Tris-HCl緩沖液清洗多次，磁分離，得到腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球，分散于Tris-HCl緩沖液中保存。
[0015]具體地，所述步驟(2)中對(duì)步驟(I)制得的Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行包覆是通過將殼聚糖在弱酸性條件下溶解，加入交聯(lián)劑戊二醛，交聯(lián)包覆在Fe3O4磁性納米粒子表面。稱取適量殼聚糖溶解于24mL2 %的乙酸溶液中，加入適量步驟(I)制得的Fe3O4磁性納米粒子，超聲15min后轉(zhuǎn)移到裝有4mL司班-80和80mL液體石臘的三口燒瓶中，以一定速度攪拌30min后，加入適量的戊二醛，40°C水浴機(jī)械攪拌lh，加入適量lmol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH=9?10，70°C水浴機(jī)械攪拌lh。依次用丙酮、石油醚、乙醇洗滌后抽濾。干燥即得棕黑色磁性殼聚糖微球。優(yōu)選地，所述步驟⑵中加入殼聚糖質(zhì)量是0.075-1.8g，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子流體6-8mL，二者的質(zhì)量比為1:4-6:1，乙酸溶液體積是6.0_72mL，濃度是2% (v/v),分散劑是4mL司班-80，溶劑是80mL的液體石蠟，交聯(lián)劑采用的是3.0_36mL7%的戊二醛溶液，調(diào)節(jié)pH的強(qiáng)堿選用lmol/L的NaOH溶液，機(jī)械攪拌速度為100_500rpm。更進(jìn)一步，步驟
(2)中所采用的殼聚糖磁性微球制備方案為:殼聚糖的質(zhì)量為0.6g，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子流體6mL，殼聚糖與Fe3O4磁性納米粒子流體的質(zhì)量比為2:1，醋酸溶液體積是24mL，交聯(lián)劑戊二醒為IOmL,機(jī)械攪拌速度為lOOrpm。
[0016]優(yōu)選地，步驟(5)所采用的腺苷核酸適配體化學(xué)鍵合條件為:反應(yīng)溶劑為IOmmol/L 的 PBS 緩沖液(0.lmol/L NaCl、10mmol/L Na2HP04/NaH2P04、5mmol/L MgCl2、pH=7.4) UOmM/L TE 緩沖液(lOmmol/L Tris-HCl> lmmol/L EDTA、5mmol/L MgCl2、pH=7.4)、20mmol/L Tris 緩沖液(20mmol/L Tris_HCl、0.lmol/L NaCl、5mmol/L MgCl2, pH=7.4)或超純水，Tris-HCl 緩沖液中NaCl百分含量為0-1.2%(m/m)，反應(yīng)溶劑pH為3.5-8.5，EDC/NHS比例為1:4-8:1,鍵合時(shí)間為0.5-6h，BSA溶液的濃度為0-6%，震蕩洗滌時(shí)間是0-5h。進(jìn)一步地具體來說，步驟(5)所采用的核酸適配體化學(xué)鍵合條件為:反應(yīng)溶劑為20mmol/L Tris緩沖液，Tris-HCl緩沖液中NaCl的百分含量為0.3%，反應(yīng)溶劑pH為6.5，EDC/NHS比例為4:1，鍵合時(shí)間為3h，BSA溶液的濃度是0.5%，震蕩洗滌時(shí)間是0.5h。
[0017]Fe3O4磁性納米粒子不耐酸堿，易于團(tuán)聚，對(duì)一些生物質(zhì)有一定的毒副作用，直接將核酸適配體鍵合在其表面較難實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明在Fe3O4納米粒子外面包覆一層殼聚糖，再通過表面改性使之帶上大量的羧基基團(tuán)，利用殼聚糖磁性微球表面羧基基團(tuán)與核酸適配體端基上修飾的氨基基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)鍵合，將核酸適配體固載于殼聚糖磁性微球表面，克服了常規(guī)物理吸附方法所存在的易脫落、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，并且顯著提高核酸適配體固載量，增強(qiáng)腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球的富集效率。
[0018]為了能更清晰的理解本發(fā)明，以下將結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】闡述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球制備過程示意圖。
[0020]圖2為CS/Fe304磁性微球的掃描電子顯微鏡照片，放大倍率為1800倍。
[0021 ] 圖3為CS/Fe304磁性微球能譜定量分析譜圖。[0022]圖4為CS/Fe304磁性微球的磁滯回線圖。
[0023]圖5為腺苷及其結(jié)構(gòu)類似物鳥苷、尿苷、胞苷、β -胸苷分子結(jié)構(gòu)式。
[0024]圖6為腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球(Apt_CS/Fe304MNPs)、亂序腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球(SApt-CS/Fe304MNPs)、空白CS/Fe304磁性微球(Non-Apt-CS/Fe304MNPs)萃取I μ g/mL腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、β -胸苷、鄰甲基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取量對(duì)比圖。
[0025]圖7為腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球萃取不同濃度腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取量曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本實(shí)施例以腺苷為例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]如圖1所示，基于腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球的制備方法如下:
[0028](I)準(zhǔn)確稱取14.04g FeCl3.6Η20，用煮沸后冷卻的去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至500mL三口燒瓶中，用煮沸后冷卻的去離子水洗滌燒杯并全部轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中得到棕紅色溶液，通入氮?dú)?min，加入7.19g FeSO4.7H20機(jī)械攪拌溶解。將三口燒瓶轉(zhuǎn)移入90°C水浴鍋中，用分液漏斗逐滴加入40mL25%的氨水，有黑色沉淀生成，繼續(xù)恒溫?cái)嚢鑜h。磁性分離，將產(chǎn)品置于磁鐵上，5min后下層是黑色固體，上層為澄清液體，傾去上層液體，蒸餾水洗滌多次至溶液呈中性。最后用去離子水將剩余的磁性納米粒子稀釋為120mL。
[0029](2)稱取0.6g殼聚糖溶解于24mL2%的乙酸溶液中，加入0.3g步驟(I)制得的磁性納米粒子，超聲15min后轉(zhuǎn)移到裝有4mL司班-80和80mL液體石蠟的三口燒瓶中，以IOOrpm速度攪拌30min后，加入12mL7%的戊二醛，40°C水浴機(jī)械攪拌lh，用lmol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH=9?10，70°C水浴機(jī)械攪拌lh。
[0030](3)丙酮破乳，依次用石油醚、乙醇洗滌，用孔徑為5μπι的濾紙減壓抽濾。60°C真空干燥3h，即得棕黑色殼聚糖磁性微球。
[0031](4)稱取0.5g步驟(4)制得的殼聚糖磁性微球于圓底燒瓶中，加入IOOmL的無水乙醇，超聲分散，加入ImL的APTES，機(jī)械攪拌6h。
[0032](5 )將步驟(4)制得的-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球用去離子水洗滌多次，將0.3gDTPA溶解于IOOmL去離子水中用HCl溶液調(diào)節(jié)pH約為3，再加入0.6g EDC和0.1g NHS,迅速將這個(gè)混合溶液倒入裝有-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球的圓底燒瓶中，攪拌12h。用
0.05mol/L的NaOH溶液洗滌磁性微球三次，再用去離子水洗滌至中性。60°C真空干燥3h，即得-COOH基修飾的CS/Fe304磁性微球。
[0033](6)移取2mL濃度為lmol/L的Tris溶液，加入0.3g的NaCl用90mL去離子水溶解后，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH到6.5，用去離子水定容至IOOmL,配成20mmol/L的Tris-HCl緩沖液。準(zhǔn)確稱取5mg步驟(5)制得的-COOH基修飾的CS/Fe304磁性微球于玻璃試劑瓶中，分散于2mL Tris-HCl緩沖液，在25°C以200rpm震蕩溫育lh。磁分離，傾去上層液，力口入2mL Tris-HCl緩沖液，再加入新配置的ImL EDC與NHS混合溶液(質(zhì)量比為4:1)，最后加Λ 66 μ g/mL的適配體溶液50 μ L，震蕩反應(yīng)3h后磁分離，再加入2mL0.5%的BSA溶液震蕩
0.5h，磁分離傾去上層液，用Tris-HCl緩沖液洗滌3次，得到腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球。
[0034]本實(shí)施例制備腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0035](I)采用反相乳液交聯(lián)法，通過機(jī)械攪拌，在交聯(lián)劑戊二醛的作用下將殼聚糖包覆在Fe3O4磁性納米粒子表面。如圖2所示，CS/Fe304磁性微球粒徑均勻，表面粗糙，平均粒徑為25 μ m，該方法獲得的微球其元素組成與能譜分析結(jié)果相符合，見圖3，且具有良好的磁響應(yīng)性及超順磁性，見圖4。同一批次磁性微球適配體平均化學(xué)鍵合率為62%，適配體鍵合量達(dá)到2.05 μ g (5mg磁性微球)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5%(n=3)，而采用物理吸附方法時(shí)適配體平均固載率僅為5%。不同批次磁性微球適配體平均化學(xué)鍵合率為60%，適配體鍵合量為
1.98 μ g (5mg磁性微球),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%(n=3),該方法重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好。
[0036](2)本發(fā)明制備的腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球具有很高的選擇性和萃取能力，以空白CS/Fe304磁性微球、舌L序腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球?yàn)閷?duì)照,腺苷與結(jié)構(gòu)類似物鳥苷、尿苷、胞苷、β_胸苷(分子結(jié)構(gòu)式如圖5所示)及鄰甲基苯甲酸分別配成I P g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。如圖6與圖7所不,腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球?qū)τ谙佘占?種腺苷結(jié)構(gòu)類似物和鄰甲基苯甲酸的選擇性因子分別為31.6,4.8,3.1,4.3,2.6和
2.1，腺苷萃取量為其它4種結(jié)構(gòu)類似物的6-12倍，是鄰甲基苯甲酸的15倍，腺苷萃取容量達(dá)到35.9ng (圖7)。相比之下，亂序腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球?qū)ο佘铡⑵渌?種結(jié)構(gòu)類似物及鄰甲基苯甲酸的萃取量?jī)H為2.4-3.4ng，空白CS/Fe304磁性微球?qū)ο佘?、其?種結(jié)構(gòu)類似物及鄰甲基苯甲酸的萃取量范圍僅為1.9-2.7ng。這表明腺苷核酸適配體修飾Si02/Fe304磁性微球?qū)μ囟繕?biāo)分子腺苷有很高的選擇性，適用于樣品中痕量腺苷的快速分離與富集。
[0037]本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，如果對(duì)本發(fā)明的各種改動(dòng)或變型不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若這些改動(dòng)和變型屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種單鏈DNA核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行: (1)采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子； (2)采用反相乳液交聯(lián)法對(duì)步驟(I)制得的Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行殼聚糖包覆，得到粒徑均勻、分散性好并具有超順磁性的CS/Fe304磁性微球； (3)將步驟(2)制得的CS/Fe304磁性微球分散于無水乙醇中，加入APTES，對(duì)所述CS/Fe3O4磁性微球表面進(jìn)行氨基改性，得到-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球； (4)將步驟(3)制得的-NH2基修飾CS/Fe304磁性微球分散于水中，加入DTPA，在EDC和NHS作用下，通過酰胺反應(yīng)得到-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球； (5)將步驟(4)制得的-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球分散于Tris-HCl緩沖液中，加入EDC溶液、NHS溶液及核酸適配體溶液，室溫震蕩反應(yīng)后，磁分離，加入牛白蛋白溶液震蕩，消除非特異性吸附，磁分離，用Tris-HCl緩沖液清洗多次，磁分離，得到腺苷核酸適配體修飾CS/Fe304磁性微球，分散于Tris-HCl溶劑中保存。
2.如權(quán)利要求1所述單鏈DNA核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法，其特征在于:以CS/Fe304磁性微球?yàn)榈撞?，表面通過化學(xué)鍵合修飾腺苷核酸適配體。
3.如權(quán)利要求1所述單鏈DNA核酸修飾殼聚糖磁性微球的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中所述-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球鍵合腺苷核酸適配體的條件為，所述-COOH基修飾CS/Fe304磁性微球用量為50mg ;鍵合溶劑為Tris-HCl緩沖溶液(20mmol/L Tris, 0.3%(m/m)NaCl, 5mmol/L MgCl2, ρΗ=6.5)，用量為 l_3mL ；EDC/NHS 混合液用量為l-2mL，EDC濃度為10-40mmol/L，NHS濃度為2.5-1OmmoI/L ;腺苷核酸適配體溶液濃度為66μ g/mL，用量為 50-100 μ L0
【文檔編號(hào)】B01J20/30GK103990443SQ201410119816
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】胡小剛, 伍莉莉, 柳曉飛, 郝麗賢 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)