一種黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑、免疫親和柱及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑、免疫親和柱及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的黃曲霉毒素B1納米抗體2014AFB-G15，所述黃曲霉毒素B1納米抗體2014AFB-G15對(duì)黃曲霉毒素B1的50%抑制濃度IC50為0.66ng/mL，對(duì)黃曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反應(yīng)率分別為22.6%、10.95%、32.1%和26%；其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，編碼基因序列如SEQIDNO:8所示，本發(fā)明黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱可用于凈化與濃縮上機(jī)檢測(cè)前樣品提取液，且該免疫親和柱可以多次重復(fù)使用。
【專利說(shuō)明】一種黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑、免疫親和柱及其制備方法和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑、免疫親和柱及其制備方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素目前已發(fā)現(xiàn)20余種，主要包括黃曲霉毒素BI(AFB1), B2 (AFB2)、AFG和Ml (AFM1)等。其中AFB1的毒性最強(qiáng)，它的毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黃曲霉毒素BI被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為已知最強(qiáng)致癌化學(xué)物質(zhì)之一，即I類致癌物質(zhì)。我國(guó)屬于黃曲霉毒素污染較重的地區(qū)，在各種食物及農(nóng)產(chǎn)品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黃曲霉毒素的污染。因此加強(qiáng)黃曲霉毒素的檢測(cè)、特別是速測(cè)，及時(shí)了解和掌握各種食物及農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生信息，對(duì)保障我國(guó)食品消費(fèi)安全具有重要意義。
[0003]現(xiàn)有黃曲霉毒素的檢測(cè)方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。其中薄層層析法是較早用于檢測(cè)黃曲霉毒素最常用的檢測(cè)方法，該法不需要特殊的儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴(yán)重、準(zhǔn)確性差，不能準(zhǔn)確定量，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周圍環(huán)境污染危害較大，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。精密儀器分析法主要包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，這些方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，然而要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)，如液-液萃取、固相萃取、固相微萃取等，前處理過(guò)程繁瑣、特異性不強(qiáng)。因此，建立快捷有效的樣品前處理技術(shù)已成為黃曲霉毒素檢測(cè)分析中需解決的首要和瓶頸問(wèn)題。免疫親和柱是一種新型高效的樣品前處理技術(shù)，基于抗原抗體間特異性的可逆結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中目標(biāo)物質(zhì)的富集凈化。免疫親和柱與液相色譜分析、熒光速測(cè)儀以及ELISA法結(jié)合，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品及食品黃曲霉毒素檢測(cè)中。
[0004]目前，黃曲霉毒素免疫親和柱制備主要采用傳統(tǒng)抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)與瓊脂糖凝膠、硅膠微球等偶聯(lián)制備而成，由于`傳統(tǒng)抗體使用過(guò)程中活性退化較快，市場(chǎng)現(xiàn)有免疫親和柱一直存在可重復(fù)使用次數(shù)偏少的技術(shù)難題。納米抗體是在駱駝科動(dòng)物體內(nèi)天然存在的重鏈抗體，目前，尚未有黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑和免疫親合柱的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑、免疫親和柱及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑，其特征在于:該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體上偶聯(lián)的黃曲霉毒素納米抗體，所述黃曲霉毒素納米抗體為黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，編碼基因序列如SEQ ID N0:8所/Jn ο
[0007]按上述方案，所述黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為:CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示XDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的編碼基因序列分別為:⑶Rl的編碼基因序列如SEQ ID N0:4所示、CDR2的編碼基因序列如SEQ ID N0:5所示，CDR3的編碼基因序列如SEQ ID N0:6所不。
[0008]按上述方案，所述固相載體為瓊脂糖凝膠或硅膠微球。
[0009]上述黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑的制備方法，其特征在于:
所述固相載體選用娃膠微球時(shí)，制備方法為:稱取l?5g娃膠微球,用純水和pH為6的磷酸鹽緩沖液交替沖洗，再量取5?25mL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解硅膠微球，攪拌后使硅膠微球全部懸起，得到硅膠微球懸浮液；用I飛mL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解2?10mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，然后逐滴加入到硅膠微球懸浮液中；最后稱取7(T350mg碳二亞胺(EDC)，快速加入到硅膠微球懸浮液中，4°C攪拌反應(yīng)18?22h后，得到以硅膠微球?yàn)楣滔噍d體的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑；或者
所述固相載體選用瓊脂糖凝膠時(shí)，制備方法為:稱取0.3?Ig瓊脂糖，用ImM HCl溶液反復(fù)沖洗，將瓊脂糖溶于5?15mL偶聯(lián)緩沖液中，再加入0.6"2mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15,在室溫下攪拌反應(yīng)f 2h，得到瓊脂糖凝膠溶液，將瓊脂糖凝膠溶液中未與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)的抗體溶液過(guò)濾后，用偶聯(lián)緩沖液沖洗瓊脂糖凝膠，再加入0.1M、pH8.0的Tris-HCl緩沖液，室溫下反應(yīng)2h，然后用0.1Μ、ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液和0.1Μ、ρΗ4.0的Tris-HCl緩沖液交替沖洗瓊脂糖凝膠后，得到以瓊脂糖凝膠為固相載體的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑，所述偶聯(lián)緩沖液為0.1M NaC03、0.5M NaCl、pH8.3。
[0010]裝載有上述黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱。
[0011]上述黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的制備方法，具體包括如下步驟:首先將黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑填充于固相萃取管中，然后加入pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液后自然沉淀，再用pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液洗滌后，保存于含0.02wt%疊氮鈉的pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液中，得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱。
[0012]上述黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的應(yīng)用，其特征在于，利用所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱對(duì)上機(jī)前的樣品提取液進(jìn)行凈化與濃縮。具體操作為:首先將制備好的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱用純水沖洗，然后加入樣品提取液，最后用純水淋洗，待液體流干后，再用甲醇洗脫，收集洗脫液，所述洗脫液即為凈化與濃縮后的樣品提取液，可直接用于上機(jī)檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
(I)本發(fā)明所述黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15對(duì)黃曲霉毒素BI的50%抑制濃度IC50為0.66ng/mL，對(duì)黃曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反應(yīng)率分別為22.6%、10.95%、32.1%和26% ;制備得到的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的柱容量為50(T600ng，對(duì)黃曲霉毒素BI的平均加標(biāo)回收率為8(Tl00wt%。
[0014](2)本發(fā)明黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱具有穩(wěn)定性好、耐高溫、耐酸堿、耐有機(jī)試劑等優(yōu)點(diǎn)，所述親和柱的貨架期長(zhǎng)、且可以重復(fù)多次使用，可用于凈化與濃縮上機(jī)檢測(cè)iu的樣品提取液。[0015](3)本發(fā)明黃曲霉毒素納米抗體是采用基因工程手段生產(chǎn)得到，具有成本低、制備方便等優(yōu)點(diǎn)，因此由其制備得到的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱與常規(guī)抗體親和柱相比更有優(yōu)勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1黃曲霉毒素納米抗體基因庫(kù)的構(gòu)建與納米抗體的制備 1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買2歲的雄性羊駝一只，免疫黃曲霉毒素BI抗原(AFB1-BSA，Sigma公司)。將20(^g黃曲霉毒素BI抗原與弗式不完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。間隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天對(duì)羊駝進(jìn)行靜脈取血，采用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，選取效價(jià)最高的一次免疫后，取血10mL，提取總RNA。
[0017]2.CDNA文庫(kù)的構(gòu)建
(I)提取總RNA:選取羊駝血清效價(jià)最高的一次免疫，免疫后7-10天，對(duì)羊駝進(jìn)行靜脈取血IOmL,提取總RNA:采用Life Technology公司的LeukoLOCK總RNA分離試劑盒提取羊駝血液中的總RNA。
[0018](2)合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo (dT) 15為引物，按照Promega公司的反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈,獲得cDNA文庫(kù)。
[0019]3.黃曲霉毒素納米抗體基因庫(kù)的構(gòu)建
(I)以步驟2中合成的cDNA為模板`，RU F或R2、F為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到羊駝重鏈抗體可變區(qū)基因，即 VHH 基因:取 cDNA 2 μ 1，IOXPCR Buffer 5 μ IjMgSO4 (50mM)2y I,dNTP(10mmol/L) I μ 1，F(xiàn) 引物(10 μ mol/L) I μ 1，尺1(或1?2)引物(10ymol/L)ly I, DNA SI0.1 μ 1，無(wú)菌純水37.9μ I至50μ 1，渦旋混勻，短暫離心后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94°C變性2min后；94°C變性30s，55°C退火30s，68°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；68°C延伸5min。
[0020]Rl: 5-CGGCGCACCTGCGGCCGC ATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3，，
R2: 5’ -CGGCGCACCTGCGGCCGC GTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’，
F: 5 ’ -TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3，;其中橫線部分表示的引物序列為與載體pCANTAB 5E (his)同源的位點(diǎn)；以Rl、F為引物進(jìn)行4個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以R2、F為引物進(jìn)行6個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收450bp大小的DNA片段。
[0021](2) pCANTAB 5E (his)載體構(gòu)建:以pCANTAB5E載體質(zhì)粒為模板，通過(guò)上游引物:p5E Sfi1-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’ (Sfi I);下游引物:p5E N-P-H-R: 5’- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTTTTC-3’進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 pCANTAB5E 載體質(zhì)粒上 SfiI到NotI之間的DNA片段，得到p5E-his片段；然后將p5E_his片段，先做SfiI單酶切再做PspoMI單酶切，得p5E-his (Sfil/PspoMI)粘性末端，將pCANTAB5E載體質(zhì)粒先做SfiI單酶切再做Not I單酶切，得p5E (Sfil/Notl)粘性末端；最后將p5E_his (Sfil/PspoMI)粘性末端和P5E (SfiI/Notl)粘性末端連接后，得到pCANTAB 5E (his)載體。
[0022](3)雙酶切處理 pCANTAB 5 E (his):
Sfi I單酶切: 按照如下體系配制反應(yīng)液:pCANTAB 5 E (his) vector 30 μ I
Sfi II μ I
IOXM Buffer10 μ I
ddH20補(bǔ)至總體系100 μ I
50°C水浴2 h后用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒進(jìn)行回收。
[0023]Not I 酶切:
按照如下體系配制反應(yīng)液:
pCANTAB 5 E (his) Sfi I 單酶切回收產(chǎn)物 30 μ I Not I II μ I
IOXH Buffer10 μ I
ddH20補(bǔ)至總體系100 μ I
37°C水浴4 h后用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒進(jìn)行回收；
(4)VHH基因與雙酶切處理的pCANTAB 5 E (his)載體的連接 按照如下體系進(jìn)行In-Fusion連接:
Sfi I /Not I 雙酶切處理的 pCANTAB 5 E (his) vector 120ng VHH 基因40ng
5 XIn-Fusion buffer2 μ I
In-Fusion EnzymeI μ I
ddH20補(bǔ)至總體系10 μ I
37°C水浴15min后，放入50°C水浴15min，水浴后立即放在冰上5min，加入40 μ L TE緩沖液，用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒進(jìn)行回收，_20°C保存待用。
(5)連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化
將上述連接產(chǎn)物取5μ I加入到50μ I疋coli TGl電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，力口入到預(yù)冷的0.1 Cm電轉(zhuǎn)化杯(Bio-RAD)中，冰上放置IOmin,然后放在Bio-rad電轉(zhuǎn)化儀上進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件:1.8 kV，200 Ω，25 μ F，電轉(zhuǎn)化后立即在電轉(zhuǎn)化杯中加入I mL2YT液體培養(yǎng)基吹打后轉(zhuǎn)移至一滅菌后的干凈15 mL搖菌管中，37°C緩慢振搖復(fù)蘇I h。取2μ1菌液倍比稀釋后涂布于LB氨芐平板，37°C倒置過(guò)夜，第二天數(shù)菌落個(gè)數(shù)計(jì)算庫(kù)容量。
[0024](6)黃曲霉毒素納米抗體基因庫(kù)的拯救:共進(jìn)行上述十次電轉(zhuǎn)化，將復(fù)蘇后的菌液全部轉(zhuǎn)入200mL SB培養(yǎng)基中，于37°C 250rpm振搖至0D_值為0.5時(shí)，加入lmL，I X 1012pfu的輔助噬菌體M13K07，37°C靜置Ih后，繼續(xù)振搖2h，加入卡那霉素至終濃度為70 μ g/mL,并振搖過(guò)夜。次日，將過(guò)夜菌于4°C IOOOOrpm離心15min,將上清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的離心瓶中，力口入1/4體積的5x PEG/NaCl，于冰上靜置2h后，4°C 12000rpm離心20min，用IOmL無(wú)菌的重懸溶液(含IX蛋白酶抑制劑，0.02% NaN3和0.5% BSA的PBS緩沖液)溶解沉淀得到噬菌體拯救后的黃曲霉毒素納米抗體基因庫(kù)。
[0025]4.黃曲霉毒素BI納米抗體的淘選
用AFB1-BSA (I μ g/孔)及3%的BSA-PBS溶液(用作陰性對(duì)照)分別包被ELISA板，4°C過(guò)夜；次日，傾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3%脫脂奶粉封閉I h ;PBST洗板3次，在包被有AFB1-BSA的孔中加入上述拯救后的黃曲霉毒素納米抗體基因庫(kù)50 μ 1，37°C孵育I h ；PBST洗板10次后，每孔加入100μ lU00ng/mL AFB1溶液，室溫(20°C?30。。)震蕩30min洗脫。將洗脫液轉(zhuǎn)至包被有3%BSA-PBS溶液的孔中，37°C孵育Ih (去除非特異性吸附)；孵育后，取上清侵染2mL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的TGl菌液，37°C侵染20min，取1μ 1、10μ I分別涂布LB氨芐平板上，并于37°C培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜，次日數(shù)平板上的菌落數(shù)確定洗脫液中噬菌體滴度。另將上述剩余的被侵染后的TGl菌液轉(zhuǎn)入6mLSB培養(yǎng)基中，加100mg/mL的氨芐青霉素1.5μ 1，37°C振搖lh，補(bǔ)加氨芐青霉素至終濃度為50 μ g/mL，繼續(xù)振搖Ih后，加入ImL輔助噬菌體M13K07 (I X 1012pfu/mL), 37°C靜置30min,轉(zhuǎn)入IOOmL SB培養(yǎng)基，補(bǔ)加氨節(jié)青霉素(100mg/mL)46 μ I,繼續(xù)振搖2h后,加入卡那霉素至終濃度為70 μ g/mL,并于37°C振搖過(guò)夜。次日，將菌液于IOOOOrpm 4°C離心15min，轉(zhuǎn)移上清，并加入1/4體積PEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm 4°C離心20min，用1%BSA_PBS溶液溶解沉淀，得到第一輪淘選擴(kuò)增產(chǎn)物，并用于下一輪淘選。在隨后幾輪的淘選中，包被抗原AFB1-BSA的濃度分別為 0.5 μ g/ 孔、0.1yg/ 孔、0.05 μ g/ 孔,洗脫液分別為 500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL 的AFB1溶液。
[0026]5.陽(yáng)性克隆的鑒定:
經(jīng)過(guò)4輪淘選后，取2 μ I洗脫液倍比稀釋后侵染生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的TGl菌液，涂布LB氨芐平板上，37°C倒置過(guò)夜。次日，隨機(jī)挑取30個(gè)克隆分別于3mL SB-氨芐培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)6-8h，至OD600為0.6左右，加入30 μ I輔助噬菌體Μ13Κ07 (I X 1012pfu/mL), 37。。靜置30min后繼續(xù)振搖2h，加入卡那霉素至終濃度為70 μ g/mL，并震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日，將菌液于IOOOOrpm 4°C離心15min后,得到菌液上清。
[0027]用包被液配制AFB1-BSA至終濃度0.2 μ g/ml，包被96孔ELISA板，每孔100 μ 1，同時(shí)另取ELISA板，其中的32個(gè)孔用3%BSA包被，4°C包被過(guò)夜；次日，傾掉包被液后，PBST洗板3次，然后用3%脫脂奶粉-PBS封閉I h ;取AFB1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液，用10%甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL的工作液，分別加入到包被有AFB1-BSA抗原的孔中，再每孔加入50 μ I上述菌液上清，每種工作液濃度重復(fù)3次；在包被有BSA的孔加入10%甲醇/PBS和50 μ I上述菌液上清作為對(duì)照，輕搖板子混勻后，置37°C溫箱反應(yīng)I h;PBST洗板10次后，每孔加入100 ul用PBS按I:5000比例稀釋的HRP/ANT1-M13, 37°C保溫I h ；PBST洗板6次，每孔加入100 μ I新鮮配制的TMB底物溶液，37°C保溫15 min ;加2mol/L H2SO4,每孔50 μ I中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定OD45tl值；對(duì)BSA不吸附，對(duì)AFB1-BSA有吸附，并且加入黃曲霉毒素后存在競(jìng)爭(zhēng)的即為陽(yáng)性噬菌體克隆，由此篩選得到吸光值和靈敏度均較高的孔，得到噬菌體展示的黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15。
[0028]采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15的抗體特異性，具體用交叉反應(yīng)率描述，測(cè)試方法如下:將AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1五種不同標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液，用10%甲醇/PBS梯度稀釋至十個(gè)不同的工作濃度，同等條件下采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，依次繪制五種黃曲霉毒素的競(jìng)爭(zhēng)ELISA曲線，求出各自抑制率為50%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，用IC5tl表示，并根據(jù)下述計(jì)算公式計(jì)算交叉反應(yīng)率:交叉反應(yīng)率(％)= (AFB1IC50/類似物IC5tl) X 100%，所述類似物為AFB2、AFG1, AFG2或AFM1，得到黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15對(duì)于對(duì)黃曲霉毒素BI的50%抑制濃度IC5tl為0.66ng/mL，對(duì)黃曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反應(yīng)率分別為22.6%、10.95%,32.1%和26%。因此，黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15是一種抗黃曲霉毒素BI的特異性納米抗體。經(jīng)耐受性試驗(yàn),黃曲霉毒素納米抗體2014AFB-G15比常規(guī)鼠源與兔源抗體耐有機(jī)溶劑能力提高35%，耐高溫能力提高46%。[0029]同時(shí)將篩選到的含有黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序引物為噬菌體載體通用引物Rl:5’-CCA TGA TTACGC CAA GCT TTG GAG CC-3’。得到黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15的氨基酸序列如SEQ IDNo:7所示，編碼基因序列如SEQ ID No:8所示，其中三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為:CDRl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示、⑶R3的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的編碼基因序列分別為ADRl的編碼基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的編碼基因序列如SEQ ID NO: 5所示，CDR3的編碼基因序列如SEQ ID N0:6所示。
[0030]6.黃曲霉毒素納米抗體2014AFB-G15的制備與純化: (1)獲得能分泌黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15的TGl菌液，使用Qiagen的DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到HB2151感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布到LB氨芐平板上；
(2)挑取含有黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15質(zhì)粒的HB2151菌落于IOOmLSB氨芐液體培養(yǎng)基中，250印111，371:培養(yǎng)至00600 = 0.5-0.8，加入20(^1 0.5M IPTG溶液誘導(dǎo)過(guò)夜。
[0031](3) 4°C, 10 000 rpm,冷凍離心15 min,無(wú)菌操作臺(tái)中小心去除上清,菌體沉淀采用滲透休克法進(jìn)行可溶性蛋白提取，得到上清蛋白。將上清蛋白過(guò)0.22Mm濾膜后，用平衡緩沖液(50mM磷酸鹽，300mM氯化鈉，20mM咪唑；pH 7.4)透析過(guò)夜。
[0032](4)采用His60鎳柱(Clontech Technology)純化抗體:首先用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗鎳柱，將步驟(3)中透析后的上清蛋白上樣His60鎳柱(ClontechTechnology)進(jìn)行抗體純化,再用10倍柱體積淋洗緩沖液(50mM磷酸鹽,300mM氯化鈉，40mM咪唑；pH 7.4)洗滌柱子，最后用10倍柱體積的洗脫緩沖液(50mM磷酸鹽，300mM氯化鈉，300mM咪唑；pH 7.4)洗脫抗體2014AFB-G15，收集洗脫液，裝入透析袋，用0.01M, pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析2-3天后濃縮，分裝于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]實(shí)施例2黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑和免疫親和柱的制備
本實(shí)施例免疫親和吸附劑包括固相載體(硅膠微球)和與該固相載體偶聯(lián)的黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，具體制備方法如下:稱取Ig丙烯酰胺硅膠微球，放入錐形瓶中，用純水和PH為6的磷酸鹽緩沖液交替沖洗微球；量取5mL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解微球，得微球溶液，將微球溶液轉(zhuǎn)移至攪拌杯中，開(kāi)啟攪拌器使微球全部懸起，用ImL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解2mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，然后逐滴加入到上述微球溶液中，稱取70mg EDC，迅速導(dǎo)入攪拌杯中，4°C攪拌反應(yīng)18_22h后，得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑。
[0034]黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的制備:將上述制備的免疫親和吸附劑(0.2mL)填充于固相萃取管中，加入pH 6，0.01M的磷酸鹽緩沖液后自然沉淀，再用pH 6，0.01M的磷酸鹽緩沖液洗滌后，保存于含0.02wt%疊氮鈉的pH 6,0.01M的磷酸鹽緩沖液，即得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱，于4°C保存待用。
[0035]實(shí)施例3黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑和免疫親和柱的制備
本實(shí)施例免疫親和吸附劑包括固相載體(瓊脂糖)和與該固相載體偶聯(lián)的黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，具體制備方法如下:稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，用ImMHCl溶液反復(fù)沖洗15min以上，將瓊脂糖溶于5mL偶聯(lián)緩沖液中(0.1M的NaCO3,0.5M NaCl,pH8.3)，再加入0.6mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，在室溫下以150rpm的速度攪拌反應(yīng)lh，得到瓊脂糖凝膠溶液，將瓊脂糖凝膠溶液轉(zhuǎn)移到砂氏漏斗中，使得未偶聯(lián)的含抗體的溶液流出，然后用體積是瓊脂糖凝膠溶液5倍的偶聯(lián)緩沖液沖洗瓊脂糖凝膠，再加入體積是瓊脂糖凝膠溶液2倍的封閉緩沖液(0.1M Tris-HCl緩沖液，pH8.0)室溫反應(yīng)2h，然后用高 pH 緩沖液(0.1M Tris-HCl 緩沖液，pH8.0)和低 pH (0.1M Tris-HCl 緩沖液，pH4.0)緩沖液交替沖洗凝膠三次后，得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑。
[0036]黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的制備:將上述制備的免疫親和吸附劑(0.2mL)填充于固相萃取管中，加入pH 6，0.0lM的磷酸鹽緩沖液后自然沉淀，再用pH 6，0.0lM的磷酸鹽緩沖液洗滌后，保存于含0.02wt%疊氮鈉的pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液，即得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱，于4°C保存待用。
[0037]實(shí)施例4黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱柱容量的測(cè)定:
將實(shí)施例2或?qū)嵤├?制備得到的免疫親和柱用IOmL純水沖洗，將IOmL 10%甲醇/PBS溶解的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為100ng/mL，黃曲霉毒素BI的含量總計(jì)為Img)過(guò)柱，用IOmL純水沖洗柱子去除未結(jié)合的黃曲霉毒素，最后用5mL甲醇溶液洗脫，ImL/管分管收集，用液相色譜法檢測(cè)洗脫液中黃曲霉毒素含量。結(jié)果表明，黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的柱容量為50(T600ng。將免疫親和柱重復(fù)使用5次后，測(cè)定其柱容量，柱容量仍然能達(dá)到480ng ;該結(jié)果表明免疫親和柱可以多次重復(fù)使用。同時(shí)交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明所述黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱可同時(shí)特異性結(jié)合黃曲霉毒素B1、B2、Gl、G2、M1，而不會(huì)結(jié)合玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素等其他真菌毒素。
[0038]實(shí)施例5黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱加標(biāo)回收率的測(cè)定:
分別稱取不含黃曲霉毒素的空白樣品花生、玉米、植物油、飼料三份，每份5g，并向其中分別添加黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50ng、250ng、500ng，經(jīng)常規(guī)方法提取:用15mL 70%甲醇水(含4% NaCl)于50°C超聲提取lOmin，提取液用濾紙過(guò)濾，取4mL濾液加2mL石油醚，渦旋混勻，靜置分層，取下層3mL，加SmL純水，用0.45Mm有機(jī)膜過(guò)濾，得到過(guò)濾液，即樣品提取液。將實(shí)施例2或?qū)嵤├?制備好的免疫親和柱用IOmL純水沖洗，加8mL上述樣品提取液，最后用IOmL純水淋洗，待液體流干后，用ImL甲醇洗脫,收集洗脫液上高效液相色譜(上機(jī))檢測(cè)洗脫液中黃曲霉毒素的含量，然后計(jì)算回收率。結(jié)果顯示:黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱對(duì)黃曲霉毒素BI的平均回收率為8(Tl00wt%。
【權(quán)利要求】
1.一種黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑，其特征在于:該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的黃曲霉毒素納米抗體，所述黃曲霉毒素納米抗體為黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，編碼基因序列如SEQ IDN0:8所/Jn ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑，其特征在于，所述黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為:CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的編碼基因序列分別為:⑶Rl的編碼基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的編碼基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的編碼基因序列如SEQ ID N0:6所/Jn ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑，其特征在于，所述固相載體為瓊脂糖凝膠或硅膠微球。
4.權(quán)利要求3所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑的制備方法，其特征在于， 所述固相載體選用娃膠微球時(shí)，制備方法為:稱取l?5g娃膠微球,用純水和pH為6的磷酸鹽緩沖液交替沖洗，再量取5?25mL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解硅膠微球，攪拌后使硅膠微球全部懸起，得到硅膠微球懸浮液；用I飛mL pH為6的磷酸鹽緩沖液溶解2?10mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15，然后逐滴加入到硅膠微球懸浮液中；最后稱取7(T350mg碳二亞胺，快速加入到硅膠微球懸浮液中，4°C攪拌反應(yīng)18?22h后，得到以硅膠微球?yàn)楣滔噍d體的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑；或者 所述固相載體選用瓊脂糖凝膠時(shí)，制備方法為:稱取0.3?Ig瓊脂糖，用ImM HCl溶液反復(fù)沖洗，將瓊脂糖溶于5?15mL偶聯(lián)緩沖液中，再加入0.6"2mg黃曲霉毒素BI納米抗體2014AFB-G15,在室溫下攪拌反應(yīng)f 2h，得到瓊脂糖凝膠溶液，將瓊脂糖凝膠溶液中未與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)的抗體溶液過(guò)濾后，用偶聯(lián)緩沖液沖洗瓊脂糖凝膠，再加入0.1M、pH8.0的Tris-HCl緩沖液，室溫下反應(yīng)2h，然后用0.1Μ、ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液和0.1Μ、ρΗ4.0的Tris-HCl緩沖液交替沖洗瓊脂糖凝膠后，得到以瓊脂糖凝膠為固相載體的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和吸附劑，所述偶聯(lián)緩沖液為0.1M NaC03、0.5M NaCl、pH8.3。
5.裝載有權(quán)利要求廣3所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱。
6.權(quán)利要求5所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將黃曲霉毒素納米抗體免疫吸附劑填充于固相萃取管中，加入pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液后自然沉淀，然后用pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液洗滌后，保存于含0.02被％疊氮鈉的pH 6,0.0lM的磷酸鹽緩沖液中，得到黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱。
7.權(quán)利要求5所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的應(yīng)用，其特征在于，利用所述黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱對(duì)上機(jī)前樣品提取液進(jìn)行凈化與濃縮。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱的應(yīng)用，其特征在于，具體操作為:首先將制備好的黃曲霉毒素納米抗體免疫親和柱用純水沖洗，然后加入樣品提取液，最后用純水淋洗，待液體流干后，再用甲醇洗脫，收集洗脫液，所述洗脫液即為凈化與濃縮后的樣品提取液，可直接用于上機(jī)檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】B01J20/24GK103861569SQ201410121834
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】李培武, 張奇, 王妍入, 張兆威, 丁小霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所