用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征在于步驟如下：取聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐）和β-環(huán)糊精，溶于溶劑N,N-二甲基甲酰胺中，在氮氣保護(hù)下，加熱反應(yīng)，去除溶劑；將聚乙二醇20000和的瓊脂糖的混合物水溶液，加入上述反應(yīng)物中，震蕩至溶解，制備得到水相溶液，備用；將水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加熱攪拌反應(yīng)，靜置，棄去上清液，清洗沉積在容器底部的微球，真空干燥，得到凝膠微球；將凝膠微球放入Azo-RGD的甲烷水溶液，室溫震蕩24小時，用去離子水反復(fù)漂洗，N2干燥，得到的微球能模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，實現(xiàn)細(xì)胞在微球上吸附、分離可控。
【專利說明】用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聚合物微球的制備技術(shù)，特別涉及一種用反向懸浮聚合法制備光響應(yīng)智能凝膠微球的方法，所得微球可以用作細(xì)胞培養(yǎng)微載體。
【背景技術(shù)】
[0002]三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗之間，與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)(2D)培養(yǎng)相比，其以常見支架三維培養(yǎng)模型為主，更接近體內(nèi)細(xì)胞生長微環(huán)境，能更好地模擬細(xì)胞在體的生長自然環(huán)境，因而在研究細(xì)胞生長、分化、遷移等方面更真實可靠。普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進(jìn)行，體內(nèi)多種制約因素以及體內(nèi)和外界環(huán)境的相互影響使細(xì)胞培養(yǎng)變得復(fù)雜化，難以研究單一過程，且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以多種包被表面(Amino、Collagen(Type1rIV)、Elastin、ProNectin (RGD)、Laminin(YIGSR))的膠原水凝膠為細(xì)胞外基質(zhì)支架，與傳統(tǒng)的納米纖維支架和多孔支架相比，水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中含有大量水分，可以很好地供給細(xì)胞養(yǎng)分，同時還可以交聯(lián)生物活性因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，因此可以更好地模擬細(xì)胞生長所需的類組織樣物理和空間結(jié)構(gòu)，并且可塑性高、制作工藝相對簡單、臨床應(yīng)用方便。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。
[0003]微凝膠顆粒制備簡單，內(nèi)部可包裹生長因子或其他生物活性分子，可作為三維培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)。南開大學(xué)張擁軍教授制備了輕度交聯(lián)的熱敏性聚(N-異丙基丙烯酰胺-alt-丙烯酸)(PNIPAM-AA)微凝膠，可以用來作為三維培養(yǎng)支架獲得人肝癌細(xì)胞HepG2微球，直徑在IOOym左右。在細(xì)胞的分離方面，這些微凝膠也顯示了其特有的優(yōu)勢，如濃度為6wt%微凝膠在37°C固化成膠，待溫度降至室溫時，又逐漸液化，將多細(xì)胞微球釋放出來。
[0004]聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)(PMVE-alt-MAH)和聚乙二醇(PEG)是一類人工合成化合物中少數(shù)幾種的對人體和動物無毒無害的聚合物，二者相互交聯(lián)制備的聚合物具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，也可實現(xiàn)化學(xué)成分可控，便于進(jìn)一步的應(yīng)用和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于為了提供一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的光可控智能凝膠微球的制備方法，在該微球上培養(yǎng)細(xì)胞，可實現(xiàn)吸附和分離可控，工藝簡單，周期短，沒有任何環(huán)境污染，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0007]一種用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征包括以下步驟:
[0008](I)水相溶液的制備:取聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)和環(huán)糊精，溶于溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮氣保護(hù)下，于60-100°C下加熱反應(yīng)8-10小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去N，N- 二甲基甲酰胺；將聚乙二醇20000和瓊脂糖的混合物水溶液(水溶液經(jīng)超聲獲得)，加入上述反應(yīng)物中，通過震蕩至溶解，聚乙二醇20000的濃度為0.0667-0.2000g/mL,瓊脂糖的濃度為0.0031-0.0102g/mL，制備得到水相溶液，以上四種固體混合物的水溶液的濃度為 0.1591-0.3450g/mL，備用；
[0009]步驟⑴中聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)與β_環(huán)糊精按照10:1-50:1的摩爾比混合；聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)與PEG按照50:1-150:1的摩爾比混合；聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)與瓊脂糖按15:1:50:1的摩爾比混合；
[0010](2)微球的形成:將步驟⑴得到的水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加熱攪拌反應(yīng)12h?72h，靜置，棄去上清液，微球沉積在容器的底部，清洗微球表面的油相，真空干燥，得到凝膠微球，該微球能模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，實現(xiàn)細(xì)胞在微球上吸附、分離可控。
[0011]水相與油相的體積比為1:10-1:25 ;攪拌速率為500rpm-2000rpm。油相溫度控制在60°C -100°C，這是由于聚乙二醇、瓊脂糖和酸進(jìn)行酯化反應(yīng)需要在加熱環(huán)境下進(jìn)行，由于在兩相溶液中，水相的小液滴內(nèi)發(fā)生酯化反應(yīng)，而機(jī)械攪拌促使他們懸浮于油相中，隨著水相的揮發(fā)，形成0/W相，逐步形成酸和PEG、AG酯化反應(yīng)后的微球。
[0012]偶氮苯羧基化改性的制備(參考文獻(xiàn):Yu_HuiG., CaoL., Juan Y.Photoresponsive“SmartTemplate”via HostGuest Interaction for Reversible Cell Adhesion.Macromolecules, 2011, 44，7499-7502):取4-氨基偶氮苯和丁二酸酐溶于丙酮中，4-氨基偶氮苯:丁二酸酐=5:6(摩爾比)，再向該溶液中加入無水吡啶，4-氨基偶氮苯:無水吡啶=1:1(摩爾比)，在60°C下攪拌6小時，過濾，反復(fù)洗滌去除溶劑，在50°C下真空干燥48小時，得到改性4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)。
[0013]改性4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)與精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)的聚合(Azo-RGD)(參考文獻(xiàn):Z.Zhang et al.Effects of immobilizing sites of
RGDpeptides in amphiphilic block copolymers on efficacy of cell adhesion.Biomaterials, 2010，7873-7882):將改性 4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)溶于二 氯甲烷(CH2Cl2),將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入溶液中，室溫下攪拌24小時，將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入乙腈(ACN)，溶解聚合物，然后加入精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)攪拌24小時，得到改性4-氨基偶氮苯與精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(Azo-RGD)。
[0014]改性4-氨基偶氮苯與精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(Azo-RGD)與本申請制備的凝膠微球的組裝(參考文獻(xiàn):Yu_HuiG., CaoL., JuanY.Photoresponsive“SmartTemplate”viaHostGuest Interaction for Reversible Cell Adhesion.Macromolecules, 2011, 44, 7499-7502):將Azo-RGD溶于甲烷(CH3OH)中，再將溶液滴入去離子水中，形成混合溶液，溶液濃度為lmg/mL(甲烷與水的比例是有無特殊要求，其實是將Azo-RGD溶于甲烷與水的混合溶劑中)，將含β -環(huán)糊精的凝膠微球放入混合溶液中，室溫震蕩24小時，用去離子水反復(fù)漂洗，用氮氣干燥微球。
[0015]偶氮苯有順(Z)-反(E)-異構(gòu)體，反式為橙紅色棱形晶體，溶于乙醇、乙醚和醋酸，不溶于水。順式為橙紅色片狀晶體，不穩(wěn)定，所以在常溫下偶氮苯以反式結(jié)構(gòu)存在。但在365nm波長的紫外光照射下，反式構(gòu)型的偶氮苯會轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖綐?gòu)型，在可見光或熱作用下，順式構(gòu)型可回復(fù)到反式構(gòu)型。兩種構(gòu)型的偶氮苯分子具有明顯不同的紫外可見吸收光譜。此外，兩者的立體結(jié)構(gòu)、偶極矩等一些物理和化學(xué)性質(zhì)亦存在明顯差異。
[0016]環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)為略呈錐形的圓環(huán)，外緣親水而內(nèi)腔疏水，使其可依據(jù)范德華力、疏水相互作用力、主客體分子間的匹配作用等與許多有機(jī)和無機(jī)分子形成包合物及分子組裝體系，這種選擇性的包絡(luò)作用即通常所說的分子識別。因而它與聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)形成的聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精能夠提供一個疏水的結(jié)合部位，在常溫下，Azo-RGD可進(jìn)入聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精中的疏水內(nèi)腔，形成主客體包絡(luò)物，在365nm紫外光照射下，偶氮苯結(jié)構(gòu)由反式轉(zhuǎn)為順式，可從β-環(huán)糊精內(nèi)腔脫落。實現(xiàn)聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精與Azo-RGD組裝與分離光可控。
[0017]本申請采用改性4-氨基偶氮苯與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的聚合物Azo-RGD組裝微球，是利用RGD更易于被細(xì)胞表層整合蛋白所識別和貼附的性質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞在微球上粘附，即在常溫下，當(dāng)Azo-R⑶與聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精形成主客體包絡(luò)物時，RGD就可促進(jìn)細(xì)胞在微球上的粘附，當(dāng)紫外光照射后，Azo-RGD的順反式結(jié)構(gòu)改變，Azo-RGD從聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精上脫離，即RGD從微球上脫離，這樣細(xì)胞容易從微球上脫離，通過這種方式實現(xiàn)細(xì)胞在微球上的粘附和分離可控。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實施例1獲得的凝膠微球的光學(xué)電子顯微鏡圖，由圖可知，所獲得的凝膠微球直徑在20-100um之間，形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一。
[0019]圖2是實施例1獲得的凝膠微球放大1000倍的掃描電鏡圖，由圖可得，所獲得的凝膠微球直徑在20-100um之間,形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一，表面相對光滑。
[0020]圖3是實施例1獲得的凝膠微球放大300倍的掃描電鏡圖，由圖可得，所獲得的凝膠微球直徑在20-100um之間,形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一，表面相對光滑。
[0021]圖4是實施例1獲得的的凝膠微球培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在微球上培養(yǎng)3天的生長情況的光學(xué)電子顯微鏡圖。用二乙酸熒光素(FDA)對微球上的活細(xì)胞進(jìn)行染色，圖中微球上綠色亮點即為活細(xì)胞。由圖可知，細(xì)胞在微球上生長良好，即細(xì)胞在微球上存活率高。
[0022]圖5是實施例1獲得的凝膠微球培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在微球上培養(yǎng)3天，經(jīng)365nm的紫外光照射后，細(xì)胞在微球上的生長情況的光學(xué)電子顯微鏡圖。用二乙酸突光素(FDA)對微球上的活細(xì)胞進(jìn)行染色，圖中微球上綠色亮點即為活細(xì)胞。與圖4相比，只有少數(shù)細(xì)胞吸附于微球上，即大部分細(xì)胞從微球上脫離，說明本發(fā)明制備的微球可實現(xiàn)細(xì)胞吸附和分離可控。
【具體實施方式】
[0023]以下實例所采用的原料來源說明:聚乙二醇20000、β -⑶購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚甲基乙烯基醚共聚馬來酸酐(PVME-alt-MAH)，瓊脂糖，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，對氨基偶氮苯均購自阿拉丁 ； 二甲基硅油，正己烷，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，丁二酸酐，丙酮，二氯甲燒，乙腈均購自國藥集團(tuán)，1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自北京伊諾凱科技有限公司。
[0024]以下實施例在滴加水相進(jìn)入油相時，采用“滴”為單位，此處，一滴約為0.3mL。[0025]改性偶氮苯的制備:4_氨基偶氮苯羧基化及其與精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)聚合的制備(Azo-RGD)(參考文獻(xiàn):Z.Zhangetal.Effects of immobilizing sites
of RGD peptides in amphiphilic block copolymers on efficacy of cell adhesion.Biomaterials, 2010，7873-7882):1.97g4_ 氨基偶氮苯與 1.20g 丁二酸酐溶于 25mL 丙酮中，加入0.97g無水吡啶，在60°C下加熱反應(yīng)6h，經(jīng)過濾、真空干燥24h，制備羧基化4-氨基偶氮苯Azo-COOH。
[0026]取0.137g(0.46mmoL)已制備的 Azo-COOH,溶于 IOOmL 二氯甲燒中，將0.225g(l.17mmoL) 1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與
0.135g(l.17mmoL)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入上述溶液中，室溫下攪拌24h，將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除凈后，加入IOmL乙腈溶解聚合物，然后加入0.138g(0.4mmoL)R⑶攪拌24h，即得到Azo-R⑶。
[0027]實施例1
[0028]用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法:
[0029](I)水相溶液的制備:取0.7800g(5mmoL)聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)和
0.2270g(0.2mmoL) β-環(huán)糊精，溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮氣保護(hù)下，于80°C下加熱反應(yīng)9小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去N，N-二甲基甲酰胺溶劑dfl.0000g(0.05mmoL)聚乙二醇(20000)和0.0612g(0.2mmoL)瓊脂糖(AG)溶于IOmL水中，加入上述反應(yīng)物中，震蕩至溶解，制備得到水相溶液，濃度為0.2068g/mL，備用。
[0030](2)微球的形成:稱量50ml 二甲基硅油倒入IOOml高型燒杯中，加熱到80°C，在IOOOrpm的攪拌速度下，用滴管將步驟(2)制備的2.5mL水相溶液緩慢滴入二甲基硅油中，攪拌24h，靜置12h，棄掉上清液，用正己烷清洗除去微球表面的油相，真空干燥，得到水凝膠微球。
[0031](3) Azo-RGD與含β -環(huán)糊精的凝膠微球的組裝(參考文獻(xiàn):Yu-Hu iG., CaoL., JuanY.Photoresponsive “Smart Temp late，，viaHostGuestInteraction for Reversible Cell Adhesion.Macromolecules, 2011, 44, 7499-7502):將
0.015gAzo-RGD溶于1.5mL甲烷(CH3OH)中，再將甲烷溶液滴入13.5mL去離子水中，形成混合溶液，溶液濃度為lmg/mL，將含β -環(huán)糊精的凝膠微球放入混合溶液中，室溫震蕩24小時，過濾除去溶液，用去離子水反復(fù)漂洗，用氮氣干燥微球，常溫下，Azo-RGD進(jìn)入聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)_環(huán)糊精中的內(nèi)腔，形成主客體包絡(luò)物，細(xì)胞因RGD的存在容易粘附在微球上，在365nm紫外光照射下，Azo-RGD由反式轉(zhuǎn)為順式，從環(huán)糊精內(nèi)腔脫落，細(xì)胞從微球分離，實現(xiàn)凝膠微球與Azo-RGD的組裝與分離的光可控。
[0032]實施例2、5所采用的組份以及工藝條件見表1:
[0033]表I
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征包括以下步驟: 水相溶液的制備:取聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)和β -環(huán)糊精，溶于溶劑N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮氣保護(hù)下，于60-100°C下加熱反應(yīng)8-10小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去N，N-二甲基甲酰胺；將聚乙二醇20000和瓊脂糖的混合物水溶液，加入上述反應(yīng)物中，震蕩至溶解，聚乙二醇20000的濃度為0.0667-0.2000g/mL,瓊脂糖的濃度為0.0031-0.0102g/mL,制備得到水相溶液，濃度為0.1591-0.3450g/mL，備用； 微球的形成:將步驟(1)得到的水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加熱攪拌反應(yīng)12h~72h，靜置，棄去上清液，微球沉積在容器的底部，清洗微球表面的油相，真空干燥，得到凝膠微球； Azo-RGD與凝膠微球的組裝:將Azo-RGD溶于甲烷中，再將得到的甲烷溶液滴入去離子水中，形成混合溶液，溶液濃度為lmg/mL，將凝膠微球放入混合溶液中，室溫震蕩24小時，用去離子水反復(fù)漂洗，用氮氣干燥微球； 細(xì)胞的吸附與分離:常溫下，將細(xì)胞與微球一起培養(yǎng)，Azo-RGD進(jìn)入聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)-環(huán)糊精中的疏水內(nèi)腔，形成主客體包絡(luò)物，將細(xì)胞吸附在微球上；在365nm紫外光照射下，Azo-RGD由反式轉(zhuǎn)為順式，從環(huán)糊精內(nèi)腔脫落，細(xì)胞從微球分離，實現(xiàn)凝膠微球與Azo-RGD的組裝與分離的光可控。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征在于步驟(1)中聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)與環(huán)糊精按照10:1-50:1的摩爾比混合?’聚(甲基乙烯基醚 -馬來酸酐)與PEG按照50:1-150:1的摩爾比混合?’聚(甲基乙烯基醚-馬來酸酐)與瓊脂糖按15:1:50:1的摩爾比混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征在于步驟(2)中油相溫度控制在60°C -1OO0C ;水相與油相的體積比為1:10-1:25 ;攪拌速率為 500rpm-2000rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的光響應(yīng)智能凝膠微球的制備方法，其特征在于步驟(1)中聚乙二醇20000的濃度為0.0667-0.2000g/mL,瓊脂糖的濃度為.0.0031-0.0102g/mL，制備得到水相溶液的濃度為0.1591-0.3450g/mL。
【文檔編號】B01J20/26GK103962112SQ201410202173
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】張?zhí)熘? 馬丹丹, 顧寧 申請人:東南大學(xué)