一種高分子熒光微球的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高分子熒光微球的制備方法，其特點是將1重量份的聚苯乙烯熒光微球分散在0.1?lmL超純水中，在攪拌下，滴加到3?10mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液1.0?4.Omg/mL中，持續(xù)攪拌1?4h后離心，去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集后振蕩分散于1?2mL超純水中，攪拌下滴加到5?50mL標記或未標記熒光分子的多糖類聚電解質高分子溶液1.0?6.Omg/mL中，持續(xù)攪拌1?4h后離心，去除上清液后，將沉淀分散于純水中，離心收集沉淀物，再將其分散到超純水中，獲得多糖修飾的熒光微球。該高分子熒光微球粒徑為1?10ym，熒光激發(fā)波長為350?800nm，具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性。
【專利說明】—種局分子熒光微球的制備方法

【技術領域】
:
[0001]本發(fā)明涉及一種高分子熒光微球的制備方法。屬于生物醫(yī)用高分子材料領域。

【背景技術】
[0002]突光微球由于在單個微球中富集了能夠發(fā)射突光的有機或無機突光物質，發(fā)光強度和熒光靈敏度都比較高，所以在臨床檢驗和診斷、免疫分析、血液循環(huán)以及細胞學研究等生物醫(yī)學領域得到了極其廣泛的應用(Macromolecules2011, 44, 4801 ；Macromol.Chem.Phys.2005，206，2440)。在微球的各種特性中，影響其應用的重要因素是微球的尺寸、分散性及形貌，除此以外，對于它的生物相容性要求，也顯得十分重要(MacromoIecules2005, 38, 8300)。
[0003]近幾年來，合成單分散的預定尺寸的聚苯乙烯熒光微球有了突破性的進展，制備的微球具有形貌規(guī)則、粒徑均一、良好的表面反應能力和易于功能化等優(yōu)點(EuropeanPolymer Journal2009, 45，550)，在免疫技術和疾病早期診斷等領域具有很高的研究和應用價值。聚苯乙烯熒光微球的制備，通常是通過物理吸附或化學鍵合的方法，在微球內(nèi)部包埋或表面連接熒光素分子。利用物理吸附的方法制備熒光微球是一種簡單、直接的方法，但物理吸附的熒光分子在微球上的富集不穩(wěn)定，且熒光素吸附效率低?；瘜W鍵合法制備突光微球相對于物理吸附的方法(Journal of Colloid and InterfaceScience2011, 363，137)，其優(yōu)點在于熒光分子是通過共價鍵連接到微球的表面，其物理化學性質都比較穩(wěn)定，不易從微球表面解離。但是部分不穩(wěn)定的熒光素分子裸露在微球表面，易受周圍環(huán)境的影響。另外，聚苯乙烯微球表面缺乏一層生物相容性的包被材料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術不足而提供一種高分子熒光微球的制備方法，其特點是以表面帶負電并標記了熒光分子的聚苯乙烯微球為模板，通過自組裝技術，將帶有相反電荷的糖類聚電解質(如硫酸葡聚糖、透明質酸、海藻酸)連續(xù)沉淀到微球表面帶電層上，自組裝成功能微球，制備成多糖高分子包裹的突光微球。此突光微球可穩(wěn)定分散于水相，光學性質穩(wěn)定，并具有良好的生物相容性，且不與常規(guī)的聚合物發(fā)生反應，也不影響抗生素效價，這種方法的最大優(yōu)點是可以把各種不同功能的大分子(如抗體)結合到組裝層，制得的微球在流式細胞儀和細胞標記方面都有很好的應用前景。
[0005]本發(fā)明目的由以下技術措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為重量份數(shù)。
[0006]高分子熒光微球的制備方法包括以下步驟:
[0007]I)表面羧基化聚苯乙烯微球的制備
[0008](I)將引發(fā)劑0.04?0.06重量份，聚乙烯吡咯烷酮0.04?0.3重量份，聚乙二醇單辛基苯基醚0.05?0.1重量份和苯乙烯I重量份溶于無水乙醇:水=100: O?25體積比的混合溶液4?8份，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至40?80°C反應I ?2h ;
[0009](2)將苯乙烯I重量份和烯丙酸0.02?0.06重量份溶于無水乙醇:水=100: O?25體積比的混合溶液4?8份，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至40?80°C;反應15?90min，將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應釜中，繼續(xù)反應10?24h,通過離心除去未反應的單體,并重新分散在pH = 6?8.4的磷酸緩沖溶液中，獲得表面羧基化聚苯乙烯微球；
[0010]2)高分子熒光微球的制備
[0011](I)突光微球的制備
[0012]將I重量份的表面羧基化聚苯乙烯微球溶液置于反應釜中，加入與聚苯乙烯微球表面羧基摩爾當量為I?10的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和聚苯乙烯微球表面羧基摩爾當量為I?10的N-羥基丁二酰亞胺，在室溫下攪拌10?60min，將含有氨基官能團的熒光分子0.001?0.01摩爾當量加入反應體系，并繼續(xù)攪拌反應6?24h，經(jīng)透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得熒光微球；
[0013](2)通過層層自組裝制備表面修飾多糖高分子的微球
[0014]將I重量份的聚苯乙烯微球分散在0.1?ImL超純水中，在攪拌下，滴加到濃度為
1.0?4.0mg/mL,體積為3?1mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液中，持續(xù)攪拌I?4h，離心去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集沉淀，分散于I?2mL超純水中，攪拌下再滴加到濃度為1.0?6.0mg/mL,體積為5?50mL標記或未標記突光分子的多糖類聚電解質高分子溶液中，持續(xù)攪拌I?4h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。
[0015]所述引發(fā)劑為偶氮二異戊腈、偶氮二異丁腈或過硫酸鉀中的任一種。
[0016]所述氨基官能團的熒光分子為熒光素，羅丹明，Cy5中的任一種，發(fā)射波長的范圍涵蓋350?800nm。
[0017]所述兩步分散聚合法制備羧基化的聚苯乙烯微球為模板，平均粒徑為I?ΙΟμπι。
[0018]高分子熒光微球制備方法制備得到的表面修飾多糖高分子的微球。
[0019]表面修飾多糖高分子的微球用于流式細胞儀和細胞標記。
[0020]結構表征與性能測試:
[0021]1.采用掃描電鏡對表面羧基化聚乙烯微球的形貌、粒徑分析測試，詳見圖1所示，
[0022]結果表明:制備的表面羧基化聚乙烯微球形貌規(guī)則，并呈單一分散；其粒徑均一，分布較窄。
[0023]2.采用熒光分光光度計對表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球的熒光光譜分析測試，詳見圖3所示，
[0024]結果表明:表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球分別在最大激發(fā)/發(fā)射波長488/525nm和633/670nm處具有較強的相對熒光強度。
[0025]3.采用激光共聚焦對表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球的熒光分布分析測試，詳見圖4所示，
[0026]結果表明:表面FITC和Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球的熒光分布在微球表面，這主要是因為熒光分子通過化學鍵合的方式附著于聚苯乙烯微球表面。
[0027]4.采用Malvern納米粒度儀對層層自組裝制備的表面修飾多糖高分子的球的電位的變化分析測試，詳見圖5所示，
[0028]結果表明:層層自組裝的成功，當帶正電的電解質聚二烯丙基二甲基胺作為第一層吸附在原本帶負電的聚苯乙烯微球上時，其表面的電位變?yōu)榱?38mV左右，第二層聚陰離子硫酸葡聚糖的組裝使表面電荷的變?yōu)開46mV。
[0029]5.采用配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀對表面FITC功能化的聚苯乙烯熒光微球的應用分析測試，詳見圖6所示，
[0030]結果表明:表面FITC功能化的聚苯乙烯熒光微球相比于聚苯乙烯微球，其陽性為100 %，其熒光強度可滿足流式細胞儀對其的要求。
[0031]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0032]1.本發(fā)明操作簡單，根據(jù)原料投料比調控球粒徑大小，微球殼厚度及組分很容易地通過改變自組裝循環(huán)的次數(shù)和所用材料來控制，同時，殼的尺寸與形狀由所用核的尺度預先確定。
[0033]2.本發(fā)明制備的高分子突光微球,粒度分布均一、具有良好的表面反應能力，易于功能化；
[0034]3.本發(fā)明制備的多糖類高分子熒光微球，較聚苯乙烯微球具有更好的生物相容性；
[0035]4.本發(fā)明制備的多糖類高分子熒光微球，能實現(xiàn)多個熒光編碼，發(fā)射波長的范圍涵蓋350?800nm。熒光微球具有良好的光學性質，廣泛應用于流式細胞儀的分析；
[0036]5.本發(fā)明制備的多糖類高分子熒光微球，能保護不穩(wěn)定的熒光素分子，免受周圍環(huán)境的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0037]圖1 (a)為1.1 μ m粒徑的表面羧基化的聚苯乙烯微球的掃描電鏡，
[0038]圖1 (b)為2.1 μ m粒徑的表面羧基化的聚苯乙烯微球的掃描電鏡
[0039]圖1 (C)為2.6 μ m粒徑的表面羧基化的聚苯乙烯微球的掃描電鏡
[0040]圖1 (d)為3.6 μ m粒徑的表面羧基化的聚苯乙烯微球的掃描電鏡
[0041]圖2為以聚苯乙烯微球為模板的自組裝示意圖。
[0042]圖3 (a)為表面FITC功能化的聚苯乙烯熒光微球的熒光光譜圖。
[0043]圖3 (b)為表面Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球的熒光光譜圖。
[0044]圖4(a)為表面FITC功能化的聚苯乙烯熒光微球的激光共聚焦圖。
[0045]圖4(b)為表面Cy5功能化的聚苯乙烯熒光微球的激光共聚焦圖。
[0046]圖5為聚苯乙烯微球在層層自組裝聚電解質高分子后電位的變化。
[0047]圖6為表面FITC功能化的聚苯乙烯熒光微球的流式分析圖。
[0048]具體實施方法:
[0049]以下通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質的改進和調整。
[0050]實施例1
[0051]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制備
[0052]采用兩步分散聚合法制備表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先將引發(fā)劑偶氮二異戊腈(AMBN)0.12g，穩(wěn)定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP360(Mw = 360000g/mol)0.135g，助穩(wěn)定劑TX3050.15g，和苯乙烯單體3.0g溶于無水乙醇16.15mL和0.85mL超純水混合溶液中，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至60°C反應Ih ;將苯乙烯3g和烯丙酸0.06g溶于無水乙醇7.6mL和0.4mL的超純水的混合溶液中，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至60°C;反應60min,將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應爸中，繼續(xù)反應18h,通過離心(3000rpm, 20min)除去未反應的單體,并重新分散在pH = 7.4的磷酸緩沖溶液中，獲得表面羧基化聚苯乙烯微球；通過掃描電鏡觀察，其粒徑大小為1.1±0.Ιμ--，且分布均一，如圖1(a)所示；
[0053]2.聚苯乙烯熒光微球的標記制備
[0054]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反應釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI) 0.54mg和N-羥基丁二酰亞胺(NHS) 1.62mg,在室溫條件下攪拌15min后，將末端含有氨基功能團的羅丹明0.3mg加入反應體系，室溫條件下攪拌反應10h。經(jīng)透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得突光微球；
[0055]3.通過層層自組裝技術修飾微球表面特性
[0056]層層自組裝的示意圖如圖2。將5mg聚苯乙烯微球分散在0.1mL超純水中，在磁力攪拌條件下，滴加到3mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液(TODA，2.0mg/mL)中，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，用超純水清洗一次,離心收集沉淀,分散于2mL超純水中，攪拌下再滴加到15mL標記或未標記突光分子的硫酸葡聚糖溶液(4.0mg/mL)中多糖類聚電解質高分子溶液，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。
[0057]實施例2
[0058]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制備
[0059]采用兩步分散聚合法制備表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先將引發(fā)劑偶氮二異戊腈(AMBN)0.175g，穩(wěn)定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.7g，助穩(wěn)定劑TX3050.245g，和苯乙烯單體3.125g溶于無水乙醇13mL中，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至60°C反應Ih ;將苯乙烯3.125g和烯丙酸0.125g溶于無水乙醇13mL中，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至60°C;反應90min，將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應爸中，繼續(xù)反應18h,反應完畢后,通過離心(2000rpm, 20min)除去未反應的單體，并重新分散在緩沖溶液中。通過掃描電鏡觀察，其粒徑大小為2.1 ±0.2 μ m，且分布均一，如圖1(b)所示。
[0060]2.聚苯乙烯熒光微球的標記制備
[0061]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反應釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI) 6.54mg和N-羥基丁二酰亞胺(NHS) 11.56mg,在室溫條件下攪拌15min后,將末端含有氨基功能團的Cy50.3mg加入反應體系,室溫條件下攪拌反應10h。經(jīng)透析袋(MWO = 6000?8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得熒光微球；圖3(b)是Cy5標記的突光微球在激發(fā)波長635nm下的發(fā)射光譜。圖4(b)為Cy5標記的熒光微球的激光共聚焦圖。
[0062]3.通過層層自組裝技術修飾微球表面特性
[0063]將5mg聚苯乙烯微球分散在0.2mL超純水中，在磁力攪拌條件下,滴加到5mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液(TODA，1.0mg/mL)中，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集沉淀，分散于2mL超純水中，攪拌下再滴加到25mL標記或未標記熒光分子的硫酸葡聚糖溶液(2.0mg/mL)中多糖類聚電解質高分子溶液，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。
[0064]實例3
[0065]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制備
[0066]采用兩步分散聚合法制備表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先將引發(fā)劑偶氮二異戊腈(AMBN)0.125g，穩(wěn)定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.5g，助穩(wěn)定劑TX3050.175g，和苯乙烯單體3.125g溶于無水乙醇25mL中，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至60°C反應Ih ;將苯乙烯3.125g和烯丙酸0.125g溶于無水乙醇25mL中，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至60°C;反應60min，將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應爸中，繼續(xù)反應18h,反應完畢后,通過離心(1000rpm,20min)除去未反應的單體，并重新分散在緩沖溶液中。通過掃描電鏡觀察，其粒徑大小為2.6±0.2 μ m，且分布均一，如圖1(c)所示。
[0067]2.聚苯乙烯熒光微球的標記制備
[0068]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反應釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI) 6.54mg和N-羥基丁二酰亞胺(NHS) 11.56mg,在室溫條件下攪拌15min后，將末端含有氨基功能團的FITC0.3mg加入反應體系，室溫條件下攪拌反應10h。經(jīng)透析袋(MW0 = 6000?8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得熒光微球；其熒光性質通過熒光分光光度計以及共聚焦表征，圖3(a)是FITC標記的熒光微球在激發(fā)波長488nm下的發(fā)射光譜，圖4 (a)為FITC標記的熒光微球的激光共聚焦圖。
[0069]3.通過層層自組裝技術修飾微球表面特性
[0070]將5mg聚苯乙烯微球分散在ImL超純水中，在磁力攪拌條件下,滴加到1mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液O3DDA, 4.0mg/mL)中，持續(xù)攪拌4h，離心去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集沉淀，分散于2mL超純水中，攪拌下再滴加到50mL標記或未標記熒光分子的硫酸葡聚糖溶液(6.0mg/mL)中多糖類聚電解質高分子溶液，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。通過測量微球電位的變化監(jiān)測自組裝的結果，如圖5所示。
[0071]實例4
[0072]1.表面羧基化的聚苯乙烯微球的制備
[0073]采用兩步分散聚合法制備表面羧基化的聚苯乙烯微球。首先將引發(fā)劑偶氮二異戊腈(AMBN) 0.125g，穩(wěn)定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP55 (Mw = 55000g/mol) 0.375g，助穩(wěn)定劑TX3050.175g，和苯乙烯單體3.125g溶于無水乙醇15mL中，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至60°C反應Ih ;將苯乙烯3.125g和烯丙酸0.187g溶于無水乙醇15mL中，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至60°C;反應60min，將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應爸中，繼續(xù)反應18h,反應完畢后,通過離心(1000rpm,20min)除去未反應的單體，并重新分散在緩沖溶液中。通過掃描電鏡觀察，其粒徑大小為3.6±0.2 μ m，且分布均一，如圖1(d)所示。
[0074]2.聚苯乙烯熒光微球的標記制備
[0075]量取5mL表面羧基化的聚苯乙烯微球溶液(60mg/mL)于反應釜中，加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI) 3.54mg和N-羥基丁二酰亞胺(NHS) 7.08mg,在室溫條件下攪拌15min后，將末端含有氨基功能團的FITC0.3mg加入反應體系，室溫條件下攪拌反應10h。經(jīng)透析袋(MW0 = 6000-8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得熒光微球；
[0076]3.通過層層自組裝技術修飾微球表面特性
[0077]將5mg聚苯乙烯微球分散在0.2mL超純水中，在磁力攪拌條件下,滴加到5mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液(TODA，2.0mg/mL)中，持續(xù)攪拌lh，離心去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集沉淀，分散于ImL超純水中，攪拌下再滴加到25mL標記或未標記熒光分子的硫酸葡聚糖溶液(4.0mg/mL)中多糖類聚電解質高分子溶液，持續(xù)攪拌2h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。
[0078]應用實例I
[0079]將制備的表面修飾多糖高分子的熒光微球，分散于超純水中，濃度大約為16個/mL，置于流式細胞儀中檢測，其激發(fā)波長為488nm，微球個數(shù)設置為50000個，并以為標記熒光的表面修飾多糖高分子的微球為對照組。經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到結果，如圖6所示。流式細胞儀分析結果表明，F(xiàn)ITC標記的熒光微球，能滿足流式細胞儀對其的檢測。
【權利要求】
1.一種高分子熒光微球的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)表面羧基化聚苯乙烯微球的制備 (1)將引發(fā)劑0.04?0.06重量份，聚乙烯吡咯烷酮0.04?0.3重量份，聚乙二醇單辛基苯基醚0.05?0.1重量份和苯乙烯I重量份溶于無水乙醇:水=100: O?25體積比的混合溶液4?8份，加入帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝裝置的反應釜中，攪拌混和均勻，對反應體系通氮氣脫氧處理，然后將上述反應釜置于油浴中，加熱至40?80°C反應I?2h ； (2)將苯乙烯I重量份和烯丙酸0.02?0.06重量份溶于無水乙醇:水=100: O?25體積比的混合溶液4?8份，加入另一反應釜中，對反應體系通氮氣脫氧處理，并加熱至40?80°C ;反應15?90min，將熱的苯乙烯和烯丙酸溶液加入上述反應釜中，繼續(xù)反應10?24h，通過離心除去未反應的單體，并重新分散在pH = 6?8.4的磷酸緩沖溶液中，獲得表面羧基化聚苯乙烯微球； 2)高分子熒光微球的制備 (1)突光微球的制備 將I重量份的表面羧基化聚苯乙烯微球溶液置于反應釜中，加入與聚苯乙烯微球表面羧基摩爾當量為I?10的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和聚苯乙烯微球表面羧基摩爾當量為I?10的N-羥基丁二酰亞胺，在室溫下攪拌10?60min，將含有氨基官能團的熒光分子0.001?0.01摩爾當量加入反應體系，并繼續(xù)攪拌反應6?24h，經(jīng)透析袋(MWO = 6000?8000)透析除去鹽和未反應的熒光分子，獲得熒光微球； (2)通過層層自組裝制備表面修飾多糖高分子的微球 將I重量份的聚苯乙烯微球分散在0.1?ImL超純水中，在攪拌下，滴加到濃度為1.0?4.0mg/mL,體積為3?1mL的聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液中，持續(xù)攪拌I?4h，離心去除上清液，用超純水清洗一次，離心收集沉淀，分散于I?2mL超純水中，攪拌下再滴加到濃度為1.0?6.0mg/mL,體積為5?50mL標記或未標記突光分子的多糖類聚電解質高分子溶液中，持續(xù)攪拌I?4h，離心去除上清液，將沉淀再分散于純水中，離心收集沉淀物，然后將沉淀物分散到超純水中，獲得表面修飾多糖高分子的微球。
2.如權利要求1所述高分子熒光微球制備方法，其特征在于引發(fā)劑為偶氮二異戊腈、偶氮二異丁腈或過硫酸鉀中的任一種。
3.如權利要求1所述高分子熒光微球制備方法，其特征在于氨基官能團的熒光分子為熒光素，羅丹明，Cy5中的任一種，發(fā)射波長的范圍涵蓋350?800nm。
4.如權利要求1所述高分子熒光微球制備方法，其特征在于兩步分散聚合法制備羧基化的聚苯乙烯微球為模板，平均粒徑為I?10 μ m。
5.如權利要求1?4之一所述高分子熒光微球制備方法制備得到的表面修飾多糖高分子的微球。
6.如權利要求5所述表面修飾多糖高分子的微球用于流式細胞儀和細胞標記。
【文檔編號】B01J13/02GK104209071SQ201410387816
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】艾華, 王丹 申請人:四川大學