一種除液體中熱原的凝膠及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種除液體中熱原的凝膠及其制備方法和應(yīng)用，Sepharose6B經(jīng)CNBr活化后，將組氨酸作為配位基結(jié)合于CNBr-Sepharose6B上，通過(guò)與細(xì)菌內(nèi)毒素的類脂A相結(jié)合，達(dá)到去除液體中熱原的目的。該凝膠對(duì)于氨基酸、糖、抗生素、維生素、蛋白酶、抗體、血液制品等含有的細(xì)菌內(nèi)毒素能有選擇地去除，去除率大于90%，且對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)吸附作用。
【專利說(shuō)明】一種除液體中熱原的凝膠及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種除液體中熱原的凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]熱原是指注射劑中存在的一種異物，注射于人體時(shí)，可產(chǎn)生寒顫、高熱甚至休克等不良反應(yīng)，其主要來(lái)源為革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素。微量的細(xì)菌內(nèi)毒素0.03EU/ml(相當(dāng)于10pg/ml)對(duì)人體器官有損害(人體l_5ng/kg就能引起人的體溫上升)。如果大量的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)入人體，可以引起人體的休克，甚至死亡。所以當(dāng)藥品經(jīng)注射進(jìn)入人體血液中時(shí)，要嚴(yán)格控制注射藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素。中國(guó)藥典根據(jù)各種藥品注射進(jìn)入人體的量，制定了各種藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素允許含量的限度值。
[0003]細(xì)菌內(nèi)毒素為脂多糖，由磷脂多糖、蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物，其毒性成份主要為類脂A，單體分子量為10000-20000道爾頓，聚合體分子量可達(dá)100000-500000道爾頓。雖然它的分子量較大，但結(jié)構(gòu)是條索狀，因此很難用過(guò)濾方法除去細(xì)菌內(nèi)毒素。比如0.2μπι的濾膜都不能完全過(guò)濾細(xì)菌內(nèi)毒素。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)為三個(gè)部分組成:特異側(cè)鏈(抗原)；核心多糖；類脂Α。核心多糖和類脂A之間的葡萄糖胺二糖通過(guò)焦磷酸酯鍵組成的糖脂化合物。它必須在180°C干熱滅菌2小時(shí)或200°C干熱滅菌I小時(shí)方能完全除去。
[0004]由于它是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素。而革蘭氏陰性菌在自然環(huán)境中比比皆是，因此在制藥行業(yè)中是最主要的外源性污染。而藥品如化學(xué)藥品、血液制品在生產(chǎn)制備過(guò)程中經(jīng)常會(huì)混入細(xì)菌內(nèi)毒素。如果用高壓滅菌、最高溫度為121°C，也達(dá)不到完全除去熱原。只能當(dāng)水中內(nèi)毒素含量小于0.03EU/ml時(shí)，高壓滅菌方法，使內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)斷裂成碎片，減弱它的致熱性。但時(shí)常高壓數(shù)日后它們斷片又開(kāi)始聚合，又恢復(fù)它的致熱性。而血液制品更不能加熱。因此，在如何除去液體中細(xì)菌內(nèi)毒素是制藥行業(yè)中極為頭痛的問(wèn)題。曾經(jīng)有人想用活性炭除去各種注射原料中的細(xì)菌內(nèi)毒素，但藥用活性炭吸附內(nèi)毒素能力有限，它只能吸附大的聚合體內(nèi)毒素。許多血液制藥品要求內(nèi)毒素限制值小于0.25EU/ml甚至小于0.03EU/ml以下。這是用活性炭吸附遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到的?；钚蕴课剿|(zhì)中細(xì)菌內(nèi)毒素只能達(dá)到IEU/ml以上。而且對(duì)蛋白質(zhì)和血液制品，活性炭本身會(huì)吸附蛋白質(zhì)，因此此法不適合用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種除液體中熱原的凝膠及其制備方法和應(yīng)用，該凝膠對(duì)于氨基酸、糖、抗生素、維生素、蛋白酶、抗體、血液制品等含有的細(xì)菌內(nèi)毒素能有選擇地去除，去除率大于90%，且對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)吸附作用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種除液體中熱原的凝膠:Sepharose 6B經(jīng)CNBr活化后,將組氨酸作為配位基結(jié)合于CNBr-Sepharose 6B 上。
[0007]制備方法包括以下步驟:
I)取CNBr-S印harose6B干燥粉末于ImM HCl溶液中膨潤(rùn)15分鐘，得到的凝膠置于玻璃砂芯漏斗上，用ImM HCl洗滌，再用0.1M NaHCO3溶液洗凈；
2)取6gL-histidin鹽酸鹽溶解于10ml 0.1M NaHCO3溶液中，并用5M NaOH溶液調(diào)節(jié) pH=9.5 ；
3)取40ml步驟I)的凝膠加入到10ml步驟2)的溶液中，25°C_30°C振動(dòng)處理16小時(shí)，過(guò)濾，將所得凝膠加入到50ml IM NaCl溶液中，室溫下振動(dòng)30分鐘；
4)用玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，所得凝膠用IMNaCl溶液和水各200ml交替洗滌，4°C _8°C保存。
[0008]所述的凝膠通過(guò)層析柱法或試管攪拌法除液體中細(xì)菌內(nèi)毒素。
[0009]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:制得的凝膠對(duì)于氨基酸、糖、抗生素、維生素、蛋白酶、抗體、血液制品等含有的細(xì)菌內(nèi)毒素能有選擇地去除，去除率大于90%，且對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)吸附作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0011]具有與內(nèi)毒素結(jié)合官能團(tuán)的凝膠的制備
要制備凝膠結(jié)合體使其具有與內(nèi)毒素的類脂A相結(jié)合的電位基的官能團(tuán)，我們采用經(jīng)CNBr活化的Sepharose 6B,讓組氨酸作為配位基結(jié)合于CNBr-Sepharose 6B上。
[0012]方法:
1、凝膠的膨潤(rùn)及洗滌:
取一定量CNBr-Sepharose6B干燥粉末于ImM HCL中膨潤(rùn)15分鐘。然后將凝膠置于玻璃砂芯漏斗上，再用ImM HCL洗滌(Ig約用200ml的ImM HCL)。
[0013]Ig干粉約可得3.5ml膨潤(rùn)凝膠。
[0014]2、取L-histidin鹽酸鹽6g溶解于0.1M 10ml的NaHCO3溶液中，并用5M NaOH調(diào)pH9.5 (A 液)。
[0015]3、將以上膨潤(rùn)的CNBr-S印harose6B用冷卻的0.1M的NaHCO3 IL洗凈。(在砂芯漏斗中洗凈)
4、取洗凈的CNBr-S印harose6B 40ml加入100ml A液中混合，于25°C _30°C振動(dòng)16小時(shí)。
[0016]5、接著用過(guò)濾器過(guò)濾以上溶液。
[0017]6、取過(guò)濾后的凝膠結(jié)合體，混懸于50ml IM NaCL中，并在室溫下振動(dòng)30分鐘。
[0018]7、再用玻璃砂芯漏斗過(guò)濾。
[0019]8、用IM NaCL 200ml與水200ml交替洗凝膠結(jié)合體。
[0020]9、以上方法形成L-histidin_Sepharose6B凝膠結(jié)合體(以下簡(jiǎn)稱D-pyroGel)固定化量為0.26mmol/ml。
[0021]10、制備好的 histidine_Sepharose-6B 4°C-8°C保存。
[0022]D-pyroGel的物理性質(zhì)及性能
1、白色或微黃白色球狀顆粒，粒徑約160 μ m。
[0023]2、適應(yīng) pH 范圍(pH3_ll)。
[0024]3、本凝膠屬于親和層析，對(duì)于氨基酸、糖、抗生素、維生素、蛋白酶、抗體、血液制品等含有的細(xì)菌內(nèi)毒素能有選擇去除。........................................................................................................................................................................................................——.................................................................................r.................................................................?
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[0025]以下實(shí)驗(yàn)所有器具均應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)菌無(wú)熱原處理
(一)柱除熱原方法及前處理
1、米用層析柱r=7.5mm H=80mm V= 14cm3
2、柱及D-pyroGel除熱原方法凝膠加酒精堿(4%NaOH酒精)，過(guò)夜
3、用4倍柱體積的無(wú)菌無(wú)熱原水56ml洗柱。
[0026]4、加(λ 2N 醋酸 30ml 洗柱
5、加無(wú)菌無(wú)熱原水80ml洗柱
6、力口IM Nacl 60ml 洗柱
7、加280ml無(wú)菌無(wú)熱原水洗柱
8、加0.1M Tris-HCl pH7.5 140ml 平衡化柱
(二)測(cè)定牛血清白蛋白原液(250mg/ml)細(xì)菌內(nèi)毒素含量取原液 Iml (約 250mg/ml) +24ml 水=25ml (約 10mg/ml)
用靈敏度0.06 Eu/ml、0.25mg/ml的鱟試劑定量?jī)?nèi)毒素。
[0027]結(jié)果如下:
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半定量計(jì)算:0.125 Eu/mlX25=3.125 Eu/ml 說(shuō)明250mg/ml原液中含細(xì)菌內(nèi)毒素為3.125 Eu/ml
(三)加樣品入柱處理25%牛血清白蛋白2.3ml (v/6)
1、牛血清白蛋白用0.1M ρΗ7.5的Tris-HCl ρΗ7.5緩沖液溶解使成250mg/ml。
[0028]2、加入2.3ml (250mg/ml)牛血清白蛋白入柱，靜置3小時(shí)讓樣品中內(nèi)毒素與柱中凝膠充分結(jié)合.3、加洗脫液0.1M Tris- HCl pH7.5洗脫，并用試管收集。收集洗脫液共計(jì)16ml。
[0029]4、低溫冷凍干燥。凍干品加2.3ml無(wú)菌無(wú)熱原水復(fù)溶
(四)測(cè)定復(fù)溶溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素
取過(guò)柱復(fù)溶后溶液Iml (約250mg/ml) +24ml水=約10mg/ml 用靈敏度0.015 Eu/ml,0.03 Eu/ml,0.06 Eu/ml的鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素。
[0030]半定量結(jié)果如下:
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it W0-01> Eu ml 0-03 Eu ini CL06 Eu ml I ""?:: ' 廠|:1

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說(shuō)明:過(guò)柱吸附內(nèi)毒素后的樣品稀釋25倍后細(xì)菌內(nèi)毒素含量< 0.015 Eu/ml。0.015Eu/ml X 25=0.375 Eu/m。這說(shuō)明吸附后的樣品內(nèi)毒素< 0.375 Eu/ml。
[0031]過(guò)柱前原液內(nèi)毒素含量為3.125 Eu/ml, (3.125-0.375)/100%=90%經(jīng)計(jì)算內(nèi)毒素除去率大于90%。
[0032](五)樣品總蛋白回收率計(jì)算
將過(guò)柱后樣品原液稀釋1000倍，用Lowry法測(cè)定其蛋白的含量先用白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

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[0033]結(jié)果:
樣品OD值為0.0982，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.035x+0.0142計(jì)算得樣品總蛋白為24 μ go
[0034]24 μ g X 1000=240mg/ml 蛋白的回收率為 240/250 X 100%=96%。
[0035](六)試管攪拌法除細(xì)菌內(nèi)毒素操作:
以下一切所使用的器具均為無(wú)菌無(wú)熱原處理。如果玻璃器具用250°C I小時(shí)除內(nèi)毒素，如果是橡皮塞等就采用酒精堿法除熱原。
[0036]1、取無(wú)菌無(wú)熱原試管一支，加入已經(jīng)除去熱原試管一支，加入已經(jīng)除去細(xì)菌內(nèi)毒素D-pyroGel凝膠。加入凝膠量為樣品重量的10倍或20倍。
[0037]2、用20rpm轉(zhuǎn)速攪拌I小時(shí)
3、靜置后用針頭吸取樣品上清液
4、用MF膜過(guò)濾上清液樣品
5、用鱟試驗(yàn)法測(cè)定所含細(xì)菌內(nèi)毒素少量樣品時(shí)，攪拌法吸附細(xì)菌內(nèi)毒素 (七)凝膠的再生處理
1、在凝膠D-pyroGel中加入它體積二倍量的酒精堿再生液，靜置過(guò)夜。
[0038]2、將凝膠置柱上，用4倍體積無(wú)菌無(wú)熱原水洗凝膠。
[0039]3、用2倍柱體積的0.2N醋酸洗凝膠。
[0040]4、再用5倍柱體積的無(wú)菌無(wú)熱原水洗凝膠。
[0041 ] 5、用5倍柱體積IM NaCL水溶液洗柱。
[0042]6、用20倍柱體積無(wú)菌無(wú)熱原水洗。
[0043]7、進(jìn)入平衡化程序，用10倍柱體積平衡化緩沖液平衡化 (A)凝膠D-pyroGel保存以上洗脫凝膠若不再使用，就不用加平衡化Baffer，而按以下操作
1、用柱體積4倍的2M NaCL過(guò)柱洗凝膠。
[0044]2、用10倍柱體積無(wú)菌無(wú)熱原水洗柱。
[0045]3、將再生液(酒精堿)柱體積3倍量加入后，室溫靜置12小時(shí)以上。最長(zhǎng)可放置4曰。
[0046]4、如長(zhǎng)時(shí)間保存，用2倍柱體積量20%酒精，加入柱內(nèi)，并將出口密封，在3°C _8°C保存。
[0047]5、再生液的配制
用無(wú)菌無(wú)熱原容器稱1.6g NaOH,加入無(wú)菌無(wú)熱原水160ml溶解,再加40ml酒精。
[0048]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種除液體中熱原的凝膠，其特征在于:Sepharose 6B經(jīng)CNBr活化后,將組氨酸作為配位基結(jié)合于CNBr-Sepharose 6B上。
2.一種制備如權(quán)利要求1所述的除液體中熱原的凝膠的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)取CNBr-S印harose6B干燥粉末于ImMHCl溶液中膨潤(rùn)15分鐘，得到的凝膠置于玻璃砂芯漏斗上，用ImM HCl洗滌，再用0.1M NaHCO3溶液洗凈； 2)取6gL-histidin鹽酸鹽溶解于10ml 0.1M NaHCO3溶液中，并用5M NaOH溶液調(diào)節(jié) pH=9.5 ； 3)取40ml步驟I)的凝膠加入到10ml步驟2)的溶液中，25°C_30°C振動(dòng)處理16小時(shí)，過(guò)濾，將所得凝膠加入到50ml IM NaCl溶液中，室溫下振動(dòng)30分鐘；4)用玻璃砂芯漏斗過(guò)濾，所得凝膠用IMNaCl溶液和水各200ml交替洗滌，4°C _8°C保存。
3.—種如權(quán)利要求1所述的除液體中熱原的凝膠的應(yīng)用，其特征在于:所述的凝膠通過(guò)層析柱法或試管攪拌法除液體中細(xì)菌內(nèi)毒素。
【文檔編號(hào)】B01J20/291GK104190387SQ201410457587
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】丁友玲, 陳曉佳 申請(qǐng)人:福州新北生化工業(yè)有限公司