專利名稱：量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的方法。
背景技術(shù)：
泛素化(WDiquitination)是將泛素連接在目的蛋白上。蛋白的泛素化調(diào)節(jié)了許多重要的生物功能，例如目的蛋白降解，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒出芽(virus budding)，蛋白運(yùn)輸， 受體與通道胞吞作用(receptor and channel endocytosis)。這些功能大都掌控者細(xì)胞的生死。因此，異常的泛素化與許多腫瘤和其它疾病的發(fā)生緊密聯(lián)系起來(lái)。作為底物的蛋白可以被單一泛素或泛素鏈修飾，通過(guò)七種賴氨酸殘基(K6，Kll, K27，K29，K33，K48，K63)之一或氨基端與泛素連接。很多中蛋白質(zhì)都具有泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ubi qui tin-binding domain, UBD),如泛素相互作用單兀(ubi qui tin-interacting motif, UIM)和泛素聯(lián)合結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated (UBA) domain)，能識(shí)別泛素或泛素鏈，這種識(shí)別具有鍵特異性(linkage-specific)。這些蛋白會(huì)與信號(hào)通路下游效應(yīng)物結(jié)合， 意味著泛素化與特定的生物功能密切相關(guān)。由8種鍵形成的單一泛素化或多泛素化決定了泛素信號(hào)功能極大的多樣性。然而，目前對(duì)特定鍵形成的泛素化的功能卻知之甚少，主要是由于缺少適合的研究手段和技術(shù)。目前，獲知泛素連接的種類主要有以下幾種方法使用賴氨酸殘基點(diǎn)突變的泛素， 使用鏈特異性的單克隆抗體或應(yīng)用質(zhì)譜并結(jié)合免疫沉淀、免疫印記和/或熒光顯微鏡。這些方法的缺點(diǎn)在于應(yīng)用賴氨酸殘基突變的泛素不能完全反映野生型泛素的多泛素化，并且過(guò)表達(dá)點(diǎn)突變的泛素可以對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生嚴(yán)重的反向作用；盡管質(zhì)譜與特異性的單克隆抗體可以用來(lái)分析野生型泛素的多泛素化，質(zhì)譜卻需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室無(wú)法應(yīng)用，而單克隆抗體不能用來(lái)量化多泛素化，也不能用來(lái)觀察活細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述不足，我們提出量化和分析鍵特異性多泛素鏈(由野生型泛素組成) 的方法和技術(shù)，既可以用于體外檢測(cè)，又能應(yīng)用于活細(xì)胞。這種技術(shù)基于報(bào)告蛋白單體， 例如β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)、人源化的Gaussia Iuciferase或者熒光蛋白(如 Venus)，兩個(gè)片段間的互補(bǔ)作用(complementation of fragments of monomeric reporter proteins) 0報(bào)告蛋白的N-端或C-端片段與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)融合表達(dá)，UBD首先結(jié)合于特異泛素鏈，并介導(dǎo)了報(bào)告蛋白片段之間的互補(bǔ)。這樣，泛素鏈的長(zhǎng)度、豐度和細(xì)胞中的定位決定了有多少報(bào)告蛋白片段能夠互補(bǔ)。因此，這一對(duì)UBD融合報(bào)告蛋白被命名為 UCR (Ubiquitin Chain Importer)。應(yīng)用了某種泛素鍵特異性的UBD，UCR就會(huì)特異性的識(shí)別、報(bào)告此種多泛素鏈。在實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)獲得概念驗(yàn)證的體外、活細(xì)胞和固定細(xì)胞的數(shù)據(jù)。UCR技術(shù)的發(fā)展第一次使我們能夠在活細(xì)胞中研究鍵特異性的多泛素鏈。UCR也能提供一種簡(jiǎn)單、通用、穩(wěn)定、可量化的高通量體外分析鍵特異性多泛素鏈的方法。發(fā)展在體外和活細(xì)胞中分析鍵特異性多泛素鏈的新技術(shù)，可以很大程度上促進(jìn)破解癌癥和其他生物系統(tǒng)泛素信號(hào)通路這一謎題，也可促進(jìn)泛素連接酶為靶向的藥物開(kāi)發(fā)。本發(fā)明提供了一種量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的方法，該方法為將報(bào)告蛋白分為N末端片段和C末端片段，將兩個(gè)片段分別與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)融合表達(dá)，然后將上述融合兩個(gè)報(bào)告蛋白片段的UBD同時(shí)與目的樣品作用；當(dāng)UBD結(jié)合于特異多泛素鏈， 報(bào)告蛋白的兩段會(huì)互補(bǔ)形成完整功能的蛋白，然后通過(guò)對(duì)互補(bǔ)形成的完整報(bào)告蛋白檢測(cè)來(lái)量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈。該方法可以檢測(cè)通過(guò)七種賴氨酸殘基(K6，Kll, K27， K29,K33,K48,K63)之一連接的多泛素鏈，優(yōu)選Κ48或Κ63特異性連接的多泛素鏈。本發(fā)明所述的方法既可以用于體外檢測(cè)，又能應(yīng)用于活細(xì)胞。其作用方式如附圖1所示。本發(fā)明還提供了用于上述方法的融合蛋白，融合蛋白由報(bào)告蛋白的N末端片段或 C末端片段與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)通過(guò)linker連接而成；上述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為 UIM，其來(lái)源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)源于大鼠，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。上述的報(bào)告蛋白選自β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)、熒光素酶(Gluc)或熒光蛋白。熒光蛋白可以是Venus，其可以分為N末端片段和C末端片段，優(yōu)選N末端片段和C 末端片段其序列分別如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。報(bào)告蛋白也可以是熒光素酶 (Gluc)，其同樣分為N末端片段和C末端片段，優(yōu)選N末端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。上述報(bào)告蛋白與UBD之間通過(guò)linker連接，所述linker優(yōu)選如SEQ ID NO 6所示linker連接。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.多泛素鏈有8種不同的連接方式，這使得泛素信號(hào)有驚人的功能多樣性。然而， 現(xiàn)有的研究鍵特異泛素化的技術(shù)有局限性，這阻礙了人們對(duì)復(fù)雜的泛素信號(hào)的認(rèn)識(shí)。本發(fā)明所述的UCR技術(shù)，第一次使同時(shí)在體外和活細(xì)胞中研究鍵特異泛素化成為可能。最終我們會(huì)找到全部8種泛素鏈的UCR(現(xiàn)在已有兩種)，在泛素研究領(lǐng)域帶來(lái)技術(shù)變革。UCR技術(shù)的簡(jiǎn)單、通用、穩(wěn)定、可量化和高通量的特性可以使其廣泛應(yīng)用于癌癥、病理領(lǐng)域泛素相關(guān)研究，還有泛素連接酶為靶向的藥物篩選。2.本發(fā)明所述的UCR方法有以下的創(chuàng)新性1)UBD介導(dǎo)的報(bào)告蛋白互補(bǔ)用來(lái)分析和量化鍵特異性泛素化是獨(dú)一無(wú)二的新方法。2)UCR會(huì)是唯一能夠兼顧體內(nèi)(活細(xì)胞)、體外鍵特異性泛素化的技術(shù)?；肬CR技術(shù)可用于研究體內(nèi)、體外野生型和/或內(nèi)源性泛素形成的鍵特異性多泛素鏈；而目前常規(guī)分析泛素鏈類型的方法幾乎完全依賴于應(yīng)用賴氨酸突變的泛素和質(zhì)譜方法。4)體外UCR技術(shù)簡(jiǎn)便、免洗、穩(wěn)定、可量化、高通量、背景低，并且不需要化學(xué)標(biāo)記和昂貴的儀器設(shè)備，也不需要特殊技能，現(xiàn)在沒(méi)有哪一種技術(shù)具有所有這些優(yōu)點(diǎn)。 體內(nèi)UCR是第一種能夠用來(lái)定位內(nèi)源K48和K63泛素鏈并成像的技術(shù)。這些優(yōu)越性會(huì)使 UCR被許多生物學(xué)家采用，并成為重要的藥物篩選技術(shù)。


圖1. UCR技術(shù)原理及方式模擬圖Reporter-N代表報(bào)告蛋白的N末端片段； Reporter-C代表報(bào)告蛋白的C末端片段；報(bào)告蛋白的兩個(gè)片段N末端和C末端分別與鍵特異性UBD融合，報(bào)告基因可以是熒光素酶(Gluc)，內(nèi)酰胺酶(Blac)或者熒光蛋白，如Venus，如圖IA所示；當(dāng)一對(duì)UBD融合蛋白同時(shí)結(jié)合到多泛素鏈上，報(bào)告蛋白的兩段足夠接近，會(huì)互補(bǔ)形成完整功能的蛋白，如圖IB所示；因?yàn)閱误w泛素只能結(jié)合在二者之一，所以僅有泛素單體時(shí)不會(huì)形成互補(bǔ)，這就形成了 UCR技術(shù)的低背景。圖2. UIMEpnl-GlucN/C體外識(shí)別相關(guān)多泛素鏈柱狀圖。圖3. UIMepnl制備的融合蛋白在HeLa細(xì)胞中共表達(dá)檢測(cè)多泛素鏈的結(jié)果A為使用抗polyubiquitin的Π(2抗體的成像圖；B中a_c為使用抗K48特異性抗體的成像圖，e-f 為使用抗K63特異性抗體的成像圖；Aa和Ad中藍(lán)色熒光為polyubquitin染色，Ab為單一 UIMEpnl-VenusN無(wú)熒光，Ac為前兩者的疊加結(jié)果，Ae黃色熒光為完整UCR(UIMEpnl-VenuSN和 UIMEpnl-VenusC)，Af為前兩者的疊加結(jié)果；Ba中藍(lán)色熒光為K48染色，恥黃色熒光為UCR， Bc為錢兩者的疊加結(jié)果，Bd中藍(lán)色熒光為K63染色，Be黃色熒光為UCR，Bf為錢兩者疊加的結(jié)果。圖4.UIMEpnl制備的融合蛋白的活細(xì)胞成像圖圖中左側(cè)的一列圖為發(fā)出黃色熒光的UCR(K48特異多泛素鏈)；中間的一列為藍(lán)色熒光(ECFP)標(biāo)記的表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)；右側(cè)一列為前兩列疊加的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 制備UIMEpnl_GlucN/C及相關(guān)泛素鏈結(jié)合實(shí)驗(yàn)制備UIMEpnl-GlucN/C方法大鼠UIMEpnl基因由RT-PCR得到，去掉信號(hào)肽后的 UIMEpnl的cDNA編碼序列分別與編碼Gluc N端1_93氨基酸(SEQ ID NO 4)的核酸序列和編碼C端94-169氨基酸(SEQ ID NO 5)的核酸序列通過(guò)linker連接進(jìn)入pET28a原核表達(dá)載體(pEI^8a-UIMEpnl-GlucN/C)，其中 linker 的氨基酸序列為 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 6)，此序列使用在所有UBD和報(bào)告蛋白之間，起到增加柔性的作用，使報(bào)告蛋白片斷之間易于接近形成互補(bǔ)(圖1)，但此linker并不僅限于SEQ ID NO 6所示序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)需要確定適合的linker。UIMEpnl-GlucN/C表達(dá)為帶有His標(biāo)簽的蛋白，分別經(jīng)由 Ni柱純化，透析，溶解在PBS中。反應(yīng)體系中使用了 GLuc細(xì)胞裂解緩沖液(Luciferase Cell Lysis Buffer, NEB Catalog#B3321S)，簡(jiǎn)稱 Gluc 緩沖液；兩種 UCR (即 UIMEpnl_GlucN、UIMEpnl-GlucC)；將上述緩沖液和UCR在4°C，反應(yīng)60min，然后加入IOOul熒光素酶底物QOuM)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。測(cè)試結(jié)果如圖2所示。圖2中的7個(gè)柱狀圖示分別代表7種不同的反應(yīng)體系組成，其中1為Gluc緩沖液(20ul)+UIMEpnl-GlucN(3ug) ；2 為=Gluc 緩沖液(20ul) +UIMEpnl-GlucC(3ug) ；3 為=Gluc 緩沖液(20ul)+UIMEpnl-GlucN(l. 5ug) +UIMEpnl-GlucC (1. 5ug) ；4 為含 IOOng K48 多泛素鏈 (Enzo)的Gluc緩沖液(20ul)，不添加UCR ；5 % 含IOOng K63多泛素鏈(Enzo)的Gluc緩沖液(20ul)，不添加UCR ；6為含IOOng K48多泛素鏈(Enzo)的Gluc緩沖液(20ul)+UI MEpnl-GlucN(lug) +UIMEpnl-GlucC(lug) ；7 為含 IOOng K63 多泛素鏈(Enzo)的 Gluc 緩沖液 (20ul)+UIMEpnl-GlucN(lug) +UIMEpnl-GlucC (lug)。結(jié)論由圖2的結(jié)果可以看出，當(dāng)同時(shí)存在多泛素鏈(K48或K63泛素鏈)和兩種 UCR(UIMEpnl-GlucN和UIMEpnl_GlucC)時(shí)，出現(xiàn)了明顯的熒光結(jié)果，而單獨(dú)存在多泛素鏈或兩種UCR時(shí)沒(méi)有明顯的熒光結(jié)果。也就是說(shuō)，上述兩種UCR能夠結(jié)合到K48或K63多泛素鏈，并通過(guò)GlucN和GlucC互補(bǔ)產(chǎn)生熒光效果。因此，在體外，UIMEpnl-GlucN、UIMEpnl-GlucC可定量和/或定性分析檢測(cè)K48和K63多泛素鏈。實(shí)施例2 :UIMEpnl制備的融合蛋白在HeLa細(xì)胞中共表達(dá)檢測(cè)多泛素鏈的結(jié)果方法大鼠UIMsml基因由RT-PCR得到，去掉信號(hào)肽后的UIMEpnlcDNA編碼序列分別與編碼Venus N端1-155氨基酸(SEQ ID NO 2)的核酸序列和編碼C端156-239氨基酸(SEQID NO 3)的核酸序列通過(guò)linker連接進(jìn)入ρ⑶NA3哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 (pCDNA3-UIMEpnl-VenusN/C)，其中 linker 的氨基酸序列為 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO :6)。用 Lipofectamine 2000 (invitrogen, Catalog#11668019)將兩種質(zhì)粒分別或共轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞，24小時(shí)后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用抗polyubiquitin的Π(2抗體(1 1000， Enzo Catalog#BML-PW0755-0100)或抗 K48 多泛素鏈特異性抗體(1 1000, Millipore Catalog#05-1307)或抗K63 多泛素鏈特異性抗體(1 100,Millipore Catalog#05-1308) 和帶有藍(lán)色熒光的二抗免疫染色，高倍顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果如圖3所示。UIMEpnl 與黃色熒光蛋白 VFP 片段融合得到 UIMEpnl-VenusN 和 UIMEpnl_VenusC，二者在HeLa細(xì)胞中共表達(dá)，可觀察到在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的黃色熒光，圖3Ae，而單一片斷在 HeLa表達(dá)時(shí)不發(fā)熒光，圖3Ab。用抗polyubiquitin Π(2抗體標(biāo)記的多泛素鏈有藍(lán)色熒光， 結(jié)果表明藍(lán)色熒光很多與黃色熒光有共同定位，如圖3Ad_f所示。分別用抗K48和抗K63多泛素鏈的抗體標(biāo)記細(xì)胞中的多泛素鏈，結(jié)果如圖所示，在體內(nèi)UIMEpnl-VenuSN和UIMEpnl-VenuSC的黃色熒光與K48多泛素鏈的藍(lán)色熒光有共同定位，而與K63多泛素鏈沒(méi)有共同定位；也就是說(shuō)，在體內(nèi)，UIMEpnl-VenusN和UIMEpnl-VenuSC 能夠特異性結(jié)合K48多泛素鏈，而與K63多泛素鏈沒(méi)有結(jié)合。實(shí)施例3 :UIMEpnl制備的融合蛋白的活細(xì)胞成像圖按照實(shí)施例2中的方法將編碼EGFR-ECFP的質(zhì)粒和上述制備的兩種分別表達(dá) UIMEpnl-VenusN和UIMEpnl-VenusC的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，加入 HBSSJh后用加入表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的無(wú)酚紅培養(yǎng)液代替HBSS，開(kāi)始計(jì)時(shí)。37°C觀察并拍照，分析20min之內(nèi)的圖像，從加入EGF溶液后2-7min開(kāi)始拍照保存圖像，結(jié)果如圖4所示。由上述圖4所示的結(jié)果可以得出上面圖中UCR點(diǎn)與EGFR有共同定位(即圖中 ’ ”所指位置)；而最下面一排三個(gè)圖中指示的UCR點(diǎn)與EGFR沒(méi)有共同定位(即圖中“^ ” 所指位置)；也就是說(shuō)，在體內(nèi)UIMEpnl-VenuSN和UIMEpnl-VenuSC與K48多泛素鏈特異性結(jié)合，且該K48多泛素鏈特異性的UCR(UIMEpnl-VenuSN和UIMEpnl-VenusC)與一少部分帶有CFP 標(biāo)簽的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR-CFP)有共同定位；這與已報(bào)道的有6. 9 %的EGFR被K48泛素化相吻合。由上述實(shí)施例我們得出，本發(fā)明所述的方法的確能夠量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈，特別是本發(fā)明中使用的UIMsml制備的融合蛋白，可以在體外結(jié)合K48和K63多泛素鏈，在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合K48多泛素鏈；即可用于在體外或細(xì)胞內(nèi)定量和/或定性分析檢測(cè)K48和 /或K63多泛素鏈。
權(quán)利要求
1.一種量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的方法，其特征在于將報(bào)告蛋白分為N端片段和C端片段，將兩個(gè)片段分別與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)融合表達(dá)，然后將上述融合兩個(gè)報(bào)告蛋白片段的UBD同時(shí)與目的樣品作用；當(dāng)UBD結(jié)合于特異泛素鏈，報(bào)告蛋白的兩段會(huì)互補(bǔ)形成完整功能的蛋白，然后通過(guò)對(duì)互補(bǔ)形成的完整報(bào)告蛋白檢測(cè)來(lái)量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榉核叵嗷プ饔脝卧?(UIM)或其它UBD。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UIM或其它UBD來(lái)源于哺乳動(dòng)物或其它生物，優(yōu)選來(lái)源于大鼠。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UIM的氨基酸序列如 SEQ IDNO 1 所示。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的報(bào)告蛋白選自內(nèi)酰胺酶 (β-lactamase)、熒光素酶(Gluc)或熒光蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的報(bào)告蛋白為熒光蛋白。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的熒光蛋白為Venus或其它熒光蛋白。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于熒光蛋白Venus或其它熒光蛋白的N端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的報(bào)告蛋白為熒光素酶(Gluc)，其N段氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。
10.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于報(bào)告蛋白與UBD之間通過(guò)linker 連接，所述linker序列如所示SEQ ID NO 6或其它氨基酸linker。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的鍵特異性多泛素鏈為K48或K63特異性連接的泛素鏈。
12.用于量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白由報(bào)告蛋白的N端片段或C端片段與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)通過(guò)linker連接而成。
13.權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)橹形拿Q (UIM)。
14.權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UIM來(lái)源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)源于大鼠。
15.權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其特征在于所述的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UIM的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
16.權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其特征在于所述的報(bào)告蛋白選自β-內(nèi)酰胺酶 (β-lactamase)、熒光素酶(Gluc)或熒光蛋白。
17.權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其特征在于所述的報(bào)告蛋白為熒光蛋白。
18.權(quán)利要求17所述的融合蛋白，其特征在于所述的熒光蛋白為Venus或其它熒光蛋白。
19.權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其特征在于熒光蛋白Venus或其它熒光蛋白的N端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
20.權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其特征在于所述的報(bào)告蛋白為熒光素酶(Gluc)，其N段氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。
21.權(quán)利要求12-20任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于報(bào)告蛋白與UBD之間通過(guò) linker連接，所述linker序列如SEQ ID NO 6所示或其它氨基酸linker。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈的方法，該方法為將報(bào)告蛋白分為N末端片段和C末端片段，將兩個(gè)片段分別與泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)融合表達(dá)，然后將上述融合兩個(gè)報(bào)告蛋白片段的UBD同時(shí)與目的樣品作用；當(dāng)UBD結(jié)合于特異多泛素鏈，報(bào)告蛋白的兩段會(huì)互補(bǔ)形成完整功能的蛋白，然后通過(guò)對(duì)互補(bǔ)形成的完整報(bào)告蛋白檢測(cè)來(lái)量化和/或分析鍵特異性多泛素鏈。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了能夠在體外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)合分析K48或K63特異性多泛素鏈的EPN1的UIM與報(bào)告蛋白制備的融合蛋白。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK102174640SQ20111000635
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者方輝, 沈玉先, 王陽(yáng) 申請(qǐng)人:合肥愛(ài)克森特生物技術(shù)有限公司