專利名稱：檢測微生物的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低血培養(yǎng)物中生物活性及體液中分枝桿菌的檢測時(shí)間(TTD)的方法和設(shè)備。
通?？墒褂醚号囵B(yǎng)小管來測定病人體液，尤其是血液中生物活性物質(zhì)(如細(xì)菌)的存在。將少量血液穿過密閉的橡皮隔片注射進(jìn)含有培養(yǎng)基的無菌小管中，然后在37℃下溫育小管并監(jiān)測微生物的生長。
用于檢測微生物存在的技術(shù)之一包括視覺檢查法。通常，視覺檢查法包括監(jiān)測血液和培養(yǎng)基的液體懸浮液的濁度或最終顏色變化。已知的儀器法測定培養(yǎng)瓶中細(xì)菌生長的代謝副產(chǎn)物二氧化碳含量的變化?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中成熟的方法，如放射化學(xué)法或在二氧化碳光譜線處的紅外光吸收法來完成二氧化碳含量的監(jiān)測。直至現(xiàn)在，這些方法仍需要侵入性的步驟，它們可導(dǎo)致熟知的不同小管間交叉污染的問題。也有人建議在密閉的容器中通過監(jiān)測正和/或負(fù)壓力的變化來檢測微生物的生長。
最近，已開發(fā)出涉及安放在小管內(nèi)部之化學(xué)傳感器的非侵入性方法。這些傳感器通過改變其顏色或改變其熒光強(qiáng)度來對二氧化碳濃度的變化作出反應(yīng)。在已知的自動(dòng)化的非侵入性血液培養(yǎng)系統(tǒng)中，各個(gè)小管的鄰近處放置了單個(gè)光源、光譜激發(fā)/發(fā)射濾光片和光檢測器，這導(dǎo)致一個(gè)小管與一個(gè)小管之間位置敏感性的差異。光源，濾光片和光檢測器的老化效應(yīng)還可引發(fā)其它的問題。大多數(shù)已知的血液培養(yǎng)傳感器所測得的細(xì)菌生長期間的光電流僅產(chǎn)生中等程度的對比率，由于這一事實(shí)的存在，就需要以廣泛而耗時(shí)的校準(zhǔn)步驟和復(fù)雜的檢測規(guī)則來操作這些系統(tǒng)。另外，還需要柔韌的電纜將單個(gè)光源和檢測器與儀器的其它部件連接起來。由于每個(gè)儀器有大量光源，一般為240個(gè)或更多，則當(dāng)單個(gè)光源開始報(bào)廢時(shí)，維修將變得非常不方便而且很昂貴。
通過使用改變其持續(xù)時(shí)間的熒光傳感器可克服以強(qiáng)度為基礎(chǔ)的傳感器配置所帶來的不利。在這種情況下，強(qiáng)度的測量被時(shí)間參數(shù)的測量所取代，強(qiáng)度的變化不會(huì)對傳感器輸出信號再產(chǎn)生影響。已知很多化學(xué)傳感器材料可以隨氧氣濃度、PH、二氧化碳濃度或其它化學(xué)參數(shù)的變化而改變它們的熒光持續(xù)時(shí)間。
通?？衫檬熘南嘁品▉肀O(jiān)測傳感器熒光持續(xù)時(shí)間的變化，在此方法中，激發(fā)光的強(qiáng)度是被調(diào)制的，這就產(chǎn)生了相對于激發(fā)相而言發(fā)生了相移的強(qiáng)度被調(diào)制的熒光發(fā)射。根據(jù)等式，相移角θ取決于熒光持續(xù)時(shí)間τtanθ＝ωτ (1)其中ω＝2πf是光調(diào)制角頻率(circular light modulation frequ-ency)。
從等式(1)可看出在ωτ＝1的條件下，相移法可允許有最大分辨率，dθ/dτ。不幸的是，幾乎所有已知的pH或二氧化碳敏感性熒光團(tuán)衰變時(shí)間的范圍為5ns至500ps，換句話說，需要光調(diào)制頻率f＝1/2πτ的范圍為32MHz至320MHz。
可以以如此高的頻率來完成光強(qiáng)度的調(diào)制，但是它需要僅與激光器聯(lián)合才有效的聲光或電光調(diào)制器。而且，檢測經(jīng)調(diào)制的熒光需要高速、高敏感性的光檢測器，如相當(dāng)昂貴的微電路板光倍增器。結(jié)果，所有商用自動(dòng)化血液培養(yǎng)系統(tǒng)都以強(qiáng)度監(jiān)測為基礎(chǔ)，它們中無一利用分辨時(shí)間的熒光二氧化碳傳感器。
即使可以以較低費(fèi)用來操作以熒光持續(xù)時(shí)間為基礎(chǔ)的傳感器，所有與樣品相關(guān)的人為現(xiàn)象卻保留下來，尤其是不得不提到所謂的“血液背景效應(yīng)”，由于血液自身的新陳代謝作用，其熒光強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間連續(xù)但不可預(yù)料地發(fā)生變化。由于血液背景效應(yīng)隨供體、生長培養(yǎng)基、血液量和其它因素的變化而變化，因此很難或不可能區(qū)分與血液相關(guān)的和與微生物相關(guān)的熒光變化。結(jié)果，檢測規(guī)則系統(tǒng)不得不“加強(qiáng)”，以致檢測時(shí)間相對較長。
本發(fā)明克服了上述問題，所包括的方法和裝置可用于只允許有短的檢測時(shí)間來檢測生物活性物質(zhì)，即使是在常見的由儀器造成的或與樣品相關(guān)的人為現(xiàn)象存在時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明，通過將標(biāo)準(zhǔn)量的樣品，如血液和生長培養(yǎng)基引入密閉容器中，并將樣品與生長培養(yǎng)基在容器中混合即可達(dá)到上述目的。容器被設(shè)計(jì)成通過從外面對容器作用，可使容器內(nèi)的液體樣品分成許多小份樣品，每一小份樣品具有其自己的上頭空間及傳感裝置。被選定的小份樣品的數(shù)目N大于樣品被引入容器時(shí)期望的其中含有的初始微生物的數(shù)目。
與標(biāo)準(zhǔn)血液培養(yǎng)容器相比，當(dāng)體積降低N倍時(shí)，小份樣品中導(dǎo)致氣體濃度或其它參數(shù)的典型變化所需的微生物數(shù)目也降低了N倍。結(jié)果，小份樣品中僅需較少的微生物就可導(dǎo)致傳感器輸出信號有可測量的改變。因此，檢測時(shí)間得到首次降低。
根據(jù)本發(fā)明，所有小份樣品以線形、環(huán)形、矩形、六邊形、統(tǒng)計(jì)學(xué)分布或其它形式的空間陣勢排列。或通過視覺或者通過儀器將所有小份樣品的傳感器信號相互比較。相對于不合微生物的小份樣品而言，一個(gè)或一個(gè)以上小份樣品中有微生物生長會(huì)導(dǎo)致傳感器信號發(fā)生改變。如果至少有一個(gè)小份樣品產(chǎn)生的傳感器信號不同于其鄰居產(chǎn)生的信號，則可認(rèn)為全部樣品為陽性。這樣相對于時(shí)間的傳感器信號的測量轉(zhuǎn)變成相對于距離的傳感信號的測量。
所有不含微生物的小份樣品被當(dāng)作“參照樣品”，即它們可顯示出由儀器、樣品老化、儀器中溫度差異所引起的所有人為現(xiàn)象。尤其是，參照樣品可顯示出所謂的“血液背景效應(yīng)”。在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，只有傳感器信號中的空間差異是微生物生長的指示?；谶@一事實(shí)，所有的人為現(xiàn)象都可排除，對傳感器信號分辨率的重大改善也變得實(shí)際可行。因此，檢測時(shí)間(“TTD”)得到第二次降低。
兩次TTD的降低都為現(xiàn)存的基于生長的系統(tǒng)提供了實(shí)質(zhì)性的改善。例如，72小時(shí)的TTD可縮短為12小時(shí)。對于分枝桿菌的檢測時(shí)間(TB)而言，35天的TTD可縮短為5天。
在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，不需要在規(guī)則的時(shí)間間隔時(shí)相對距離來進(jìn)行傳感器信號的測量。因此，由于放入和取出樣品而開門所引起的所得數(shù)據(jù)的間斷不會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。如上所述，由于開門引起的溫度波動(dòng)效應(yīng)也可排除，檢查所謂的“遲放”的小管的陽性也變得容易得多，因?yàn)殛栃钥僧a(chǎn)生持久的強(qiáng)度相對距離模式，它在任何時(shí)候都可被讀出。
也可以給每個(gè)小份樣品裝備至少兩個(gè)不同的傳感裝置，使除了通過分析不同的傳感器數(shù)據(jù)而進(jìn)行檢測微生物外，還可鑒定微生物。
下列詳細(xì)描述結(jié)合附圖將使本發(fā)明的這些和其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)變得顯而易見。


圖1圖示說明相對小份樣品的行列數(shù)經(jīng)計(jì)算的對細(xì)菌的TTD，假定小份樣品為二維分布的方形格式；圖2圖示說明相對于完成檢測所需要的微生物數(shù)目經(jīng)計(jì)算的細(xì)菌的TTD；圖3圖解說明考慮到通過將樣品分成40×40個(gè)小份樣品而使TTD有所降低時(shí)，相對于完成檢測所需的細(xì)菌數(shù)目的經(jīng)計(jì)算的細(xì)菌的TTD；圖4圖解說明相對小份樣品的行列數(shù)的經(jīng)計(jì)算的分枝桿菌的TTD，假定此行列為二維分布的方形格式；圖5圖解說明相對于完成檢測所需的細(xì)菌數(shù)目的經(jīng)計(jì)算的分枝桿菌的TTD；圖6表示考慮到通過將樣品分成40×40個(gè)小份樣品而使TTD有所降低時(shí)，相對于完成檢測所需細(xì)菌數(shù)目的經(jīng)計(jì)算的分枝桿菌的TTD；圖7表示考慮到通過將樣品分成10×10個(gè)小份樣品而使TTD有所降低時(shí)，相對于完成檢測所需細(xì)菌數(shù)目的分枝桿菌的經(jīng)計(jì)算的TTD；圖8表示根據(jù)本發(fā)明的任何空樣品容器的截面圖；圖9表示注射樣品的過程中樣品容器的截面圖；圖10表示注射樣品并施用外力以分隔樣品之后，樣品容器的截面圖；圖11A表示帶有熒光化學(xué)傳感器的空樣品容器的截面圖；圖11B表示圖11A所示容器經(jīng)接種和溫育之后的底視圖；圖12A表示為散射光子移動(dòng)而設(shè)計(jì)的空樣品容器的截面圖12B表示圖12A所示容器經(jīng)接種和溫育之后的底視圖；圖13表示根據(jù)本發(fā)明用于檢測微生物的裝置；圖14表示闡明由于較小的樣品體積而導(dǎo)致TTD降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖15表示通過比較兩個(gè)小份樣品的傳感器信號闡明TTD降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖16表示根據(jù)本發(fā)明的樣品容器可替代的實(shí)施方案；圖17表示在注射樣品的過程中可替代的樣品容器；和圖18表示注射樣品并施用外力以分隔樣品之后可替代的樣品容器。
根據(jù)本發(fā)明，將標(biāo)準(zhǔn)量的樣品，如血液和生長培養(yǎng)基引入密閉的容器中并完全地相互混合。如果樣品含有少量微生物，K0，接種之后在某一時(shí)間t時(shí)的微生物數(shù)目，K(t)可由下式給出K(t)=K0exp(ln2ttd)----(2)]]>td是樣品中存在的特定微生物的量加倍時(shí)的時(shí)間。
通常，在產(chǎn)生可檢測的傳感器輸出信號變化的容器內(nèi)需要微生物單位體積的某一最低濃度，Cmin。最低濃度Cmin通過等式(3)與微生物的最低數(shù)目，Kmin相關(guān)Kmin＝CminV0(3)其中V0是整個(gè)容器的體積。
在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，通過從外部作用于樣品容器，可使體積為V0的樣品分成體積為V的N份分離的亞單位。體積V是V=V0N----(4)]]>聯(lián)合等式(2)至(4)，可得到體積為V的亞單位中微生物種群達(dá)到最低濃度Cmin所需的檢測時(shí)間TTDTTD=tdln(KminVV0)ln2----(5)]]>在推導(dǎo)出的等式(5)中，我們已假定接種后亞單位中僅存在一種單個(gè)微生物，即假設(shè)K0＝1。我們還忽略了所謂的“停滯期”，即微生物在接種后開始繁殖通常需要的時(shí)間間隔。
假定容器為n橫行n縱行亞單位的方形格式，我們可得到等式N＝n2(6)根據(jù)本發(fā)明的容器的檢測時(shí)間為TTD=tdln(Kminn2)ln2----(7)]]>圖1所示的一組圖表示根據(jù)等式(7)，相對行列數(shù)n的檢測時(shí)間TTD。不同的曲線對應(yīng)于不同種微生物，用普通的以生長為基礎(chǔ)的血液培養(yǎng)儀器測出這些微生物之典型TTD值為120、96、72、48、24和12小時(shí)，這些TTD值相應(yīng)于圖1中的n＝1，即橫行為1縱行也為1時(shí)的值。
從圖1中可看出，根據(jù)本發(fā)明將樣品容器分成許多亞單位可使平常的TTD值顯著降低。對于TTD值大的時(shí)間節(jié)省更顯著，使用40橫行40縱行的樣品容器可使通常為120小時(shí)的TTD降低至56小時(shí)。換句話說，TTD可降低64小時(shí)或2.66天。對于通常為12小時(shí)的TTD而言，時(shí)間僅可節(jié)省6小時(shí)。
圖2表示使用根據(jù)本發(fā)明的樣品容器所具有的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)。即由于傳感器信號分辨率增強(qiáng)，進(jìn)行檢測所需要的微生物數(shù)目有所減少。由于經(jīng)常遇到的人為現(xiàn)象幾乎全部被排除，將所需微生物的數(shù)目降低一或兩個(gè)數(shù)量級似乎可行。圖2顯示出如果平常數(shù)目Kmin＝106可降低至105或甚至104時(shí)，預(yù)期的對TTD的效應(yīng)。
圖3表示將樣品分成40×40個(gè)亞單位并降低所需微生物數(shù)目的聯(lián)合效應(yīng)。從此圖中可以看出，一般為120小時(shí)的TTD可縮短至16小時(shí)，相當(dāng)于節(jié)省了104小時(shí)或4.33天。一般為12小時(shí)的TTD可縮短至2小時(shí)。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，圖1、2和3表示的是經(jīng)計(jì)算的TTD值。對整個(gè)TTD有影響的第二個(gè)因素，即停滯期在分析中已被忽略不計(jì)，由于這一事實(shí)，使得生長快的微生物實(shí)際節(jié)省的時(shí)間比經(jīng)計(jì)算出的值要小一些。
圖4所示的一組圖表示根據(jù)等式(7)，相對行列數(shù)n的分枝桿菌檢測時(shí)間TTD。不同的曲線對應(yīng)于不同種分枝桿菌，用常規(guī)的以生長為基礎(chǔ)的TB培養(yǎng)儀器測出它們的典型TTD值為35、28、21、14、7天，這些TTD值相應(yīng)于圖4中n＝1，即橫行為1縱行也為1時(shí)的值。
從圖4中可以看出，樣品容器分成許多亞單位可顯著降低通常的TTD值。對于細(xì)菌而言，TTD值大的時(shí)間節(jié)省得更顯著。使用40橫行40縱行的樣品容器可使通常為35天的TTD降低至16天。換句話說，TTD可降低19天。對通常為7天的TTD而言，節(jié)省的時(shí)間為4天。
圖5闡明了根據(jù)本發(fā)明的樣品容器對于分枝桿菌的第二優(yōu)點(diǎn)，即可減少檢測所需的微生物數(shù)目。圖5圖示說明了如果平常數(shù)目Kmin＝106降低至105或甚至104，預(yù)期對TTD的效應(yīng)。
圖6表示將樣品分成40×40個(gè)亞單位并降低所需微生物數(shù)目的聯(lián)合效應(yīng)。從圖6中可看出，一般為35天的TTD可縮短為5天，相當(dāng)于節(jié)省了30天時(shí)間。一般為7天的TTD可縮短為1天。這里也必須強(qiáng)調(diào)的是，圖4、5和6顯示的是經(jīng)計(jì)算的TTD值，實(shí)際節(jié)省的時(shí)間比經(jīng)計(jì)算的值要小。
圖7與圖6相對應(yīng)，但它顯示出對于僅有10×10個(gè)亞單位的方形樣品容器而言，預(yù)期的TTD降低值。即使這種行列數(shù)較低的容器也可使一般為35天的TTD降低為僅12天。
體現(xiàn)了本發(fā)明的原理和思想的樣品容器1的截面圖示于圖8。將樣品和培養(yǎng)基引入具有彈性阻隔物3的透光容器2中。阻隔物3在容器2內(nèi)緊密相配，它包括許多通孔5，這些孔被內(nèi)壁4分開并以規(guī)則的形式安置。阻隔物可由橡皮、軟塑料或其它彈性材料制成。
具有橡皮樣隔片7的蓋板6被壓進(jìn)阻隔物3的頂端，使得容器2的內(nèi)部與外部環(huán)境不會(huì)發(fā)生氣體交換。阻隔物3壓進(jìn)容器2的深度應(yīng)使阻隔物3的下表面20與容器2的內(nèi)底表面8之間留有小隙15。蓋板6壓進(jìn)阻隔物3的深度應(yīng)使蓋板6的下表面和阻隔物3的上表面30之間留有小隙25。密閉的容器2中充滿了無菌的具有次大氣壓水平的培養(yǎng)氣體。
圖9表示用培養(yǎng)基和/或微生物樣品接種過程中的容器2。使用穿過橡皮隔片7的注射器10完成接種。接種過程中，將容器2維持在水平方向，由于上述的小隙15和25，培養(yǎng)基和樣品混合物可平均分配到容器2的內(nèi)底表面8上。
根據(jù)本發(fā)明，接種微生物樣品之后，可對蓋板6施用外力。由于此外力，蓋板6朝阻隔物3的上表面30移動(dòng)。阻隔物3朝容器2的內(nèi)底表面8移動(dòng)。結(jié)果，液體樣品被壓入阻隔物3的通孔5中，并形成具有其自身上頭空間的多個(gè)分離小份樣品。圖10表示施用外部壓力之后的樣品容器1，用包含半剛性框架11和一個(gè)或兩個(gè)鋼夾12的簡單固定裝置將蓋板6和阻隔物3保持在適當(dāng)位置上。
圖11A闡明具有熒光化學(xué)傳感器113的樣品容器100，傳感器113均勻放置于容器102的內(nèi)底表面108上。為了檢測樣品容器100中微生物的生長，可用激發(fā)光照亮容器102的底表面108并用CCD攝像機(jī)監(jiān)測。
圖11B表示由CCD攝像機(jī)看到的經(jīng)接種的樣品容器100的底視圖。小份樣品105的規(guī)則模式顯示了三份樣品110、111、112相對于它們的鄰孔而言，發(fā)射的熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)。在這三份小份樣品110、111、112中有微生物存在。所有其它小份樣品不含微生物，被用作“參照樣品”，它可顯示出由儀器和樣品老化所導(dǎo)致的全部人為現(xiàn)象。例如，熒光化學(xué)傳感器中的所謂“血液背景效應(yīng)”和與熒光產(chǎn)生相關(guān)的樣品與樣品之間的差異效應(yīng)。在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，僅有熒光強(qiáng)度的空間差異可顯示細(xì)菌的生長，由于這一事實(shí)，所有人為現(xiàn)象都可排除，顯著改善熒光強(qiáng)度分辨率也變得實(shí)際可行。所有這些可導(dǎo)致TTD的第二次降低。
根據(jù)本發(fā)明的樣品容器并不局限于使用熒光化學(xué)傳感器。圖12A表示的例子中使用散射光子移動(dòng)(Scattered photon migration)來檢測細(xì)菌存在的大批小份血液樣品。在這種情況下，樣品容器200不含任何傳感器。蓋板206是透光的，容器200從上面用紅色光譜區(qū)的光照亮。圖12B表示從CCD攝相機(jī)所見的經(jīng)接種的樣品容器200的底視圖。小份樣品的規(guī)則模式顯示出三份樣品210、211、212相對于它們的鄰孔而言，發(fā)射的紅光強(qiáng)度有所減少。在這三份小份樣品中存在有微生物。
行列中央的第四個(gè)黑點(diǎn)215是由蓋板206上的不透明橡皮隔片207引起的。在設(shè)計(jì)成可使用散射光子移動(dòng)的所有樣品容器中都存在這一中央點(diǎn)。小份樣品二維排列中該中點(diǎn)的位置非常明確，因此通過使用適當(dāng)?shù)能浖胧┛蓮姆治鲞^程中將此點(diǎn)排除。
需再次強(qiáng)調(diào)的是，由于使用了許多小份“參照樣品”，根據(jù)本發(fā)明的樣品容器可允許補(bǔ)償幾乎所有與儀器，傳感器和樣品相關(guān)的人為現(xiàn)象。作為這種人為現(xiàn)象的例子，我們將討論為了放入和取出樣品容器而進(jìn)行的開門。
在普通的血液培養(yǎng)和TB儀器中，開門顯示出嚴(yán)重的問題。開門的后果是溫暖的空氣從內(nèi)部逃散，以致儀器內(nèi)部發(fā)生較大的溫度變化。這種較大的溫度變化反過來作用于樣品容器并導(dǎo)致樣品容器內(nèi)部化學(xué)傳感器較顯著或較不顯著的溫度變化。
大多數(shù)傳感器以輸出信號的變化對溫度變化作出反應(yīng)，因此在開門期間和開門后的某段時(shí)間間隔內(nèi)需要中斷整個(gè)儀器的數(shù)據(jù)獲得過程。這段時(shí)間間隔依據(jù)特定的儀器和傳感器設(shè)計(jì)為0.5至1小時(shí)。中斷數(shù)據(jù)獲得程序會(huì)導(dǎo)致對微生物的存在施用敏感性檢測規(guī)則系統(tǒng)的困難?？偟膩碚f，TTD會(huì)增加，檢測微生物有無時(shí)出錯(cuò)的可能性也會(huì)增加。
與普通儀器相反，在根據(jù)本發(fā)明的儀器中開門幾乎沒有影響。開門也會(huì)引起根據(jù)本發(fā)明的樣品容器中校顯著或較不顯著的溫度變化，但是，這會(huì)導(dǎo)致全部排列的小份樣品較均一或不均一的溫度變化。由于小份“參照樣品”的存在可使均一的溫度變化得到補(bǔ)償，因而不存在問題。其中“參照樣品”的部分傳感器以與在亞單位中顯示微生物生長的部分傳感器相同的方式對溫度變化作出反應(yīng)。
任何不均一的溫度變化總會(huì)顯示出低的“空間頻率”，即穿過小份樣品排列的空間溫度分布隨距離而緩慢變化。與此相反，分離的小份樣品中微生物的生長總會(huì)產(chǎn)生出高的“空間頻率”，即由一個(gè)亞單位至下一個(gè)亞單位的傳感器信號會(huì)有變化。因此，使用電像加工(electronic image processing)領(lǐng)域熟知的空間頻率濾過法可排除與溫度相關(guān)的人為現(xiàn)象。換句話說，檢查由CCD攝像機(jī)所得像的強(qiáng)度變化，此變化是越過以小份樣品直徑為級別的特征距離而發(fā)生的。越過較大距離的傳感器信號變化可被排除。這樣，很高的傳感器信號分辨率變得實(shí)際可行，它可導(dǎo)致TTD的降低。類似的解釋適用于上面提到的所有其它人為現(xiàn)象。
圖13表示根據(jù)本發(fā)明用于檢測微生物的裝置300的圖解。含有熒光化學(xué)傳感器13的樣品容器100被水平放置于具有高度散射內(nèi)表面320的圍框314上。通過一排激發(fā)光源315，用激發(fā)光照射容器100中的熒光傳感器113，在光源315和傳感器113之間安放有激發(fā)光濾光片316。由于存在高度散射內(nèi)表面320這一事實(shí)，傳感器113獲得了幾乎均勻分布的激發(fā)光強(qiáng)度。
使用光學(xué)系統(tǒng)317將被傳感器113覆蓋并含有小部分傳感器排列的全部區(qū)域成像于增強(qiáng)型CCD攝像機(jī)319上。光學(xué)系統(tǒng)317和CCD攝像機(jī)319之間放置了一個(gè)發(fā)射光濾光片318。增強(qiáng)型CCD攝像機(jī)319由一個(gè)普通的CCD攝像機(jī)和一個(gè)像增強(qiáng)器組成，優(yōu)選用光纖維將之連接到CCD目標(biāo)上。像增強(qiáng)器能夠顯著增加CCD攝像機(jī)的光電檢測敏感性，從而改善信噪比，因而使熒光強(qiáng)度的分辨率很高。
根據(jù)本發(fā)明，所有小份樣品被放置于線形、環(huán)形、矩形、六邊形、統(tǒng)計(jì)學(xué)分布或其它形式的空間排列中?；蛲ㄟ^視覺或通過儀器將所有小份樣品的傳感器信號相互比較，相對于不含微生物的小份樣品而言，有微生物生長的一個(gè)或一個(gè)以上小份樣品中傳感器信號會(huì)發(fā)生改變。如果至少有一個(gè)小份樣品產(chǎn)生的傳感器信號不同于其鄰孔產(chǎn)生的信號，就認(rèn)為整個(gè)樣品呈陽性。這樣，就將相對時(shí)間的傳感器信號測量轉(zhuǎn)變成相對距離的傳感器信號測量。
在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，不需要在規(guī)則的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行相對距離的傳感器信號測量。因此，檢查所謂的“遲放”樣品的陽性就變得非常容易。實(shí)際上，在到達(dá)血液培養(yǎng)儀器之前就成為陽性的樣品會(huì)產(chǎn)生持久的強(qiáng)度-對-距離模式，該模式在任何時(shí)候都可讀出。
本發(fā)明的思想不局限于基于熒光、吸收、比色法或散射光子移動(dòng)(scattered photon migration)的化學(xué)傳感器。如果利用其它的微生物傳感原理，也可使用本發(fā)明的思路，即將整個(gè)樣品分成小份樣品，小份樣品的數(shù)目要大于預(yù)測的整個(gè)樣品中所含的微生物數(shù)目，并將小份樣品的傳感器信號相互比較。例如可以將所有小份樣品裝配一對電極并監(jiān)測阻抗。在已知的阻抗監(jiān)測儀器中，如電極極化和溫度改變的人為現(xiàn)象會(huì)帶來很嚴(yán)重的檢測問題，這就是為什么尚未發(fā)現(xiàn)阻抗監(jiān)測被廣泛使用的原因之一。
在根據(jù)本發(fā)明的阻抗監(jiān)測裝置中，由于有如此多的參照單元存在，使得所有人為現(xiàn)象都可被排除。在醫(yī)院的實(shí)際情況下，由于病人要么是病的要么是健康的，所以沒有參照樣品可用于常規(guī)的阻抗監(jiān)測。在根據(jù)本發(fā)明的裝置中，通過將整個(gè)樣品分成數(shù)目比微生物數(shù)目還多的大量小份樣品即可得到充足數(shù)量的參照樣品。換句話說，在所用的所有分配情況中，一些小份樣品室存在有細(xì)菌，有一些樣品將沒有任何細(xì)菌。
也可以給每個(gè)小份樣品裝配至少兩種不同的傳感裝置，那樣的話，通過分析不同的傳感器數(shù)據(jù)，即可除了檢測外還可進(jìn)行微生物的鑒定。已發(fā)現(xiàn)每種微生物產(chǎn)生的信號對時(shí)間的模式有所不同，因此通過將至少兩種不同傳感裝置所獲得的模式與數(shù)據(jù)庫比較，即可對陽性小份樣品中的微生物進(jìn)行鑒定。這種數(shù)據(jù)庫是通過在“播種培養(yǎng)(seeded culture)”中接種已知微生物并貯存其信號對時(shí)間模式而得到的。
圖14顯示由于較小的樣品體積使得TTD降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在此實(shí)驗(yàn)中，在體積為86ml的標(biāo)準(zhǔn)血液培養(yǎng)管和體積僅為1ml的小得多的管中接種了相等數(shù)目的微生物。從此圖可以看出，標(biāo)準(zhǔn)管中大約為35小時(shí)的TTD在小管中降低至25小時(shí)。
圖15顯示出通過比較兩個(gè)小份樣品的傳感器信號以闡明TTD降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此處，將圖14中的陽性小份樣品與體積為1ml的陰性小份樣品相比較。大約12小時(shí)后，兩個(gè)傳感器信號之間可看出有明顯不同。換句話說，標(biāo)準(zhǔn)管中原先為35小時(shí)的TTD已降低為12小時(shí)。因?yàn)閂0＝86ml，V＝1ml，由等式(4)可得出N＝86，由等式(6)可得出有效行列數(shù)n＝√86＝9.3?；趫D1，體積的分隔可期望將35小時(shí)的TTD降低為大約24小時(shí)。最終，圖2表明由于傳感器信號分辨率提高，有望使原為24小時(shí)的TTD降低為大約15.8小時(shí)。因此，觀察到的TTD的降低與經(jīng)計(jì)算的TTD降低非常吻合。
當(dāng)一個(gè)或多個(gè)小份樣品已成為陽性后，需要提取樣品材料以進(jìn)行后續(xù)的檢測步驟，如抗微生物敏感性試驗(yàn)。通過改變圖8、10、11和12所示實(shí)施方案中的蓋板6可使樣品的提取較為容易。在圖16所示的實(shí)施方案400中，蓋板是雙層裝置。底層450由彈性或塑料材料制成，上層451由形態(tài)固定的材料制成，兩層通過自粘性材料粘連。上層451起到穩(wěn)固物的作用，其上為阻隔物403中的每個(gè)通孔留有一個(gè)小開口。這可使人將注射器插入其中。
在圖16所示的樣品容器400中，透光的容器402由外形穩(wěn)固的塑料材料制成。熒光化學(xué)傳感器413被放置于內(nèi)底，容器配備有第一組夾子452，它可將上層451保持在其原有的位置。
圖17顯示出注射樣品過程中的樣品容器400，圖18表示注射了樣品并施用外部壓力以分隔樣品之后的相同容器。在圖18中，可看出第二組夾子453，它可將上層451保持在其最終的位置上。由于許多熒光傳感器包括如硅酮橡膠的彈性材料這一事實(shí)，圖18所示的實(shí)施方案中阻隔物403不需要是易曲性的。
下列表1顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的樣品容器和裝置獲得的初步結(jié)果。此表列出了在常規(guī)自動(dòng)化血液培養(yǎng)儀器以及根據(jù)本發(fā)明的樣品容器和裝置上監(jiān)測樣品觀察到的檢測時(shí)間(TTD)，以小時(shí)計(jì)。表1樣品微生物TTD TTD常規(guī)儀器 本發(fā)明儀器1流感嗜血桿菌21.3 ＜12.02流感嗜血桿菌22.0 ＜12.03肺炎鏈球菌 27.7 ＜12.04肺炎鏈球菌 28.1 ＜12.05Corynebacterium jeikeium27.8 ＜12.06Corynebacterium jeikeium30.1 ＜12.07新型隱球酵母53.6 ＜17.08新型隱球酵母52.1 ＜17.0
權(quán)利要求
1.一種檢測微生物的方法，它包括下列步驟提供一個(gè)密閉的容器；將樣品和生長培養(yǎng)基引入密閉容器中以在其中形成液體樣品；將密閉容器內(nèi)的液體樣品分成多個(gè)小份樣品，使每個(gè)小份樣品都具有其上頭空間和傳感裝置，其中預(yù)先選定的小份樣品的數(shù)目大于將液體樣品引入容器時(shí)預(yù)期的液體樣品內(nèi)最初含有的微生物的預(yù)定數(shù)目；監(jiān)測每個(gè)傳感裝置并將每個(gè)傳感裝置相互比較；和根據(jù)對傳感裝置的比較，確定是否出現(xiàn)微生物生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)多個(gè)小份樣品被分開時(shí)，它們被放置于特定的空間排列中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該空間排列為線形。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該空間排列為環(huán)形。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該空間排列為矩形。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該空間排列為六邊形。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該空間排列為統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該比較步驟包括視覺比較每個(gè)傳感裝置的每個(gè)信號以鑒定在多份樣品之一中的微生物生長。
9.一種在具有化學(xué)傳感器的樣品容器中檢測微生物的裝置，其中包括接收樣品容器以使化學(xué)傳感器被水平定位于圍欄內(nèi)的裝置；通過一系列激發(fā)光源用激發(fā)光照亮所說傳感器的裝置；在每個(gè)激發(fā)光源和所說傳感器之間放置激發(fā)光濾光片以確保所說傳感器可接受幾乎均勻分布的激發(fā)光強(qiáng)度；所說傳感器已被所說激發(fā)光激發(fā)后，用以捕捉所說傳感器之成像的光學(xué)系統(tǒng)；用以將所說像分成表示多個(gè)小份樣品空間排列的數(shù)據(jù)的裝置；和分析所說空間排列以檢測一個(gè)或多個(gè)所說多個(gè)小份樣品中的微生物的裝置。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的裝置，其中所說樣品容器進(jìn)一步包括一個(gè)透光的容器，用以盛裝樣品和培養(yǎng)基；一個(gè)所說透光容器內(nèi)部的阻隔物，所說阻隔物具有被多個(gè)內(nèi)壁分開的多個(gè)通孔，該通孔以一種模式排列；具有橡皮樣隔片的蓋板，它被壓入所說的阻隔物中以使所說容器的所說內(nèi)部與所說容器的所說外部之間沒有氣體交換發(fā)生，所說阻隔物被壓入所說透光容器的位置應(yīng)使所說阻隔物的所說較低的一邊與所說透光容器的所說內(nèi)底表面之間留有小隙，所說蓋板被壓入所說阻隔物的位置應(yīng)使所說蓋板與所說阻隔物的所說較上的一邊之間留有小隙，和具有次大氣壓水平的無菌培養(yǎng)氣體。
全文摘要
本發(fā)明描述了檢測培養(yǎng)容器中微生物的方法和裝置。該容器包括具有多個(gè)道孔的阻隔物以將樣品分成多個(gè)小份樣品。每個(gè)小份樣品具有其自己的上頭空間和傳感器。小份樣品的空間排列由CCD攝像機(jī)讀出，并分成小份樣品以產(chǎn)生導(dǎo)致檢測時(shí)間顯著降低的空間排列。
文檔編號B01L3/00GK1140763SQ9611023
公開日1997年1月22日 申請日期1996年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日
發(fā)明者克勞斯·W·伯恩德 申請人:貝克頓迪金森公司