專利名稱：快速篩選分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及快速篩選大量分析物，包括快速篩選作為有潛力藥物的液體狀化學(xué)化合物的方法。
背景技術(shù)：
目前作為藥物使用的有潛力的化合物候選物的鑒定，是通過篩選程序和/或合理的藥物設(shè)計(jì)而完成的。此藥物設(shè)計(jì)觀念起初提供了廣泛的成功期望，但此方法在實(shí)踐上尚未獲成功，這主要是由于對分子構(gòu)造和受體位點(diǎn)之間的關(guān)系，缺少充分的了解。
因此，化合物篩選仍是快速鑒定和選擇作為候選藥物的先導(dǎo)化合物的所選技術(shù)。目前使用各種高通量篩選(HTS)的方法從化合物中篩選出有潛力的候選藥物。然而，由于無法取得可同時處理大量液體化合物的設(shè)備，HTS的速度和成本-效果受到限制。
在目前的HTS中，作為執(zhí)行分析的標(biāo)準(zhǔn)裝置，微滴定盤(microtitreplate)扮演中心角色。微滴定盤決定液體處理設(shè)備，例如，可程序化的液體處理工作臺的設(shè)計(jì)，以及用于過濾、清洗、讀取及其他涉及HTS的操作的微滴定盤周邊也得以發(fā)展。
為了滿足不斷增加的高生產(chǎn)量需求，以微滴定盤為基礎(chǔ)的裝置已與自動化的操縱器結(jié)合為一體。微滴定盤的重要作用和持續(xù)增加的生產(chǎn)量需求，使更大和更復(fù)雜的HTS模件得以產(chǎn)生。該復(fù)雜的模件包括自動化的軌道，以接近更寬闊的表面、自動化和更大的微滴定盤培養(yǎng)箱以及儲存丟棄物的裝置。此外，需要復(fù)雜的操作程序及整合軟件，來恰當(dāng)管理所有的硬件成份。
微滴定盤的中心角色也決定典型篩選方法的其他方面，例如，化學(xué)資料庫方面。傳統(tǒng)上，化合物是在中心化學(xué)儲藏庫中得以合成、儲存及登記，其中，新的化合物是在組織內(nèi)部或外部的生物分析實(shí)驗(yàn)室的要求下得到發(fā)送。通常，每個新的化合物在每個新的分析之前，都必須秤重并溶解。因此，能分別得到并常規(guī)地獲得化合物是必要的。因此，能分別得到并常規(guī)地獲得化合物是必要的。受最新HTS系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和容量所驅(qū)，正努力使化合物的物理儲存條件適應(yīng)微滴定盤的格式。因此，溶解于二甲基亞砜(DMSO)的化合物貯存液儲存在微滴定盤格式中，這樣每個化合物可通過其位置而定位。
HTS基礎(chǔ)建設(shè)的基礎(chǔ)仍是96孔的標(biāo)準(zhǔn)微滴定盤，并且，發(fā)展至今的大多數(shù)篩選系統(tǒng)，都使用此格式。
然而，高密度的微滴定盤(例如，384-、864-、1536-及9600孔的盤子)與大部分為96孔盤所設(shè)計(jì)的裝置并不相容。由于篩選格式未來可能會有相當(dāng)大的改變，因此篩選系統(tǒng)必須具有充分的彈性以適應(yīng)這個挑戰(zhàn)。
至今HTS發(fā)展的進(jìn)度，由快速液體操作系統(tǒng)的發(fā)展決定，其可操作小量的液體，以便在微滴定盤格式中進(jìn)行小型化分析，為處理不斷增加的待篩選化合物，微滴定盤孔洞的數(shù)目已急劇增多，然而，隨著孔洞數(shù)目的增加，孔洞的體積容量就會急劇減少。因此，很明顯由于物理性限制，此趨勢會變成一種自我限制的趨勢，該物理性限制是由涉及一般組織培養(yǎng)的生物化學(xué)平衡所致，其中pH的控制、二氧化碳的交換、濕度和溫度都非常重要，且這些參數(shù)在高密度微滴定盤所使用的狹小格體積中很難控制。
使用高密度微滴定盤格式的一個問題是，不可能輕松獲得劑量反應(yīng)曲線所要求的系列稀釋。例如，不可能在這樣的孔洞中進(jìn)行系列稀釋，因此系列稀釋必須在孔洞的外部進(jìn)行。然而，即使以這樣的方式進(jìn)行連續(xù)稀釋時，操作者仍會有篩選過程中液體處理方面的問題。因此，對于連續(xù)稀釋，操作者目前僅能有效地使用96孔的微滴定盤。另外，即使是在自動化控制之下處理化合物，在任何給定時間處理的化合物的數(shù)目，一般是8或12，最大值是96。
我們迄今沒有發(fā)現(xiàn)任何可同時處理大量分析物的系統(tǒng)，以同時篩選100種或更多或甚至多達(dá)1000種的分析物，此后稱為更大量的分析物。
因此，需要同時篩選大量分析物的方法，并且此方法可消除現(xiàn)今HTS系統(tǒng)的困難和限制。
也需要以簡化的鑒別和取回HTS分析物的方式同時操作大量分析物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速篩選分析物的方法，包括下列步驟(a)同時將多種要篩選的分析物，加到一種或多種的固體支持物上，使得分析物之間互相分開；(b)將該帶有分析物的固體支持物，與半固體或液體培養(yǎng)基中的目標(biāo)物接觸，藉此該分析物從固體支持物中釋放至目標(biāo)物；以及(c)測量分析物-目標(biāo)物的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可同時操作數(shù)千個不同的分析物。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟(a)包括(ⅰ)在分別可鑒別的容器中處理分析物；以及(ⅱ)將分析物從容器轉(zhuǎn)移至固體支持物，以這樣的方式使每個容器的待轉(zhuǎn)移內(nèi)容物，與其他容器的內(nèi)容物分開。
分別可鑒別的容器優(yōu)選選自管子(包括毛細(xì)管)、筆(包括繪圖筆)以及列印頭(print nead)，或任何可儲存分析物并可直接將分析物加到所給的固體支持物上的容器。
此外，優(yōu)選地，分別可鑒別的容器是一種毛細(xì)管的陣列(array)，每一個毛細(xì)管可根據(jù)其在陣列中的位置而鑒別，其中，是通過經(jīng)毛細(xì)管的開口端，將分析物分配來完成分析物至固體支持物的轉(zhuǎn)移。
特別優(yōu)選的陣列是在同軸或螺旋形陣列中處理的個別容器。
可通過將所述分析物從毛細(xì)管開口端分配剄固體支持物上來完成分析物到固體支持物的轉(zhuǎn)移，毛細(xì)管和固體支持物可以直接接觸，也可以不直接接觸。
可以將多種數(shù)量的分析物移至固體支持物。因此，如果需要的話，通過改變轉(zhuǎn)移液滴的大小，操作者可完成系列稀釋。
毛細(xì)管中分析物的同時轉(zhuǎn)移，可通過用壓電(piezoeletric)元件施以刺激例如壓力的改變來完成?；蛘?，如果需要的話，操作者可使用高頻率的條件，將液體柱打斷成可分配至固體支持物的小滴。小滴的大小一般將是毫微升(nanolitre)或微微升(picolitre)的體積。
因此，操作者可根據(jù)本發(fā)明而完成一分析格式，其中，分析物并沒有以其目前的分配量而吸取，而是從個別容器中直接加到分析培養(yǎng)基中。
應(yīng)了解的是，此處所述的分別可鑒別的容器，提供了一種儲存原料化合物的方法，該原料化合物可按照需要獲得和使用。因此，分析物的應(yīng)用單元可由組裝在可定位部份中的個別可鑒別的容器所組成，其可作為一個整體自動收回，并且，分析物可直接從其中加到固體支持物。
例如，可鑒別容器的優(yōu)選實(shí)施方案是毛細(xì)管，并且在溶液中的原料化合物，通過毛細(xì)管的作用而在多數(shù)這樣的毛細(xì)管中吸收。
以這個方式，無限數(shù)目的毛細(xì)管可以不需要特別的能量而得以填滿。用原料化合物溶液填滿的毛細(xì)管，可儲存在所需要的溫度及條件下。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可同時將大量的分析物加到固體支持物上。例如，如此處更詳細(xì)所述，操作者可同時將大量等體積的10,000個或更多的化合物，從個別容器(例如毛細(xì)管)陣列中，加到一固體相上?？赏ㄟ^毛細(xì)管與固體支持物的接觸時間來測定所傳遞的化合物的量。分析物的容器，也可以適當(dāng)?shù)厥欠謩e可定位的類似繪圖筆的裝置，以便在所選擇的固體支持物上，同時繪制分析物的平行線。
在化合物傳遞之后，可將能以分離的點(diǎn)或線的形式進(jìn)行處理的化合物留在固體相上以干燥。
在一實(shí)施方案中，固體支持物基本上是平坦的，盤狀-、直角狀-或方塊狀的形式。
固體支持物可包括，當(dāng)分析物加在其上時，可使分析物自發(fā)性釋放的材料。
或者，固體支持物可包括，當(dāng)分析物加在其上時，可使分析物控制性釋放的材料。
在每個例子中，此材料可以是該半固體的培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，當(dāng)每個分析物加到固體支持物上時，分析物在固體支持物上擴(kuò)散，以便產(chǎn)生一濃度梯度。
以這個方式，如果對候選藥物需要劑量反應(yīng)曲線的話，操作者可獲得分析物的連續(xù)稀釋，而不是只有簡單的陽性或陰性(是/否)結(jié)果。
如同通過被動擴(kuò)散產(chǎn)生濃度梯度一樣，需要的話，利用在半固體的培養(yǎng)基或基質(zhì)中分析物擴(kuò)散延遲，還可消除物理性分離的需要(如在微滴定盤孔洞的例子)，以及分析物連續(xù)稀釋的必要性。
優(yōu)選地，分析物所加到的固體支持物的表面，其中固體支持物選自聚合物、陶瓷、金屬、纖維素以及玻璃。
此外，優(yōu)選地，該半固體的培養(yǎng)基是在一載體上處理。
在另一實(shí)施方案中，固體支持物是彈性膜或膠布，在其上施加含目標(biāo)物的半固體的培養(yǎng)基，由此，本方法可使用滾輪系統(tǒng)而自動化，經(jīng)過本發(fā)明的各種步驟以使彈性膜或膠布前進(jìn)。
在此實(shí)施方案中，載體可藉由另一層膜或膠布覆蓋，并因此夾在固體支持物及覆蓋層之間。
此外，固體支持物或覆蓋層(如果存在的話)，可提供磁軌以記錄關(guān)于所加的分析物的資料，由此在自動化的方法中測量分析物-目標(biāo)物相互作用的同時可讀取并處理該資料。
在又一實(shí)施方案中，固體支持物本身是一探測器，或形成探測器的一部分。
在此實(shí)施方案中，固體支持物優(yōu)選地是選擇自二氧化硅晶片、帶電荷的裝置以及攝影底片。
固體支持物的表面可涂覆一層膜、分子單層、細(xì)胞單層或Langmuir—Blodgett膜。
所有的這些涂層都可用于控制加到其上的分析物的釋放。
在另一實(shí)施方案中，固體支持物本身是一資料載體，帶有電子、磁性或數(shù)字化形式的資料。
在又一實(shí)施方案中，固體支持物的表面是反射性的。例如，表面可以是光碟(CD)的反射表面。
根據(jù)本發(fā)明的方法，還包括將該光碟復(fù)制到一可寫入光碟的步驟。
在另一實(shí)施方案中，半固體的培養(yǎng)基包括提供半固體或粘性液體環(huán)境的物質(zhì)，把該分析物控制地釋放至該目標(biāo)物中。
優(yōu)選地，提供半固體或粘性液體環(huán)境的物質(zhì)，是選擇自明膠(gelatin)、如瓊脂和瓊脂糖的多糖類以及如甲基纖維素和聚丙烯酰胺的聚合物或所謂的智能材料(intelligent)。這樣的物質(zhì)也可用于控制加到其上的分析物的釋放。
所謂的智能材料是天然及合成的聚合物膠體，其可發(fā)生相轉(zhuǎn)換及臨界點(diǎn)現(xiàn)象，例如，環(huán)境中發(fā)生極微小的變化時相轉(zhuǎn)換可伴發(fā)可逆的、不連續(xù)的數(shù)百倍大的體積改變這種反應(yīng)。
所謂的智能材料的例子是聚合膠體形式的材料，更具體地是水合膠(hydrogels)，其可吸收流體，并且遇到化學(xué)或物理刺激或觸發(fā)時隨即釋放該流體?；瘜W(xué)刺激的例子是pH或離子或溶劑組成物的改變，物理刺激的例子是特定波長或激光束的光、溫度或小的電場的改變。
例如，含有N-異丙基丙烯酰胺(主成份)和光敏性生色團(tuán)、銅的三鈉鹽的膠體，在可見光誘發(fā)下可發(fā)生相轉(zhuǎn)換(Suzuki,A．及Tanaka,T．自然，1990,346:345-347)。
Snowden,M.J．等人，化學(xué)及工業(yè)雜志，7月，1996,531-534頁描述了一系列恰當(dāng)?shù)臒崦艟酆衔铩?br> 其他合適的膠體是由Gel Science公司(波士頓，馬薩諸塞，美國)所銷售的膠體，商標(biāo)名為THERA GEL。
在又一實(shí)施方案中，步驟(a)及(b)是同時實(shí)施。
在仍是另一實(shí)施方案中，將每個分析物加到單一的固體支持物上。
在此實(shí)施方案中，固體支持物優(yōu)選棒狀或球形。
此外，優(yōu)選地，每個帶有分析物的固體支持物，在步驟(b)中與多隔間裝置中的不同隔間的目標(biāo)物相接觸，更特別地，該隔間是在該裝置中的排列的小孔洞。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，分析物容器是小的惰性固體支持物，其中分析物加到其表面上。將固體支持物浸泡到液體相或半固體相中，導(dǎo)致分析物從固體支持物中時間依賴性地釋放到液體相或半固體相中。這樣可得到分析物在液體相或半固體相中的微量稀釋，而不需要使用液體操作裝置。釋放至液體相或半固體相分析物的最終濃度，是通過帶有分析物的固體支持物與液體相或半固體相之間的接觸時間來測定。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用于快速篩選的分析物，優(yōu)選選自化學(xué)化合物、抗原、抗體、DNA探針、細(xì)胞以及帶有目標(biāo)分析物的小珠和脂質(zhì)體。
此外，優(yōu)選地，當(dāng)加到固體支持物時，分析物是溶解在有機(jī)或無機(jī)的溶劑中。
適合地，此溶劑包括所謂的對化學(xué)或物理參數(shù)有反應(yīng)的智能材料，使得每個分析物在加到固體支持物及干燥之后，對該化學(xué)或物理參數(shù)產(chǎn)生液化反應(yīng)。
一優(yōu)選實(shí)施方案中的分析物是作為潛在的候選藥物來篩選的化學(xué)化合物。
優(yōu)選地，目標(biāo)物選自原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、病毒、分子、受體、及其組合。
此處所使用的化合物指任何合成、半合成或天然化合物或其組合。
在一實(shí)施方案中目標(biāo)物是帶有受體功能的細(xì)胞。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)物是帶有單一或多個受體構(gòu)件的哺乳動物細(xì)胞。報告基因的活性及/或表達(dá)，受特定實(shí)驗(yàn)條件的影響，例如，化合物從固體支持物釋放到半固體相的化合物的體外效應(yīng)。
在此實(shí)施方案中所使用的培養(yǎng)單元，典型地是一般用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱類型。
用于測量化合物-細(xì)胞的相互作用的探測器單元，適合地是由結(jié)合有電視攝影機(jī)(例如，dage-MTI CCD72E)的倒置顯微鏡(例如，Zeiss Axiovert 100)，以及具有KS 400基本軟件和KS 400圖解選項(xiàng)的電腦系統(tǒng)(例如，PC 300 MHz Pentium)所組成。倒置顯微鏡還可配備一修飾的掃描臺，以符合所有結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)盤(從6孔洞到至多9600孔洞的格式)和其他如此所述的類型格式，并且配備一步進(jìn)式馬達(dá)(stepper motor)，具有每一周期17,600階的分辨率。KS 400套裝軟件提供簡易的使用菜單，用以進(jìn)入結(jié)構(gòu)、校準(zhǔn)和分析參數(shù)或資料分析說明書。
其他的探測工具包括使用電腦輔助的影像分析器。
在使用粘附細(xì)胞作為目標(biāo)物的情況中，使這些細(xì)胞長滿覆蓋固體支持物的表面，或長滿小珠的表面，然后均質(zhì)化地懸浮于半固體相中。
此外，優(yōu)選地，該分析物-目標(biāo)物的相互作用，是通過使用一種或多種下列方法來測量顯微鏡、比色法、螢光計(jì)法、發(fā)光計(jì)法、光密度計(jì)法、同位素法以及物理的測量。
例如，操作者可聯(lián)合使用顯微鏡檢與螢光。因此，顯微鏡可裝配適合于步進(jìn)式馬達(dá)及攝影系統(tǒng)的落射式螢光(epifluorescence)。個人電腦可控制影像獲取和分析。
應(yīng)了解的是，根據(jù)本發(fā)明的方法，在含有試驗(yàn)性生物系統(tǒng)的半固體培養(yǎng)基中的主要化合物的擴(kuò)散過程，與影像顯微鏡檢系統(tǒng)是偶聯(lián)的。本發(fā)明也可以觀察并測定化合物對原核及真核細(xì)胞的功能效應(yīng)?？墒褂冒裼诎牍腆w培養(yǎng)基中并且表達(dá)單一或多種報導(dǎo)基因的基因工程細(xì)胞完成觀察，其表達(dá)的產(chǎn)物，是一符合高密度螢光影像顯微鏡檢系統(tǒng)的波長性質(zhì)的帶有特定激發(fā)和發(fā)射波長的細(xì)胞內(nèi)螢光發(fā)色團(tuán)。
通過實(shí)施例，本發(fā)明的方法一般地包括下列步驟(a)直接將作為有潛力的候選藥物的待篩選化合物，加到一固體支持物上；(b)將含有感興趣的目標(biāo)物的半固體培養(yǎng)基，鋪到帶有化合物的支持物上；(c)使化合物擴(kuò)散至半固體培養(yǎng)基；(d)培養(yǎng)；(e)觀察和記錄化合物-目標(biāo)物的相互作用。
通過實(shí)施例，如果操作者想要篩選有潛力的藥物或藥物組合物，用于HIV病毒感染個體的治療(其具有所有的AIDS或ARC特征)，則根據(jù)本發(fā)明適合的目標(biāo)物是含有長末端重復(fù)(LTR)啟動子(pLTR-EGFP-C1)的表達(dá)綠色螢光蛋白(GFP)的MT4基因工程細(xì)胞，其保藏于BCCM，保藏日1998年8月20日，保藏編號LMBP 3879。
pLTR-EGFP-C1(4777堿基對)是以pEGFP-C1(Clontech)為基礎(chǔ)。在pEGFP-Cl中，增強(qiáng)的綠色螢光蛋白(EGFP)的表達(dá)，是通過強(qiáng)大的人類巨細(xì)胞病毒(CMV)立早期啟動子(589堿基對)控制的。在pLTR-EGFP-C1中，CMV啟動子由在U3區(qū)域含有高誘導(dǎo)性啟動子的HIV-l長末端重復(fù)LTR(652堿基對)所取代。
這樣的細(xì)胞感染HIV時會由于LTR的活化及GFP的表達(dá)發(fā)出螢光。如果候選藥物抑制HIV，例如，通過抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶或整合酶，螢光會減弱或完全消失，操作者在化合物-目標(biāo)物相互作用區(qū)看到逐漸變黑的區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟(b)一般包括適當(dāng)?shù)姆治鰲l件下，維持分析物及目標(biāo)物在足夠使固體支持物釋放分析物并使該分析物擴(kuò)散至含有目標(biāo)物的液體相或半固體相中的時間內(nèi)。維持適當(dāng)?shù)姆治鰲l件，包括維持正確的溫度、滲透壓、pH、張力及其類似的參數(shù)。這些條件還可由目標(biāo)物的特性決定。
一般地，以哺乳動物細(xì)胞作為目標(biāo)物時，溫度的范圍可從大約4℃到大約50℃,pH的范圍可從大約6.5到大約7.5。從細(xì)胞-分析物最佳作用方式來選擇滲透壓和張力。在物理?xiàng)l件上的唯一限制是，所使用的條件不能對細(xì)胞存活性產(chǎn)生負(fù)面影響，也不能影響分析物-目標(biāo)物的相互作用。
應(yīng)了解的是，本發(fā)明的方法可在一完全整合的系統(tǒng)中執(zhí)行。
本發(fā)明的方法便于資料處理單元的使用。恰當(dāng)?shù)拇祟悊卧ň哂谢衔镨b定的化學(xué)化合物資料庫數(shù)據(jù)、歷史軌跡以及軟件技術(shù)以便于在任何時間內(nèi)獲取和鑒別安裝的資料庫中的化合物。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，分析物的應(yīng)用、分析物-目標(biāo)物的相互作用、培養(yǎng)、探測及數(shù)據(jù)分析過程，是根據(jù)本發(fā)明的完整的篩選方法，由從頭到尾完全自動化的方法連結(jié)起來的。根據(jù)本發(fā)明，快速篩選化合物的自動化方法的一典型實(shí)施例，包括下列步驟1．通過毛細(xì)管傳遞，產(chǎn)生化合物的分離的點(diǎn)或分離的線，而將化合物加到載體表面上，例如，透明膜或盒式磁帶工業(yè)使用的信息載體；2．干燥此載體的表面；3．使包埋在固定厚度的半固體基質(zhì)中的細(xì)胞，在透明膜的表面上形成一層；4．將含有點(diǎn)狀或線狀化合物的載體表面，與作為半固體基質(zhì)載體的膜表面接觸；5．將接觸的膜表面纏繞；6．培養(yǎng)纏繞的膜；7．將膜松開，并暴露至探測和信息讀取單元；8．通過例如螢光顯微鏡影像分析系統(tǒng)，持續(xù)地讀取暴露的膜；以及9．?dāng)?shù)據(jù)分析。
外表面(不帶有化合物或其沒有接觸半固體基質(zhì))可包含有關(guān)所加入的化合物性質(zhì)的數(shù)字化資料，可在樣品分析期間按步驟8所述同時讀取該資料。以這個方式，可同時讀取及處理生物性資料及化合物資料。
附圖簡述

圖1顯示如實(shí)施例1中所說明，細(xì)胞密度為105/毫升時，在半固體基質(zhì)中化合物擴(kuò)散的原理；圖2顯示如實(shí)施例1中所說明，細(xì)胞密度為106/毫升時，在半固體基質(zhì)中化合物擴(kuò)散的原理；圖3顯示如實(shí)施例1中所說明，細(xì)胞密度為107/毫升時，在半固體基質(zhì)中化合物擴(kuò)散的原理；圖4是如實(shí)施例2中所說明的毛細(xì)管支架裝置(8×12)；圖5顯示如實(shí)施例3中所說明，在不含酚紅、10％FCS(胎牛血清)及1％Pen-Strep(青霉素-鏈霉素)的RPMI(Rosemount ParkMemorial Institute)培養(yǎng)液中，表達(dá)GFP(綠螢光蛋白)的MT-4細(xì)胞(LTR啟動子)所示的螢光，(a)不含HIV-1，(b)含有HIV-1；圖6(a)和(b)顯示如實(shí)施例3中所說明，在半固體相(不含酚紅、10％FCS、1％Pen-Strep及0.34％瓊脂的RPMI培養(yǎng)液)中，表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞(LTR啟動子)所示的螢光，(a)不含HIV-1,(b)含有HIV-1；圖7(a)-(e)顯示如實(shí)施例3中所說明，在RPMI培養(yǎng)液(不含酚紅，并補(bǔ)充有10％FCS、1％Pen-Strep)中，表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞(LTR啟動子)所示的螢光，(a)不含HIV-1，(b)含有HIV-1，以及含有HIV-1和終濃度2-5μM，總體積為20μl的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT(c)、3TC(d)、以及Loviride(e)；圖8(a)-(e)顯示如實(shí)施例3中所說明，在RPMI培養(yǎng)液(不含酚紅，并補(bǔ)充10％FCS及1％Pen-Strep)中，0.34％的瓊脂半固體相表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞(LTR啟動子)所示螢光，(a)不含HIV-1,(b)含有HIV-1，以及含有HIV-1和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT(c)、3TC(d)、和Loviride(e)，該抑制劑以產(chǎn)生2.5μM的最終濃度點(diǎn)在(1微升的貯存溶液)固體支持物的表面上，假設(shè)化合物在20微升的半固體相中完全擴(kuò)散；圖9顯示在如實(shí)施例3中所說明HIV-1感染過的MT4細(xì)胞與固體支持物混合時HIV-1感染過的細(xì)胞在半固體相(含0.34％瓊脂糖的RPMI培養(yǎng)基，不含酚紅，含有1％FCS和1％Pen-Strep中所示的螢光，在使用前該固體支持物加有1μl 2.5μM、250nM和2.5nM的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、干燥并置4℃一周。
圖10顯示如實(shí)施例3中所說明，當(dāng)把培養(yǎng)基中的HIV-1感染的細(xì)胞，加到分別含有1微升2.5μM、250nM及2.5nM的反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT、3TC及Loviride的384孔組織培養(yǎng)盤中時，以HIV-1感染的MT-4細(xì)胞，在培養(yǎng)液(RPMI不含酚紅，并補(bǔ)充10％FCS及1％Pen-Strep)中所示螢光；圖11是根據(jù)本發(fā)明的方法，帶有點(diǎn)狀化合物的固體支持物的示意圖；圖12概要地顯示在陣列中毛細(xì)管之間的距離，是如何地改變及適應(yīng)本發(fā)明的方法的特定需求；圖13是根據(jù)本發(fā)明，在固體支持物上的半固體相中，鈣的擴(kuò)散形式；圖14顯示使用本發(fā)明的方法，自動化線上高通量篩選的原理；圖15是一毛細(xì)管整理工具的詳細(xì)分解示意圖；圖16(a)-(e)顯示圖15的毛細(xì)管移動至一微滴定盤，用以充填；圖17顯示圖15毛細(xì)管的充填；圖18顯示一螺旋裝置，用于降低圖15中毛細(xì)管之間的間隔；圖19顯示圖15的個別毛細(xì)管排成螺旋狀陣列；圖20顯示將圖15的毛細(xì)管中的液體，釋放至一固體支持物上的方式；圖21顯示一樣品沉積形式；圖22是一固體支持物與點(diǎn)在其上的分析物的平面圖；圖23顯示半固體相加到固體支持物上。
本發(fā)明的實(shí)施模式將通過下列實(shí)施例進(jìn)一步地說明本發(fā)明實(shí)施例1化合物擴(kuò)散以及與包埋在半固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞的相互作用的原理鈣黃綠素(calcein)，一種細(xì)胞生存的標(biāo)記，以5mM的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO)中。將總體積容量為0.5微升的玻璃毛細(xì)管的頂端與聚苯乙烯表面接觸，使得小滴的鈣黃綠素溶液從毛細(xì)管傳遞到塑料表面。在液滴干燥之后，將半固體培養(yǎng)基中的20μl細(xì)胞懸液懸浮于不含酚紅、補(bǔ)充有10％FCS、1％Pen-Strep和含有0.34％瓊脂的RPMI1640培養(yǎng)基中的MT4細(xì)胞，在干燥的鈣黃綠素位置上鋪成一層。在37℃(潮濕空氣及5％二氧化碳)培養(yǎng)2小時之后，可通過螢光顯微鏡及包埋的MT4細(xì)胞所產(chǎn)生的螢光顯像，而觀察到鈣到半固體相中的擴(kuò)散過程。圖1、2和3顯示了液滴的傳送、干燥和平鋪含有增加密度的包埋MT4細(xì)胞的半固體基質(zhì)的方法。
根據(jù)這些結(jié)果，在固定密度的半固體基質(zhì)中鈣黃綠素?cái)U(kuò)散的距離，也是通過包埋細(xì)胞的數(shù)目來測定。實(shí)施例2在半固體基質(zhì)中高密度化合物的添加及擴(kuò)散的原理一束以鈣黃綠素充填并如圖4所描繪放置(8×12)在一支架裝置中的毛細(xì)管，與聚苯乙烯的表面接觸，使得鈣黃綠素滴從每個毛細(xì)管同時傳遞至聚苯乙烯的表面。支架裝置一般是指10，并包括固定在平面12、13、用以維持毛細(xì)管11相互間所需要的關(guān)系的毛細(xì)管11。干燥之后，把RPMI1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充10％FCS、1％Pen-Strep及0.34％瓊脂)中MT4細(xì)胞的均質(zhì)懸浮液，在此位置上鋪成一層。在培養(yǎng)(潮濕空氣及5％二氧化碳)2小時之后，發(fā)現(xiàn)包埋的MT4細(xì)胞的螢光可反映每個斑點(diǎn)半固定基質(zhì)中鈣黃綠素?cái)U(kuò)散的距離。實(shí)施例3化合物-目標(biāo)物相互作用-抗HIV化合物對于半固體相中含有HIV-1的表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞(LTR啟動子)的螢光效應(yīng)將3種已知具有抗HIV-1活性的化合物(AZT、3TC及Loviride),點(diǎn)在(+/-1微升，如前所述，從貯存溶液中，以毛細(xì)管來點(diǎn))透明的384孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)盤的孔洞底表面上。將孔洞中的化合物干燥并儲存在4℃。
一星期后，從組織培養(yǎng)瓶中收集MT4細(xì)胞，并以107/毫升(密度)懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。再把此細(xì)胞懸浮液平均地分至4個管子中。然后將這些管子以450×g離心10分鐘。把200微升在RPMI培養(yǎng)基中的HIV懸浮液，加到兩管離心后所得到的細(xì)胞沉淀物中，37℃培養(yǎng)2小時。以相同的方式處理另外的兩管，但不加入病毒。培養(yǎng)2小時之后，將瓊脂溶液(39℃)以最終0.34％的濃度，加到含有細(xì)胞及HIV的一管，以及僅含細(xì)胞的一管中。接著，把20微升在瓊脂中的細(xì)胞懸浮液及20微升細(xì)胞/病毒-瓊脂懸浮液，加到如上所述含有點(diǎn)狀化合物的384孔盤的不同孔洞中。
把200微升培養(yǎng)基和200微升含有病毒的培養(yǎng)基，分別加到剩下的兩管細(xì)胞沉淀物中。在37℃培養(yǎng)2小時后，調(diào)整最終體積(使其與瓊脂組成物的最終體積相同)，并且將20微升非感染及感染的細(xì)胞懸浮液，加到如上所述含有點(diǎn)狀化合物的384孔盤的孔洞中。
在加入HIV感染的細(xì)胞之前，將1微升體積的化合物，迅速加到孔洞中?？偡治鲶w積為20微升。
在3天的培養(yǎng)時間后，表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞的螢光，通過螢光顯微鏡及培養(yǎng)盤的讀數(shù)而評估。結(jié)果概述見圖5-10。這些數(shù)據(jù)顯示，把化合物加到固體支持物上(384孔微滴定盤的孔洞)之后，以及在4℃儲存1星期之后，活性(這些化合物對HIV-1感染的保護(hù)效應(yīng))并不會于化合物在液相中的擴(kuò)散過程相異。
此外，所得到的結(jié)果也顯示，可在半固體相中觀察到表達(dá)GFP的MT4細(xì)胞所反映出的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑對HIV感染的濃度依賴性效應(yīng)，使用半固體培養(yǎng)基并不會對化合物的特性和其對HIV-1 RT抑制的有效性產(chǎn)生影響。
本發(fā)明將通過下列僅為舉例的實(shí)施方案的說明，并參考附圖而更進(jìn)一步地得到闡明。
參考圖11，顯示帶有化合物21的固體支持物20，已將這些化合物從每束帶有110支毛細(xì)管的196束毛細(xì)管陣列(未顯示)中，點(diǎn)在固體支持物上，這樣有21,560個化合物點(diǎn)在固體支持物20上。
圖12顯示為滿足本發(fā)明篩選方案的特定需要在陣列中毛細(xì)管之間的距離的變化情況(1.414毫米、1毫米、2.236毫米、2毫米、3.623毫米、3毫米)。
圖13是在固體支持物上的半固體相中，鈣黃綠素的擴(kuò)散形式。通過使用如圖4所描繪的毛細(xì)管化合物支架裝置，其毛細(xì)管中心點(diǎn)相距2毫米，將鈣黃綠素點(diǎn)在聚苯乙烯的表面上。懸浮在半固體相(RPMI1640培養(yǎng)基，10％FCS、1％Pen-Strep、0.34％瓊脂)中的覆蓋的細(xì)胞密度是107細(xì)胞(MT4)/毫升。在2小時的培養(yǎng)期之后，通過螢光顯微鏡進(jìn)行分析。
圖14是根據(jù)本發(fā)明的方法，快速篩選化合物的自動化方法的示意圖。帶有以分離的點(diǎn)狀或線狀加在其表面31上的待篩選化合物、形式為膜或膠布的資料載體30與資料載體33的表面32接觸，該載體也是膜或膠布的形式，并具有包埋在半固體基質(zhì)中的目標(biāo)物。接著，將相應(yīng)的載體30、33纏繞，其表面31及32相接觸，并在溫度、濕度及二氧化碳控制的環(huán)境下培養(yǎng)，使化合物釋放到載體33的表面32。接著松開載體，然后將載體33送至一般顯示在34的分析和資料讀取單元。
在下列圖15-23中，相似的元件是以相同的參考數(shù)字代表。
參考圖15，一般以40顯示用于供應(yīng)毛細(xì)管41的裝置，從其供給點(diǎn)至帶有固定間距的橫斷溝43的輸送帶42進(jìn)行供應(yīng)。輸送帶45逆時針移動時，毛細(xì)管41進(jìn)入通道44，后者可容納單層的毛細(xì)管41，并且輸送帶42以順時針方向移動時，一次傳遞一個到溝43。毛細(xì)管41通過重力及輸送帶45的結(jié)合效應(yīng)，單獨(dú)地通過通道44。每次溝43位于末端46時，毛細(xì)管41就傳遞到那里。
參考圖16(a)-(c)至圖17，顯示牽涉到將毛細(xì)管41轉(zhuǎn)移至微滴定盤47用以充填的步驟。通過顯示在48的夾住裝置，將毛細(xì)管41從輸送帶42舉起。夾住裝置48包括兩個伸長結(jié)構(gòu)49，其通過施加側(cè)力至毛細(xì)管，而從其間夾住多數(shù)毛細(xì)管41。以這個方式，把毛細(xì)管41從輸送帶42轉(zhuǎn)移至微滴定盤47用以充填。在輸送帶42上的溝43的間隔，于在微滴定盤47中孔洞50的間隔是相同的。夾住裝置48舉起并輸送以12管為一組的毛細(xì)管41，此數(shù)目于微滴定盤47的一列中孔油50的數(shù)目相對應(yīng)。在輸送步驟期間，夾住裝置48旋轉(zhuǎn)90°，使毛細(xì)管41的一端落到微滴定盤47的孔洞50中。
夾住裝置48以及毛細(xì)管41可自由地沿著垂直軸移動，使毛細(xì)管41落至微滴定盤47的孔洞50中。毛細(xì)管41在孔洞50中停留的時間足以使在相應(yīng)孔洞50中的液體通過毛細(xì)作用而被吸出。一旦給定的充填時間過去，毛細(xì)管41即被抽出，并且夾住裝置48旋轉(zhuǎn)90°，再次呈現(xiàn)水平方向。
在毛細(xì)管41充填之后，把該毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至螺旋或蠕動裝置51，后者用于減少如圖18所顯示的毛細(xì)管41之間的間隔。將毛細(xì)管41傳遞至螺旋裝置51的末端52。螺旋裝置51的螺線53具有變化的螺距，在末端52大于末端54。隨著螺旋裝置51的旋轉(zhuǎn)，毛細(xì)管41沿著其長度，以箭頭的方向前進(jìn)并且由于改變螺距也使其更接近。在末端54，毛細(xì)管41僅是通過螺線53的壁55而分開。
參考圖19，毛細(xì)管41從螺旋裝置51釋放到膠布56上，后者具有一層粘劑，其中毛細(xì)管41與其鄰接的側(cè)邊粘著在該粘劑上。膠布56以于毛細(xì)管41離開螺旋裝置51的相同速率前進(jìn)。然后膠布56逐漸地卷成一緊密包裝的圓形陣列，如57所示。
參考圖20，一般以60顯示把陣列57的毛細(xì)管41中的液體，釋放至固體支持物61表面的裝置，并且此裝置是相對可移動的。裝置60包括一適于接受該陣列57的外罩62。外罩62連接到一氣泵63上，并需要的話，通過產(chǎn)生一相對于外罩62外部的正壓區(qū)，而迫使液體高于毛細(xì)管41，到固體支持物61的表面上。
圖21顯示在從毛細(xì)管41中添加分析物液滴之后，裝置在固體支持物61上的毛細(xì)管41的陣列57，以及裝置在該固體支持物61上的分離的點(diǎn)狀斑64的形式。
圖22是固體支持物61的平面圖，顯示所加的液體分析物的分離點(diǎn)狀斑64的圓形排列形式。
參考圖23，一般以70顯示在液體分析物干燥之后，把在半固體相71中的目標(biāo)物細(xì)胞，加到固體支持物61的表面72的裝置。裝置70包括臂73及列印頭74。固體支持物61可自由轉(zhuǎn)動，裝置70可自由地在z平面及x或y平面移動，這樣，通過臂73和固體支持物61的聯(lián)合移動，對列印頭74進(jìn)行定位。
權(quán)利要求
1．一種快速篩選分析物的方法，包括下列步驟(a)同時將多種要篩選的分析物，加到一種或多種固體支持物上，使得分析物之間互相分開；(b)將該帶有分析物的固體支持物，與半固體或液體培養(yǎng)基中的目標(biāo)物接觸，藉此該分析物從固體支持物中釋放至目標(biāo)物；以及(c)測量分析物-目標(biāo)物的相互作用。
2．權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括(ⅰ)將分析物置于分別可鑒別的容器中；以及(ⅱ)將分析物從容器轉(zhuǎn)移至固體支持物，以這樣的方式使每個容器的待轉(zhuǎn)移內(nèi)容物，與其他容器的內(nèi)容物分開。
3．權(quán)利要求2的方法，其中分別可鑒別的容器選自管子，如毛細(xì)管；筆，如繪圖筆以及列印頭。
4．權(quán)利要求3的方法，其中該分別可鑒別的容器是一種毛細(xì)管陣列，每一個可根據(jù)其在陣列中的位置而鑒別，其中，分析物至固體支持物的轉(zhuǎn)移過程，是通過經(jīng)毛細(xì)管的開口端將其分散而完成的。
5．權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中該固體支持物是一基本上平坦的，盤狀-、直角狀-或方塊狀的形狀。
6．權(quán)利要求5的方法，其中該固體支持物包括當(dāng)把分析物加在其上時，可使分析物自發(fā)性釋放的材料。
7．權(quán)利要求5的方法，其中該固體支持物包括當(dāng)把分析物加在其上時，使分析物控制性地釋放的材料。
8．權(quán)利要求6或7的方法，其中該材料是該半固體培養(yǎng)基。
9．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中當(dāng)把每個分析物加到固體支持物上時，分析物在固體支持物上擴(kuò)散，以便產(chǎn)生一濃度梯度。
10．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該分析物所加到的固體支持物的表面選自聚合物、陶瓷、金屬、纖維素以及玻璃。
11．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該半固體的培養(yǎng)基位于一載體上。
12．權(quán)利要求11的方法，其中該固體支持物形式是彈性膜或膠布，在其上，施加含目標(biāo)物的半固體的培養(yǎng)基，藉此，本方法可通過使用滾輪系統(tǒng)經(jīng)過本發(fā)明的各種步驟使彈性膜或膠布前進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自動化。
13．權(quán)利要求12的方法，其中該載體可由另一層膜或膠布而覆蓋，藉此夾在固體支持物與覆蓋層之間。
14．權(quán)利要求12-13的方法，其中該固體支持物或覆蓋層(如果存在的話)，可提供磁軌以記錄關(guān)于所加的分析物的資料，藉此可在測量分析物-目標(biāo)物相互作用的同時自動化讀取并處理該資料。
15．權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的方法，其中該固體支持物本身是一探測器，或形成探測器的一部分。
16．權(quán)利要求15的方法，其中該固體支持物是選自二氧化硅晶片、帶電荷的裝置以及攝影底片。
17．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該固體支持物的表面可涂覆一層膜、分子單層、細(xì)胞單層或Langmuir-Blodgett膜。
18．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該固體支持物本身是一資料載體，其帶有電子、磁性或數(shù)字化形式的資料。
19．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該固體支持物的表面是反射的。
20．權(quán)利要求19的方法，當(dāng)從屬于權(quán)利要求17時，其中該表面可以是光碟(CD)的反射表面。
21．權(quán)利要求20的方法，還包括將該光碟復(fù)制到一可寫入的光碟的步驟。
22．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該半固體的培養(yǎng)基包括提供半固體或粘性液體環(huán)境的物質(zhì)，使得該分析物可控制性地釋放至該目標(biāo)物中。
23．權(quán)利要求22的方法，其中該物質(zhì)是選自明膠、多糖類例如瓊脂和瓊脂糖，以及聚合物如甲基纖維素和聚丙烯酰胺，或一所謂的智能材料。
24．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)及(b)是同時地實(shí)施。
25．權(quán)利要求1的方法，其中每個分析物是加到單個固體支持物上。
26．權(quán)利要求25的方法，其中該固體支持物是棒狀或球形。
27．權(quán)利要求25或26的方法，其中每個帶有分析物的固體支持物，在步驟(b)中與一目標(biāo)物，在多隔間裝置的分離的隔間中接觸。
28．權(quán)利要求27的方法，其中該隔間是在該裝置中排列的小孔洞。
29．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該分析物是選自化學(xué)化合物、抗原、抗體、DNA探針、細(xì)胞以及帶有分析物的小珠及脂質(zhì)體。
30．權(quán)利要求29的方法，其中，當(dāng)加到固體支持物時，分析物是溶解在有機(jī)或無機(jī)的溶劑中。
31．權(quán)利要求30的方法，其中該溶劑包括所謂的對化學(xué)或物理參數(shù)有反應(yīng)的智能材料，這樣該化學(xué)或物理參數(shù)使每個加到固體支持物上并干燥的分析物液化。
32．權(quán)利要求29-31的方法，其中該分析物是一化學(xué)化合物。
33．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該目標(biāo)物是選自原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、病毒、分子、受體、小珠及其組合。
34．權(quán)利要求33的方法，其中該目標(biāo)物是帶有報告功能的細(xì)胞。
35．權(quán)利要求34的方法，其中該分析物-目標(biāo)物的相互作用，可通過分析物對細(xì)胞報告功能的效應(yīng)來測量。
36．上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該分析物-目標(biāo)物的相互作用，是通過使用一種或多種下列方法而測量顯微鏡法、比色法、螢光計(jì)法、發(fā)光計(jì)法、光密度計(jì)法、同位素法以及物理的測量。
37．權(quán)利要求1的方法，基本上如前所述參考附圖并如附圖所示。
38．權(quán)利要求1的方法，基本上如前所述參考所附的實(shí)施例。
全文摘要
一種快速篩選分析物如有潛力的候選藥物的方法,包括下列步驟:同時將多種要篩選的分析物,加到一種或多種固體支持物(61)上,使得分析物之間互相分開;將該帶有分析物的固體支持物,與半固體或液體培養(yǎng)基中的目標(biāo)物接觸,藉此該分析物從固體支持物(61)中釋放至目標(biāo)物中;以及測量分析物－目標(biāo)物的相互作用。此方法可同時操作數(shù)千個不同的分析物。當(dāng)分析物加到固體支持物(61)上時,分析物可在其上擴(kuò)散,以便產(chǎn)生一濃度梯度,以及分析物的系列稀釋,如果對候選藥物需要劑量反應(yīng)曲線的話。所述方法易自動化操作。
文檔編號B01L3/00GK1315001SQ98814290
公開日2001年9月26日 申請日期1998年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月8日
發(fā)明者R·W·J·保維爾斯, C·H·S·雷蘭特, K·L·A·范阿克爾 申請人:泰博特克有限公司