一種用于單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于聚合物芯片的加工、制作、修飾及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種用于三維單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]單層細(xì)胞培養(yǎng)是體外細(xì)胞培養(yǎng)的主要方法，它具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易操作、費(fèi)用低、可大量應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作體外藥理毒理研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。但常?guī)的體外單層培養(yǎng)方法不能提供組織正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的環(huán)境條件，而生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)及行為有著重要的影響，體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的基因組是相同的，但不同器官組織中其表型和功能結(jié)構(gòu)不同，如胚胎細(xì)胞異位移植可使細(xì)胞惡化發(fā)展成畸胎瘤，而在子宮中能發(fā)育成正常胚胎；同樣，畸胎瘤細(xì)胞在胚胎中可轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞。在單層細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞附在底物平面上生長(zhǎng)，因缺少立體支架，只能向二維發(fā)展，不能生成細(xì)胞外基質(zhì)。由于缺乏體內(nèi)特異性生長(zhǎng)因子及分化因子作用，細(xì)胞不能分化而失去原體內(nèi)時(shí)的立體形態(tài)。因此，單層細(xì)胞培養(yǎng)所反映的生物學(xué)性狀，與體內(nèi)組織細(xì)胞相差甚遠(yuǎn)。因此為細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的支架系統(tǒng)，創(chuàng)建與原體內(nèi)類(lèi)似的生長(zhǎng)環(huán)境，促使細(xì)胞增殖、分化及呈現(xiàn)出類(lèi)似體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和功能性狀是體外細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢(shì)。細(xì)胞三維培養(yǎng)就是基于上述特點(diǎn)，通過(guò)一些特殊的培養(yǎng)技術(shù)所建立的體外立體培養(yǎng)方法。三維培養(yǎng)體系為細(xì)胞提供類(lèi)似體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的支架或基質(zhì)，細(xì)胞通過(guò)緊密連接和縫隙連接等連接方式建立細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，形成一定的三維結(jié)構(gòu)。三維培養(yǎng)細(xì)胞基因表達(dá)、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動(dòng)與單層培養(yǎng)細(xì)胞均有明顯差異，而與體內(nèi)細(xì)胞更為相似。因此三維細(xì)胞培養(yǎng)既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀(guān)性及條件可控制性，把體外無(wú)細(xì)胞及單層細(xì)胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究聯(lián)系起來(lái)。
[0003]臨床腫瘤治療通常會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)現(xiàn)象，即腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。近年來(lái)雖然對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但臨床上還沒(méi)有可行方法抑制腫瘤細(xì)胞的這種多藥耐藥性。在體外藥物耐藥性研究中通常采用單層細(xì)胞培養(yǎng)模型，該模型的基本單元是單個(gè)瘤細(xì)胞，忽略了腫瘤作為一個(gè)特殊異質(zhì)性群體其細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境和細(xì)胞間的相互作用，因此在此基礎(chǔ)上得到的結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往有很大差異。有研究表明三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能與單層培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞明顯不同，而類(lèi)似與體內(nèi)實(shí)體瘤，用三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究能比較真實(shí)反映腫瘤體內(nèi)情況。在三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞抗腫瘤藥物篩選研究中，腫瘤細(xì)胞多細(xì)胞微球的大小會(huì)直接形象腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的抗藥性。
[0004]近年來(lái)利用制作弧形凹陷微結(jié)構(gòu)形成三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)研究細(xì)胞行為和功能越來(lái)越被人所關(guān)注?，F(xiàn)在報(bào)道的微結(jié)構(gòu)形成三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)一方面可為體外培養(yǎng)細(xì)胞提供與其組織來(lái)源相似甚至相同的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境和細(xì)胞聯(lián)系，從而既有利于各類(lèi)細(xì)胞的分化定向誘導(dǎo)，又有利于細(xì)胞分化表型的維持和增殖；另一方面可望在體外構(gòu)建與各類(lèi)組織、器官相應(yīng)的細(xì)胞三維生長(zhǎng)類(lèi)似物或等同物。而其應(yīng)用領(lǐng)域也涉及干細(xì)胞分化，胰島細(xì)胞功能再生、腫瘤細(xì)胞的抗藥性，體外器官重建等諸多方面。隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的需求，制作弧形凹陷微結(jié)構(gòu)方法也在飛速發(fā)展，主要的方法有:冰刻蝕，軟刻蝕、電子束刻蝕，原位合成法，氣動(dòng)技術(shù)等(1、Park, J.Y.; Hwang, C.Μ.; Lee, S.-H., Ice-lithographicfabricat1n of concave microwells and a microfluidic network.B1medicalMicrodevices2008, 11(1)，129-133 ;2、Xu, Y.;Xie, F.;Qiu, T.;Xie, L.;Xing, ff.; Cheng, J.,Rapid fabricat1n of a microdevice with concave microwells and its applicat1nin embryoid body format1n.B1microfluidics2012, 6(I)，016504)。
[0005]盡管上述方法現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展的較為成熟，但仍有很多因素限制了其更加廣泛的應(yīng)用:軟刻蝕、電子束刻蝕等技術(shù)修飾的精度高，但其需要專(zhuān)業(yè)化的昂貴儀器并且操作復(fù)雜；原位合成法雖然操作簡(jiǎn)單，但其用于原位合成的分子價(jià)格昂貴并且合成的體系有時(shí)會(huì)用到大量有機(jī)試劑；氣動(dòng)方式技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、成本低廉，但所需要的通道模板是要求帶有小孔結(jié)構(gòu)的通透模板，制作方法繁瑣、操作復(fù)雜。上述方法中，只能形成統(tǒng)一大小的凹陷的小孔，不能用一步法形成多個(gè)尺寸的凹陷小孔，而在腫瘤細(xì)胞的藥物篩選中，腫瘤微球的大小對(duì)于抗腫瘤藥物篩選有著直接的影響。
[0006]綜上所述，發(fā)明一種簡(jiǎn)單，快速，可控性強(qiáng)、并且價(jià)格低廉的一步法制作多個(gè)尺寸的制作弧形的用于三維單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片具有十分重要意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供用于單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片及應(yīng)用，以解決以往制作工藝中存在的操作步驟繁瑣復(fù)雜、價(jià)格昂貴，快速形成腫瘤微球及其抗腫瘤藥物的高通量和高內(nèi)涵的藥物篩選。
[0008]本發(fā)明提供了一種用于單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片，該芯片為2層整合芯片，上層為流體小室，長(zhǎng)700微米，寬700微米，高80微米，具有平行的12組平行的微流控單元，每個(gè)單元不同直徑大小的凹陷小孔與流體通道，進(jìn)行平行三維單球水平的抗腫瘤藥物篩選實(shí)驗(yàn)；
[0009]該芯片的制備方法如下:
[0010](I)利用光蝕刻技術(shù)制作含有多個(gè)直徑尺寸的小孔的SU-8聚合物模板；
[0011](2)對(duì)SU-8聚合物模板在85攝氏度加熱5分鐘進(jìn)行熱熔，使小孔的形狀由直角形變?yōu)榘枷菪停?br>[0012](3)對(duì)熱熔后的SU-8聚合物模板進(jìn)行整體的紫外曝光90秒；
[0013](4)將未固化PDMS聚合物溶液(單體與硅烷偶聯(lián)劑體積配比為10:1)傾倒入SU-8聚合物模板上，85攝氏度加熱固化PDMS聚合物溶液40分鐘，剝離固化PDMS聚合物芯片，得到PDMS聚合物反模芯片；
[0014](5)將未固化PDMS聚合物溶液(單體與硅烷偶聯(lián)劑體積配比為10:1)傾倒入上述的PDMS聚合物反模芯片上，85攝氏度加熱固化PDMS聚合物溶液40分鐘，剝離固化PDMS聚合物芯片，得到具有直徑不同的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片；
[0015](6)利用軟刻蝕技術(shù)制作含有流路通道的PDM S聚合物芯片；
[0016](7)利用等離子體儀器不可逆封接含有流路通道的PDMS聚合物芯片和有直徑不同的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片；
[0017](8)對(duì)上述的整合芯片進(jìn)行表面修飾，即得本發(fā)明微流控芯片；
[0018]其中，表面修飾條件為:0.2%PF-127處理4個(gè)小時(shí)，后用無(wú)菌水和PBS溶液各沖洗2次。
[0019]本發(fā)明提供的用于單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片，該方法中所形成的微米級(jí)別的凹孔，該微孔的寬度和結(jié)構(gòu)為設(shè)計(jì)固定，微孔的直徑大小依次設(shè)定為:200，300，400，500，600，700，800微米；凹陷形小孔的深度通過(guò)調(diào)節(jié)乳酸乙酯顯影SU-8聚合物模板的時(shí)間來(lái)控制，時(shí)間為5分鐘，凹陷形小孔的曲率形狀通過(guò)在加熱板調(diào)節(jié)熱熔的加熱時(shí)間來(lái)控制，加熱時(shí)間為5分鐘。
[0020]本發(fā)明還提供了所述微流控芯片的應(yīng)用，該芯片用于形成直徑不同的U87細(xì)胞的三維小球及其抗腫瘤藥物的篩選。
[0021]本發(fā)明提供的微流控芯片的應(yīng)用，先對(duì)弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片進(jìn)行表面修飾，以達(dá)到細(xì)胞不貼附表面的作用，接種U87細(xì)骨細(xì)胞懸液，在重力的條件下，U87細(xì)胞會(huì)自發(fā)的形成三維微球，在形成微球的過(guò)程中，由于小孔直徑的不同，細(xì)胞沉降的數(shù)量不同，會(huì)形成大小不同的U87細(xì)胞微球。
[0022]本發(fā)明提供的微流控芯片的應(yīng)用，所述抗腫瘤藥物的篩選方法為:在微流控芯片每個(gè)功能單元中接種U87細(xì)胞懸液，培養(yǎng)20-24小時(shí)后，U87細(xì)胞形成三維的單個(gè)微球;U87細(xì)胞微球培養(yǎng)4-5天后，加入抗腫瘤藥物處理24-30小時(shí)。
[0023]本發(fā)明提供的微流控芯片的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為白藜蘆醇和PI3K抑制劑P1-103，濃度分別為200微摩/升和1.5納摩/升。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0025]1、可一步法形成多個(gè)尺寸的小孔，用于形成大小不同的腫瘤微球；
[0026]2、還有12個(gè)功能單元，可進(jìn)行流體操作；
[0027]3、無(wú)需昂貴的儀器，操作簡(jiǎn)單、快速；
[0028]4、實(shí)驗(yàn)成本低廉；
[0029]5、不涉及有機(jī)試劑，環(huán)境友好；
[0030]6、可與其它技術(shù)集成化。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為用于單球水平的抗腫瘤藥物篩選微流控芯片設(shè)計(jì)圖；(I)為上層