一種生物識別分子固定到生物芯片的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物識別分子固定到生物芯片上的方法，包括如下步驟：1)生物芯片的表面羥基化；2)使用帶琥珀酸酐基團的硅烷化試劑將表面羥基化的生物芯片的硅烷化；3)硅烷化后的生物芯片表面琥珀酸酐基團水解形成羧基；4)羧基化的生物芯片使用1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N?羥基琥珀酰亞胺的活化；5)活化后的生物芯片表面連接生物識別分子，得到表面修飾有生物識別分子的生物芯片。該方法采用帶琥珀酸酐基團的硅烷化試劑，能夠方便、簡單連接帶氨基的生物識別分子，使生物識別分子能定向排列，形成均勻、致密的單分子結(jié)構(gòu)，提高生物識別分子的識別效率，同時避免了非特異性吸附，從而有效提高生物芯片的檢測效果。
【專利說明】
一種生物識別分子固定到生物芯片的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物芯片修飾領(lǐng)域，具體涉及一種生物識別分子固定到生物芯片的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]將生物識別分子高效固定到生物芯片上是發(fā)展高靈敏度、高特異性生物分析技術(shù)的關(guān)鍵之所在。近年來，基于生物芯片、生物傳感器等的生物分析技術(shù)由于具有靈敏度高、特異性強、檢測通量大等特點，在藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。絕大多數(shù)生物分析技術(shù)至關(guān)重要的一步就是要把特定的生物識別分子(如DNA、抗體或抗原、核酸適體、分子印跡分子等)固定到生物芯片上，以制備可以特異性識別待測目標物的敏感膜。將生物識別分子固定到生物芯片上的方法包括物理吸附法、包埋法、共價鍵法等。物理吸附法是將DNA、抗體/抗原等生物識別分子固定到生物芯片上最簡單的方法，缺點是固定的生物識別分子量少且易脫落以及生物識別分子不定向吸附導致活性損失等。包埋法是利用高分子有機聚合物將生物識別分子包埋，并固定到生物芯片的方法，該方法的缺點是非常明顯的，即高分子有機聚合物可阻礙生物分子的親和作用，同時非特異性吸附量大，因此在生物芯片的制備過程中應用得較少。共價鍵法是利用化學鍵合的方式將抗體/抗原、DNA、分子印跡分子、核酸適體等生物識別分子固定到生物芯片上，其特點是結(jié)合牢固、生物芯片可重復使用，但是生物識別分子活性會因化學鍵合而降低，同時生物識別分子不定向固定到生物芯片可使得其活性損失，從而降低生物分析技術(shù)性能。因此，如何獲得生物識別分子活性高、均勻性與一致性好、載量大、非特異性吸附弱、可重復利用的生物芯片一直是現(xiàn)代生物分析技術(shù)的難點和熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供一種生物識別分子固定到生物芯片的方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0005]—種生物識別分子固定到生物芯片的方法，包括以下步驟:
[0006]I)生物芯片的清洗:將生物芯片浸漬于羥基化試劑中，得到清潔的表面羥基化的生物芯片，之后進行干燥；
[0007]2)生物芯片的硅烷化:將步驟I)干燥后的羥基化的生物芯片浸漬于帶有琥珀酸酐基團的硅烷化試劑中，進行硅烷化反應，得到硅烷化的生物芯片；
[0008]3)將步驟2)得到的硅烷化的的生物芯片沖洗干凈后置于水中，進行羧基化反應，得到羧基化的生物芯片；
[0009]4)將步驟3)得到的羧基化生物芯片放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，進行活化羧基反應；
[0010]5)將步驟4)得到的活化羧基反應后的生物芯片放入生物識別分子的溶液中，進行縮合反應，得到表面固定有生物識別分子的生物芯片;所述生物識別分子具有氨基。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]步驟I)中利用利用羥基化試劑將生物芯片羥基化;步驟2)中，將羥基化的生物芯片浸漬于帶琥珀酸酐基團硅烷化試劑中進行反應;步驟3)中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；步驟4)中，利用NHS和EDC，活化羧基，有利于與生物識別分子的連接;步驟5)中，生物識別分子的氨基和活化后的羧基進行縮合反應生成酰胺鍵，實現(xiàn)了生物識別分子直接固定到生物芯片表面，本發(fā)明方法修飾的生物芯片由于生物識別分子能定向排列，形成分布均勻、載量大、活性高的單分子結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)致密。
[0013]本發(fā)明采用帶琥珀酸酐基團的硅烷化試劑，能夠方便、簡單連接帶氨基的生物識別分子，使生物識別分子能定向排列，形成均勻、致密的單分子結(jié)構(gòu)，提高生物識別分子的識別效率，同時避免了非特異性吸附，從而有效提高生物芯片的檢測效果。
[0014]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。
[0015]進一步，步驟I)中，所述羥基化試劑為濃硫酸和雙氧水按體積比2:1至3: I混合后得到的混合物;所述浸漬的溫度為15-35°C，時間為25-60min。
[0016]采用上述進一步方案的有益效果是:采用上述比例有利于生物芯片羥基化，如果濃度過高或過低，導致生物芯片的羥基含量低;如果溫度過低、時間較短將導致生物芯片羥基化不完全，如果如果溫度過高、時間較長將導致破壞芯片表面結(jié)構(gòu)。
[0017]進一步，步驟2)中，所述硅烷化試劑為二氫_3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(簡寫為TEPSA)的無水丙酮溶液，該溶液中，二氫-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮的體積分數(shù)為2 % -1 O %。
[0018]采用上述進一步方案的有益效果是:本發(fā)明采用TEPSA作為硅烷化試劑，利用其水解生成羧基，生成的羧基能夠與生物識別分子的氨基縮合酰胺鍵，實現(xiàn)了生物識別分子直接固定到生物芯片表面。同時，可以避免因使用帶正電荷氨基的硅烷化試劑導致的非特異性吸附，有利于生物芯片在生物分子檢測中的應用。
[0019]采用體積分數(shù)為2%_10%，有利于提高生物識別分子的固定效率，如果濃度過高，容易引起硅烷化試劑自偶聯(lián)問題;如果濃度過低，會降低生物識別分子的固定效率。
[0020]進一步，步驟2)中，所述硅烷化反應的反應溫度為10-40°C，反應時間為0.5_4h。
[0021]采用上述進一步方案的有益效果是:采用上述反應的溫度和時間，有利于硅烷化反應的順利進行；如果溫度過低、時間過短，容易導致硅烷化反應進行不徹底，影響后續(xù)的反應，導致生物識別分子的固定化的載量??；如果反應溫度過高、反應時間過長，容易導致硅烷化試劑自偶聯(lián)問題。
[0022]進一步，步驟2)中，所述硅烷化反應反應溫度為25°C，反應時間為為lh。
[0023]采用上述進一步方案的有益效果是:采取上述的時間和溫度有利于進一步提高硅烷化的效果。
[0024]進一步，步驟3)中，所述羧基化反應的反應溫度為10-40°C，反應時間為2_8h。
[0025]采用上述進一步方案的有益效果是:有利于保證羧基反應的順利進行；如果溫度過低，琥珀酸酐基團水解生成羧基基團的數(shù)量較小，影響生物識別分子與生物芯片的連接；如果溫度過高，容易導致生物識別分子固定效率低的。
[0026]進一步，步驟4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡寫為NHS)和N-羥基琥珀酰亞胺(簡寫為EDC)的混合溶液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為I: I。
[0027]采用上述進一步方案的有益效果是:上述的配比有利于提高生物識別分子的固定效果。
[0028]進一步，步驟4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，所述N-羥基琥珀酰亞胺的體積分數(shù)為3%。
[0029]采用上述進一步方案的有益效果是:可以進一步提高羧基的活化效果。
[0030]進一步，步驟4)中，活化羧基反應的反應溫度為10_40°C，反應時間為0.5_4h。
[0031]采用上述進一步方案的有益效果是:可以進一步提高羧基的活化效果。
[0032]進一步，步驟5)中，所述生物識別分子為帶氨基的DNA片段、包被抗原、抗體或核酸適體;DNA片段的濃度為0.5-3yg/mL、包被抗原的濃度為l-5yg/mL、抗體的濃度為0.5-5yg/mL、核酸適體的濃度為0.5-3yg/mL ；所述縮合反應的反應溫度為10-40 °C，反應時間為8-15h0
[0033]采用上述進一步方案的有益效果是:合適的縮合反應溫度和時間有利于提高生物識別分子固定量;合適的生物識別分子的濃度有利于形成單分子層結(jié)構(gòu);如果濃度過低，導致固定后的生物芯片的載量較小;如果濃度過高，導致試劑浪費。
[0034]進一步，步驟5)中，所述縮合反應的反應溫度為20_30°C，反應時間為10_15h。
[0035]采用上述進一步方案的有益效果是:
[0036]發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，采用反應溫度為20-30 °C，反應時間為10-15h，可以進一步提尚縮合反應的效率。
[0037]進一步，步驟I)中，得到清潔的表面羥基化的生物芯片之后且在干燥之前，還包括以下步驟:將得到清潔的表面羥基化的生物芯片于超純水中超聲洗滌，直至超聲洗滌后所得溶液的pH為中性，然后用氮氣吹干。
[0038]采用上述進一步方案的有益效果是提高芯片的清潔效果。
[0039]進一步，步驟I)中，所述干燥的方法為:在105°C的干燥箱干燥2_4h。
[0040]采用上述進一步方案的有益效果是有利于生物芯片的硅烷化。
[0041]進一步，步驟2)中，得到硅烷化后的生物芯片后還包括以下步驟:將硅烷化后的生物芯片用無水丙酮溶液進行清洗，并用氮氣吹干，于150-250°C下烘烤10-60min。
[0042]采用上述進一步方案的有益效果是:充分去除反應副產(chǎn)物，避免副產(chǎn)物對后續(xù)反應的影響。
[0043]進一步，步驟3)中，硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入超純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團。
[0044]采用上述進一步方案的有益效果是:充分去除反應副產(chǎn)物，避免副產(chǎn)物對后續(xù)反應的影響。
[0045]進一步，所述生物芯片的材質(zhì)為石英玻璃。
【附圖說明】
[0046]圖1為實施例1、實施例2和實施例3中生物芯片固定生物識別分子過程示意圖。
[0047]圖2為實施例4中生物芯片固定包被抗原的特異性反應和非特異性吸附的信號響應曲線。
[0048]圖3為實施例5中生物芯片固定抗體的特異性反應和非特異性吸附的響應信號。
[0049]圖4為實施例6中生物芯片固定DNA的互補DNA片段和非互補DNA片段雜交的響應曲線。
【具體實施方式】
[0050]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0051 ]下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0052]實施例1將包被抗原直接固定在生物芯片表面:
[0053]本實例以微囊藻毒素-LR包被抗原(MC-LR-OVA)為例，微囊藻毒素-LR包被抗原購自Sigma-al(中國)，按圖1所示的生物芯片表面固定過程示意圖進行如下實驗:
[0054]I)首先用Piranha溶液(濃H2SO4和H2O2的體積比為3:1)于25°C下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸為IcmX Icm)表面30min，用于去除其表面的有機物，并使其表面羥基化;然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進行充分清洗，直到清洗液的PH值為中性，最后在室溫下用氮氣吹干，放入105 °C干燥箱干燥2h，之后保存于真空干燥箱中備用；
[0055]2)將潔凈的表面羥基化的生物芯片放入體積分數(shù)為2%的二氫_3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5_二酮(TEPSA)的無水丙酮溶液中，于25°C下反應lh，再用無水丙酮溶液進行多次沖洗，沖洗時間為lOmin，充分去除反應副產(chǎn)物，氮氣吹干，200°C下烘烤Ih;通過硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的生物芯片表面；
[0056]3)硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團，具體步驟如下:硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入超純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團;所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為4h;
[0057 ] 4)利用EDC和NHS將固定硅烷化試劑的生物芯片表面的羧基活化，具體方法如下:在ImL濃度為I Omg/mL的NHS的水溶液中加入I OmgEDC，混合均勻后，將羧基化的生物芯片入其中，所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為2h;然后用超純水清洗干凈備用；
[0058]5)將活化后的生物芯片放入微囊藻毒素-LR的包被抗原(MC-LR-OVA)溶液中，從而使得活化后的羧基與包被抗原的氨基偶聯(lián)，從而使得包被抗原直接固定于生物芯片表面，用于微囊藻毒素-LR的分析。所述的包被抗原濃度為lyg/mL，所述縮合反應的反應溫度為250C，反應時間為12h。最后用超純水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，得到表面固定有MC-LR-OVA的生物芯片，置于4°C冰箱存放。
[0059]實施例2將抗體直接固定在生物芯片表面:
[0060]本實例以雙酸A抗體為例，雙酚A抗體購自北京金達清創(chuàng)環(huán)境科技有限公司，按圖1所示的生物芯片表面固定過程示意圖進行如下實驗:
[0061 ] I)首先用Piranha溶液(濃H2SO4和H2O2的體積比為3:1)于25°C下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸為IcmX Icm)表面30min，用于去除其表面的有機物，并使其表面羥基化;然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進行充分清洗，直到清洗液的pH值為中性，最后在室溫下用氮氣吹干，放入105 °C的干燥箱干燥4h，保存于真空干燥箱中備用;
[0062]2)將潔凈的表面羥基化的生物芯片放入體積分數(shù)為2 %的二氫-3-[ 3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(TEPSA)的無水丙酮溶液中，于25 °C下反應Ih，再用丙酮溶液進行多次沖洗，充分去除反應副產(chǎn)物，氮氣吹干，200°C下烘烤Ih;通過硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的生物芯片表面；
[0063]3)硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團，具體步驟如下:硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為4h;
[0064]4)利用EDC和NHS將固定硅烷化試劑的生物芯片表面的羧基活化，具體方法如下:在ImL濃度為I Omg/mL的NHS水溶液中加入I Omg EDC，混合均勻后，將羧基化的圓形波導放入其中，所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為2h;然后用超純水清洗干凈備用；
[0065]5)將活化后的生物芯片放入雙酚A抗體溶液中，從而使得活化后的羧基與包被抗原的氨基偶聯(lián)，從而使得雙酚A抗體直接固定于生物芯片表面，用于雙酚A的分析。所述的雙酸A濃度為lyg/mL，所述縮合反應的反應溫度為250C，反應時間為12h。最后用超純水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，得到表面固定有雙酸A的生物芯片，置于4°C冰箱存放。
[0066]實施例3將DNA片段直接固定在生物芯片表面:
[0067]所述DNA片段為:5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按圖1所示的生物芯片表面固定過程示意圖進行如下實驗:
[0068]I)首先用Piranha溶液(濃H2SO4和H2O2的體積比為3:1)于25°C下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸為IcmX Icm)表面30min，用于去除其表面的有機物，并使其表面羥基化;然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進行充分清洗，直到清洗液的PH值為中性，最后在室溫下用氮氣吹干，放入105 °C的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中備用;
[0069]2)將潔凈的表面羥基化的生物芯片放入體積分數(shù)為2 %的二氫-3-[ 3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(TEPSA)的無水丙酮溶液中，于25 °C下反應Ih，再用丙酮溶液進行多次沖洗，充分去除反應副產(chǎn)物，氮氣吹干，200°C下烘烤Ih;通過硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的生物芯片表面；
[0070]3)硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團，具體步驟如下:硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為4h;
[0071]4)利用EDC和NHS將固定硅烷化試劑的生物芯片表面的羧基活化，具體方法如下:在ImL濃度為I Omg/mL的NHS水溶液中加入I Omg EDC，混合均勻后，將羧基化的圓形波導放入其中，所述反應的反應溫度為25°C，反應時間為2h;然后用超純水清洗干凈備用；
[0072]5)將活化后的生物芯片放入DNA溶液中，從而使得活化后的羧基與DNA的氨基偶聯(lián)，從而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的雜交分析。所述的DNA濃度為lyg/mL，所述縮合反應的反應溫度為25°C，反應時間為12h。最后用超純水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4°C冰箱存放。
[0073]實施例4
[0074]所述DNA片段為:5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按圖1所示的生物芯片表面固定過程示意圖進行如下實驗:
[0075]I)首先用Piranha溶液(濃H2SO4和H2O2的體積比為2:1)于15 °C下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸為IcmX Icm)表面60min，用于去除其表面的有機物，并使其表面羥基化;然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進行充分清洗，直到清洗液的PH值為中性，最后在室溫下用氮氣吹干，放入105 °C的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中備用;
[0076]2)將潔凈的表面羥基化的生物芯片放入體積分數(shù)為1 %的二氫-3- [ 3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(TEPSA)的無水丙酮溶液中，于1 °C下反應4h，再用丙酮溶液進行多次沖洗，充分去除反應副產(chǎn)物，氮氣吹干，150°C下烘烤55min;通過硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的生物芯片表面；
[0077]3)硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團，具體步驟如下:硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；所述反應的反應溫度為10°C，反應時間為8h;
[0078]4)利用EDC和NHS將固定硅烷化試劑的生物芯片表面的羧基活化，具體方法如下:在ImL濃度為I Omg/mL的NHS水溶液中加入I Omg EDC，混合均勻后，將羧基化的圓形波導放入其中，所述反應的反應溫度為10°C，反應時間為4h;然后用超純水清洗干凈備用；
[0079]5)將活化后的生物芯片放入DNA溶液中，從而使得活化后的羧基與DNA的氨基偶聯(lián)，從而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的雜交分析。所述的DNA濃度為0.5yg/mL，所述縮合反應的反應溫度為10°C，反應時間為15h。最后用超純水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4°C冰箱存放。
[0080]實施例5
[0081 ] 所述DNA片段為:5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按圖1所示的生物芯片表面固定過程示意圖進行如下實驗:
[0082]I)首先用Piranha溶液(濃H2SO4和H2O2的體積比為2.5:1)于35°C下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸為IcmX Icm)表面25min，用于去除其表面的有機物，并使其表面羥基化;然后再將其放入超聲波清洗儀中洗滌，并用超純水進行充分清洗，直到清洗液的PH值為中性，最后在室溫下用氮氣吹干，放入105 °C的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中備用；
[0083]2)將潔凈的表面羥基化的生物芯片放入體積分數(shù)為8%的二氫_3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(TEPSA)的無水丙酮溶液中，于40 °C下反應0.5h，再用丙酮溶液進行多次沖洗，充分去除反應副產(chǎn)物，氮氣吹干，250°C下烘烤1min;通過硅烷化作用，將硅烷基引入到表面羥基化的生物芯片表面；
[0084]3)硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團，具體步驟如下:硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；所述反應的反應溫度為40°C，反應時間為2h;
[0085 ] 4)利用EDC和NHS將固定硅烷化試劑的生物芯片表面的羧基活化，具體方法如下:在ImL濃度為I Omg/mL的NHS水溶液中加入I Omg EDC，混合均勻后，將羧基化的圓形波導放入其中，所述反應的反應溫度為40°C，反應時間為0.5h;然后用超純水清洗干凈備用；
[0086]5)將活化后的生物芯片放入DNA溶液中，從而使得活化后的羧基與DNA的氨基偶聯(lián)，從而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的雜交分析。所述的DNA濃度為3yg/mL，所述縮合反應的反應溫度為40°C，反應時間為8h。最后用超純水沖洗數(shù)次，氮氣吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4°C冰箱存放。
[0087]實驗效果例I生物芯片修飾微囊遭毒素-LR包被抗原的有效性驗證
[0088]為驗證本發(fā)明方法是否可行，且是否具有特異性，將0.4yg/mL熒光標記的微囊藻毒素抗體(購自自北京金達清創(chuàng)科技有限公司)通入樣品池中，熒光標記的微囊藻毒素與實施例I中制備的生物芯片表面的包被抗原反應，用熒光檢測儀記錄其隨時間的響應信號值，
[0089]為了做對比，做了如下三組對比試驗，檢測結(jié)果如圖3所示，具體過程如下:
[0090]首先，將0.4yg/mL熒光標記的微囊藻毒素抗體栗入樣品池，可以檢測到明顯的熒光信號，凈焚光信號接近4500。
[0091 ]而當0.2mL的0.4yg/mL熒光標記的微囊藻毒素抗體與0.2mL的100yg/mL微囊藻毒素-LR混合反應5min后，再加入樣品池，系統(tǒng)可以檢測到明顯的熒光信號，但最大熒光值明顯小于未加微囊藻毒素-LR的熒光信號值，說明部分熒光標記抗體已與微囊藻毒素-LR結(jié)合，從而減少了含有自由位的熒光標記微囊藻毒素-LR抗體濃度，因此系統(tǒng)檢測到的熒光信號小。
[0092]最后，將lyg/mL熒光標記抗阿特拉津抗體(來自北京金達清創(chuàng)科技有限公司)栗入樣品池，系統(tǒng)檢測到的熒光信號非常小，表明熒光標記阿特拉津抗體不會非特異性吸附到生物芯片表面，同時，游離的熒光染料對系統(tǒng)檢測的熒光信號的貢獻也非常少。
[0093]綜上可知:本發(fā)明制備得到的生物芯片會與微囊藻毒素-LR抗體產(chǎn)生特異性反應，生物芯片不僅可以高效檢測到抗體抗原之間特異性親和反應，具有活性高、載量大的特點；而且非特異吸附弱，進而對其他熒光標記的物質(zhì)的響應信號極低。
[0094]發(fā)明人又進一步調(diào)整了實施例1中的包被抗原的濃度，包被抗原的濃度分別為3μg/mL，步驟5)的縮合反應的溫度為20°C，其余均與實施例1相同，經(jīng)過試驗驗證，結(jié)果與實施例I的結(jié)果類似。
[0095]發(fā)明人又進一步調(diào)整了實施例1中的包被抗原的濃度，包被抗原的濃度為5yg/mL，步驟5)的縮合反應溫度為30°C，其余均與實施例1相同，經(jīng)過試驗驗證，結(jié)果與實施例1的結(jié)果類似。
[0096]實驗效果例2生物芯片修飾雙酸A抗體的有效性驗證
[0097]為驗證本發(fā)明方法是否可行，且是否具有特異性，將0.lyg/mL熒光標記的雙酚A通入樣品池中，熒光標記的雙酚A與實施例1中制備的生物芯片表面的雙酚A抗體反應，用熒光檢測儀記錄其隨時間的響應信號值，
[0098]同樣，為了做對比，做了如下三組對比試驗，檢測結(jié)果如圖4所示，具體過程如下:
[0099]首先，將0.lyg/mL熒光標記的雙酚A栗入樣品池，可以檢測到明顯的熒光信號，凈熒光信號接近4350。
[0100]而當0.2mL的0.lyg/mL焚光標記的雙酸A與0.2mL的100yg/mL雙酸A混合反應5min后，再加入樣品池，系統(tǒng)可以檢測到熒光信號很小，說明未標記的雙酚A抑制了熒光標記抗體與雙酸A抗體結(jié)合，因此系統(tǒng)檢測到的熒光信號小。
[0101]最后，將Uig/mL熒光阿特拉津栗入樣品池，系統(tǒng)檢測到的熒光信號非常小，表明熒光標記阿特拉津不會非特異性吸附到生物芯片表面，同時，游離的熒光染料對系統(tǒng)檢測的熒光信號的貢獻也非常少。
[0102]發(fā)明人又進一步調(diào)整了實施例2的抗體的濃度，抗體的濃度分別為0.5yg/mL和5μg/mL，其余操作與實施例2的操作相同，經(jīng)過試驗驗證，與實施例2的結(jié)果一致。
[0103]綜上可知:本發(fā)明制備得到的生物芯片會與雙酚A產(chǎn)生特異性反應，生物芯片不僅可以高效檢測到抗體抗原之間特異性親和反應，具有活性高、載量大的特點；而且非特異吸附弱，進而對其他熒光標記的物質(zhì)的響應信號極低。
[0104]實驗效果例3生物芯片修飾DNA片段的有效性驗證
[0105]為驗證本發(fā)明方法是否可行，且是否具有特異性，將0.lyg/mL熒光標記的互補DNA片段(序列為:5’-AAAAAAAAA-dyelight680-3’)通入樣品池中，熒光標記的互補DNA片段與實施例3中制備的生物芯片表面的生物識別DNA分子雜交，用熒光檢測儀記錄其隨時間的響應信號值。
[0106]同樣，為了做對比，做了如下兩組對比試驗，檢測結(jié)果如圖4所示，具體過程如下:
[0107]將0.lyg/mL熒光標記的互補DNA片段(序列為5 ’ -AAAAAAAAA-dyelight680_3 ’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)栗入樣品池，可以檢測到明顯的熒光信號，凈熒光信號接近3680。
[0108]而當0.1yg/mL熒光標記的非互補DNA片段(序列為5’-CCCGCATAC-dyelight680-3’， 由生工生物工程 (上海 ) 股份有限公司合成) 加入樣品池， 系統(tǒng)可以檢測到熒光信號很小，表明熒光標記非互補的DNA片段不會雜交到生物芯片上，也不會非特異性吸附到生物芯片表面，同時，游離的熒光染料對系統(tǒng)檢測的熒光信號的貢獻也非常少。
[0109]實施例4和實施例5得到的結(jié)果也與實施例3驗證的結(jié)果——致。
[0110]綜上可知:本發(fā)明制備得到的生物芯片會與互補DNA片段產(chǎn)生特異性反應，生物芯片不僅可以高效檢測到DNA雜交反應，具有活性高、載量大的特點；而且非特異吸附弱，進而對其他焚光標記的非互補DNA片段的響應信號極低。
[0111]發(fā)明人還進行核酸適體與生物芯片固定的實驗，步驟5)中核酸適體的濃度分別為
0.5yg/mL、2yg/mL和3yg/mL，經(jīng)過試驗驗證，本發(fā)明具有很好的特異性、活性高和載量大等優(yōu)點。
[0112]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)生物芯片的羥基化:將生物芯片浸漬于羥基化試劑中，得到清潔的表面羥基化的生物芯片，之后進行干燥； 2)生物芯片的硅烷化:將步驟I)干燥后的羥基化的生物芯片浸漬于帶有琥珀酸酐基團的硅烷化試劑中，進行硅烷化反應，得到硅烷化的生物芯片； 3)生物芯片的羧基化:將步驟2)得到的硅烷化的的生物芯片沖洗干凈后置于水中，進行羧基化反應，得到羧基化的生物芯片； 4)將步驟3)得到的羧基化生物芯片放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，進行活化羧基反應； 5)將步驟4)得到的活化羧基反應后的生物芯片放入生物識別分子的溶液中，進行縮合反應，得到表面固定有生物識別分子的生物芯片;所述生物識別分子具有氨基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟I)中，所述羥基化試劑為濃硫酸和雙氧水按體積比2:1至3:1混合后得到的混合物;所述浸漬的溫度為15_35°C，時間為25-60min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟2)中，所述硅烷化試劑為二氫-3_[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5_二酮的無水丙酮溶液，該溶液中，二氫_3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮的體積分數(shù)為2%-10%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟2)中，所述硅烷化反應反應溫度為10-40°C，反應時間為0.5-4h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟2)中，所述硅烷化反應反應溫度為25°C，反應時間為為lh。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟3)中，所述羧基化反應的反應溫度為10-40°C，反應時間為2-8h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，Ι-Ο-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為1:1。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中，所述N-羥基琥珀酰亞胺的體積分數(shù)為3%。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟4)中，活化羧基反應的反應溫度為10-40°C，反應時間為0.5-4h。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟5)中，所述生物識別分子為帶氨基的DNA片段、包被抗原、抗體或核酸適體;DNA片段的濃度為0.5-3yg/mL、包被抗原的濃度為l-5yg/mL、抗體的濃度為0.5-5yg/mL、核酸適體的濃度為0.5-3yg/mL;所述縮合反應的反應溫度為10-40 V，反應時間為8-15h。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟5)中，所述縮合反應的反應溫度為20-30°C，反應時間為10-15h。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物識別分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步驟I)中，得到清潔的表面羥基化的生物芯片之后且在干燥之前，還包括以下步驟:將得到清潔的表面羥基化的生物芯片于超純水中超聲洗滌，直至超聲洗滌后所得溶液的pH為中性，然后用氮氣吹干； 步驟I)中，所述干燥的方法為:在1050C的干燥箱干燥2-4h; 步驟2)中，得到硅烷化后的生物芯片后還包括以下步驟:將硅烷化后的生物芯片用無水丙酮溶液進行清洗，并用氮氣吹干，于150-250°C下烘烤10-60min; 步驟3)中，硅烷化后的生物芯片用無水甲苯或丙酮沖洗三遍，用水沖洗三遍，然后放入超純水中，硅烷化試劑的琥珀酸酐基團水解生成羧基基團；所述生物芯片的材質(zhì)為石英玻璃。
【文檔編號】G01N33/543GK105854962SQ201610183056
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】龍峰
【申請人】北京瑞聯(lián)安科技有限公司