生產(chǎn)血小板的射流裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從巨核細(xì)胞或其片段的懸液生產(chǎn)血小板的射流裝置，其包含生產(chǎn)室，所述生產(chǎn)室包含至少一個(gè)通道，其中引導(dǎo)巨核細(xì)胞懸液從其進(jìn)口流至其出口；其中所述通道在其內(nèi)表面的至少一部分構(gòu)造成具有多個(gè)障礙物。本發(fā)明還涉及用如上定義的射流裝置從巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的離體方法。
【專利說(shuō)明】
生產(chǎn)血小板的射流裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的改進(jìn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板是抑制出血關(guān)鍵的小的無(wú)核細(xì)胞。存在許多血小板生廣或功能雙損的臨床 疾病，且需要血小板輸液的患者越來(lái)越多。目前，解決辦法是進(jìn)行從供血者獲得的血小板的 輸液。用于治療學(xué)應(yīng)用的離體血小板生產(chǎn)是吸引人的選擇，但仍然是主要的技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0003] 血小板來(lái)源于巨核細(xì)胞。巨核細(xì)胞分化是其特征在于順序步驟的連續(xù)過(guò)程。盡管 巨核細(xì)胞分化發(fā)生于骨髓中，血小板生產(chǎn)要求巨核細(xì)胞片段通入骨髓血管。已經(jīng)嘗試設(shè)計(jì) 尤其致力于血小板生產(chǎn)的生物反應(yīng)器。
[0004] 國(guó)際專利申請(qǐng)W0 2010/06382311公開了從成熟巨核細(xì)胞通過(guò)使成熟巨核細(xì)胞懸 液在涂有血管性血友病因子(VWF)的固相上經(jīng)歷剪切率為至少600S-1的流動(dòng)而生產(chǎn)血小板 的離體方法。剪切率影響在Dunois-Lard自等的科學(xué)論文（"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production''，Blood, vol. 114,n°9,p. 1875-1883,2009)中進(jìn)一步討論。然而，產(chǎn)量仍需要改善，W用于可能的治 療學(xué)應(yīng)用。
[0005] -些出版物提議使用設(shè)計(jì)為再生天然骨髓環(huán)境的3D系統(tǒng)（參見(jiàn)Pallotta等， "Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional Platelet Production Using Silk-Based Vascular Tubes",Tissue Engineering:化rt C,vol.17,n。12,p.1223-1232,2011,和Sullenbarger等，"Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds" .Experimental Hematology ,vol. 37,n° 1 ,p. 101-110,2009)。在運(yùn)些系統(tǒng)中，細(xì) 胞片段從其中植入細(xì)胞的支架通過(guò)孔隙或管自由遷移進(jìn)入流動(dòng)通道。此外，Nakagawa等 ("Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes".Experimental Hematology, 2013vol.41，n°8p742-748,2013)最近公開了兩種新的模擬微血管的用于血小板生產(chǎn)的生 物反應(yīng)器。它們包含能夠捕獲巨核細(xì)胞的多孔結(jié)構(gòu)或狹縫。施加壓力流W確保巨核細(xì)胞的 固定。此外，將主流垂直施加于壓力流或在壓流和主流之間具有60°的角度。所述主流將剪 切應(yīng)力施加于捕獲的巨核細(xì)胞。然而，主流仍然不含巨核細(xì)胞。巨核細(xì)胞片段經(jīng)歷主流且釋 放的血小板在主流出口處收集。Thon等（《Platelet bioreactor-on-a-chip》，Blood, vol 124，n°12pl857-1867,2014)描述了基于彼此平行、通過(guò)用狹縫刺穿的壁分離的進(jìn)料通道和 主通道流的另一種生物反應(yīng)器。當(dāng)進(jìn)料通道末端關(guān)閉時(shí)，巨核細(xì)胞被推過(guò)狹縫。在那里，它 們與主流接觸并經(jīng)歷剪切應(yīng)力。在運(yùn)種系統(tǒng)中，巨核細(xì)胞可獲得的位點(diǎn)數(shù)是有限的，且許多 細(xì)胞停留在儲(chǔ)庫(kù)中，而最初的巨核細(xì)胞伸長(zhǎng)并釋放血小板。運(yùn)限制了血小板生產(chǎn)過(guò)程的速 度。運(yùn)些系統(tǒng)的幾何形狀對(duì)于快速大規(guī)模的生產(chǎn)效率不高。此外，獲得的產(chǎn)量仍不夠，運(yùn)是 使得血小板功能性表征變得困難的事實(shí)。此外，在幾小時(shí)或幾天內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)具有很少評(píng) 估的內(nèi)在血小板脫落。
[0006] 已經(jīng)公開了具有具體結(jié)構(gòu)的微射流裝置用于不同的生物學(xué)應(yīng)用。例如，Stott等 ("Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chi護(hù)，PNAS，vol. 107，n° 43，p. 18392-18397，2010)描述了使用其內(nèi)表面涂有 抗體的微射流裝置來(lái)分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞。內(nèi)表面中形成凹槽，W便破壞通道內(nèi)的層流流線， 并增加抗體涂層裝置中細(xì)胞-表面相互作用的數(shù)目。類似地，Chang等（"Biomimetic technique for 曰dhesion-b曰sed collection 曰nd sep曰r曰tion of cells in 曰 microfluidic channel" ,Lab 化ip,vol.5,p.64-73,2005)教導(dǎo)了使用包含微柱陣列的微 射流通道來(lái)分離和收集細(xì)胞。然而，與本發(fā)明相反，運(yùn)種微射流裝置的目的不是引發(fā)血小板 從巨核細(xì)胞脫落。
[0007] 因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于從包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液生產(chǎn)血 小板的射流裝置，尤其適用于高產(chǎn)量生產(chǎn)，同時(shí)保持新產(chǎn)生的血小板的功能質(zhì)量。本發(fā)明的 另一個(gè)目的是提供適于大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的血小板的用于生產(chǎn)血小板的方法。 [000引發(fā)明簡(jiǎn)述
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)及用于從巨核細(xì)胞懸液(5)生產(chǎn)血小板的射流裝置（1)，包 含：
[0010] -生產(chǎn)室(3)，包含至少一個(gè)通道(8)，其中可W引導(dǎo)包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞 懸液從其進(jìn)口（ 9)流至其出口（ 10);
[0011 ]-任選的流速控制器(7)，用于控審幡道(8)中所述懸液的流動(dòng)；
[0012] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器(2)，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化 所述巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室(3)的上游；
[0013] -生產(chǎn)室（3)下游的任選的血小板分煉器(4)，用于通過(guò)從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘 余物分煉血小板來(lái)純化流出懸液(6);
[0014] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的內(nèi)表面構(gòu)造成具有多個(gè)障礙物。
[0015] 在相關(guān)方面，本發(fā)明設(shè)及用于從包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液生產(chǎn)血小板的 射流裝置，包含：
[0016] -生產(chǎn)室（3)，包含通過(guò)非多孔壁定界的至少一個(gè)通道(8)和在通道的一端的至少 一個(gè)進(jìn)口孔(9)和在通道的另一端的至少一個(gè)出口孔（10)，其中可W將包含巨核細(xì)胞或其 片段的懸液引入進(jìn)口孔(9)，和其中可W在出口孔(10)收集血小板；
[0017]-任選的流速控制器(7)，用于控審幡道(8)中所述懸液的流動(dòng)；
[0018] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器(2)，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化 所述巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室(3)的上游；
[0019] -生產(chǎn)室（3)下游的任選的血小板分煉器(4)，用于通過(guò)從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘 余物分煉血小板來(lái)純化流出懸液(6);
[0020] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的內(nèi)表面構(gòu)造成具有多個(gè)障礙物。
[0021] 在具體的實(shí)施方式中，所述多個(gè)障礙物分布在二維空間表面，從而形成障礙物的 Ξ維陣列。
[0022] 另一方面，本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法，所述方法包 含：
[0023] -將包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液引入如上定義的射流裝置；
[0024] -在生產(chǎn)室的通道中使所述懸液在適于巨核細(xì)胞的延伸、破碎和血小板釋放的剪 切率下流動(dòng);和
[00巧]-收集通道出口處的血小板。
[00%] 發(fā)明詳述
[0027] 現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。在W下描述中，應(yīng)理解表達(dá)是指所確定的值的范 圍，包括下限和上限。
[0028] 本發(fā)明設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段的懸液生產(chǎn)血小板的射流裝置。
[0029] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"血小板"是指導(dǎo)致血塊形成的初期止血的細(xì)胞機(jī)理中設(shè)及的 無(wú)核細(xì)胞。
[0030] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"前血小板"是指巨核細(xì)胞或其片段的任何結(jié)構(gòu)形式，例如可 導(dǎo)致血小板形成的細(xì)胞質(zhì)連接的血小板樣顆粒。所述結(jié)構(gòu)形式包括但不限于具有長(zhǎng)的細(xì)胞 質(zhì)延伸、突出或偽足的細(xì)胞，所述延伸、突出或偽足包含涵蓋各形成階段的血小板體的膨 脹，例如節(jié)結(jié)、珠子等。
[0031] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"巨核細(xì)胞"是指負(fù)責(zé)生產(chǎn)正常止血所需的血小板的骨髓細(xì) 胞。巨核細(xì)胞來(lái)源于局限于巨核細(xì)胞譜系的造血祖細(xì)胞。巨核細(xì)胞生產(chǎn)的初始信號(hào)是促血 小板生成素或TPOdTPO是誘導(dǎo)骨髓中祖細(xì)胞分化成最終巨核細(xì)胞表型所必需的。巨核細(xì)胞 分化的其他分子信號(hào)包括例如GM-CSF、比-3、化-6、比-11、Flt-3配體和SCF。巨核細(xì)胞祖細(xì) 胞可W通過(guò)體外培養(yǎng)獲得。
[0032] 通常，巨核細(xì)胞懸液包含懸浮于適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中的巨核細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是補(bǔ)充有BIT血清替代物、α-單硫代甘油和脂質(zhì)體的Iscove's Modified Dulbecco's Medi皿(IMDM)。懸液可W進(jìn)一步包含巨核細(xì)胞片段或前血小板。
[0033] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，成熟巨核細(xì)胞懸液優(yōu)選通過(guò)W下步驟獲得：
[0034] (i)提供巨核細(xì)胞祖細(xì)胞；
[0035] (ii)培養(yǎng)擴(kuò)增所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞；
[0036] (i i i)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞。
[0037] 巨核細(xì)胞祖細(xì)胞例如選自造血干細(xì)胞(例如，來(lái)自廝帶、外周血或骨髓）、或選自胚 胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的干細(xì)胞。
[0038] 在一些實(shí)施方式中，盡管懸液中的大多數(shù)細(xì)胞可能是巨核細(xì)胞，可W在運(yùn)種懸液 中發(fā)現(xiàn)少量其他細(xì)胞或細(xì)胞殘余物，包括但不限于，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)片段和前血小 板。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于根據(jù)本發(fā)明的裝置或方法的包含巨核細(xì)胞的細(xì)胞懸液進(jìn) 一步包含巨核細(xì)胞片段，尤其是前血小板或血小板。例如，大多數(shù)包含巨核細(xì)胞的細(xì)胞可W 在它們的膜上表達(dá)CD41和CD42b抗原。
[0039] 從祖細(xì)胞或干細(xì)胞生產(chǎn)巨核細(xì)胞的細(xì)節(jié)可見(jiàn)于例如"Balduini A，Pallotta I， Malara A,Lova P,Pecci A,Viarengo G,Balduini CL,Torti M.Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.J Thromb Haemost.2008:6:1900-7."或叮akayama N,Nishimura S,Nakamura S, Shimizu T,Ohnishi R,Endo H,Yamaguchi T,0tsu M,Nishimura K, Nakanishi M,Sawaguchi A,Nagai R,Takahashi K,Yamanaka S,Nakauchi H,Eto Κ.Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells .The Journal of Experimental Medicine · 2010; 207:2817-30，' D
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方式中，引入所述裝置流動(dòng)的巨核細(xì)胞懸液W103-108個(gè)/mL，優(yōu)選lO 5- 5.106個(gè)/mL的細(xì)胞濃度存在。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的射流裝置包含至少一個(gè)生產(chǎn)室，所述生產(chǎn)室包含至少一個(gè)具有至少 兩個(gè)孔的通道，所述孔可進(jìn)一步描述為通道的進(jìn)口和出口。通道使得巨核細(xì)胞或其片段的 懸液可W從其進(jìn)口流到其出口。優(yōu)選地，通道具有一個(gè)進(jìn)口和一個(gè)出口且可將主流施加于 巨核細(xì)胞懸液W從所述進(jìn)口流到所述出口。
[0042] 在具體的實(shí)施方式中，可W進(jìn)一步將生產(chǎn)室分成若干個(gè)平行通道，它們中的每一 個(gè)通過(guò)非多孔壁定界，其中可W在室的一端的至少一個(gè)進(jìn)口孔(9)引入包含巨核細(xì)胞的細(xì) 胞懸液，和可W在室的另一端的至少一個(gè)出口孔（10)收集血小板，所述通道形成從其進(jìn)口 到其出口的單一流。
[0043] 如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)"非多孔"是指巨核細(xì)胞或其片段(包括血小板或前血小板） 不能跨越壁，因此留在通道進(jìn)口到出口的主流中。
[0044] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了 W高產(chǎn)率生產(chǎn)血小板，射流裝置的通道必須在其至少一部分的 內(nèi)表面，即在至少一部分旨在與巨核細(xì)胞懸液接觸的通道壁的表面上構(gòu)造紋理。所述紋理 通過(guò)多個(gè)障礙物產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述障礙物分布于通道的至少一個(gè)2維表面上，從而形成障 礙物的3維陣列。由于所述障礙物，通道內(nèi)表面不光滑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流過(guò)具有紋理的通道 時(shí)，巨核細(xì)胞在具有紋理的表面上的捕獲和其脫落成血小板得到改進(jìn)。通常，所述通道的至 少一部分內(nèi)表面構(gòu)造成具有至少一個(gè)障礙物的Ξ維陣列，其中所述障礙物分布在通道的至 少一個(gè)表面上W改變相鄰流線之間的距離，從而允許在障礙物表面上和/或通道的內(nèi)表面 上捕獲流動(dòng)的巨核細(xì)胞并將它們暴露于剪切，W誘導(dǎo)血小板脫落。將巨核細(xì)胞暴露于通過(guò) 具有紋理的通道的流而產(chǎn)生的血小板表現(xiàn)出類似于循環(huán)血小板的一些功能性的方面。在微 射流裝置中產(chǎn)生的血小板可能不同于血小板樣顆粒。運(yùn)些血小板樣顆?？蒞不通過(guò)微射流 忍片形成且不完全是功能性的。尤其是，在具體的實(shí)施方式中，在本發(fā)明裝置中產(chǎn)生的血小 板可W被激活，如天然血小板或循環(huán)血小板，運(yùn)與不能激活的血小板樣顆粒相反。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，通道內(nèi)表面具有紋理的部分可進(jìn)一步涂有對(duì)巨核細(xì) 胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血友病因子(VWF)或其功能性變體。運(yùn)種配體可對(duì)血 小板和/或巨核細(xì)胞或其特異性受體具有特異性親合力，或?qū)ρ“搴?或巨核細(xì)胞具有非 特異性親合力。運(yùn)種涂層增加細(xì)胞對(duì)通道內(nèi)壁或障礙物的粘附。
[0046] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"血管性血友病因子"或"VWF"是指設(shè)及止血的由若干單體組 成的多聚體蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可在GenPept數(shù)據(jù)庫(kù)W登錄號(hào) AAB59458找到。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的血管性血友病因子是哺乳動(dòng)物血管性血友病因子，更 優(yōu)選是鼠因子或靈長(zhǎng)類動(dòng)物因子，甚至更優(yōu)選人血管性血友病因子。術(shù)語(yǔ)"VWF"涵蓋任何哺 乳動(dòng)物來(lái)源的VWF，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物VWF，優(yōu)選人VWF。根據(jù)本發(fā)明，VWF因子可W是重組VWF或 天然VWF。在其天然形式，其可W被純化或可W包含于包含其他組分的組合物中（例如在胞 外基質(zhì)中）。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可W根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地生產(chǎn)運(yùn)種重組VWF，例如利 用能生產(chǎn)所述重組VWF或其功能性變體的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0047]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)VWF的"功能性變體"是指VWF因子的天然或重組片段，或保留 結(jié)合GP扣，尤其是人GPIb的能力的VWF的同源物或類似物。
[004引 VWF的同源物是具有與人VWF氨基酸序列共有至少50 %同一性，優(yōu)選至少60 %、 70%、80%、90%和95%同一性的氨基酸序列的多膚。
[0049] 如本文所使用，兩個(gè)序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù) (即，％同一性=相同位置#/位置總100)，考慮需要被引入W最佳比對(duì)兩個(gè)序列的空位 數(shù)和各空位長(zhǎng)度。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分比同一性的測(cè)度可W利用如下所述的數(shù) 學(xué)算法完成。
[0050] 兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性可W利用已并入ALIGN程序的E.Myers和 W.Miller的算法(Comput.Appl .Biosci .4:1 1-17,1988)來(lái)測(cè)定。此外，兩個(gè)氨基酸序列之 間的百分比同一性可W利用已并入GCG軟件包中的GAP程序的Need 1 eman和WunSch (J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法來(lái)測(cè)定。測(cè)定百分比同一性的又一個(gè)程序是化USTAL (Μ.Larkin等，Bioinformatics 23:2947-2948,2007;first described by D.Higgins and P.Sha巧，Gene 73 :237-244,1988)，其可作為單獨(dú)程序或經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器獲得（參見(jiàn)< http://www.clustal.org/>)〇
[0051] 變體進(jìn)一步包括包含與異源多膚序列融合的VWF因子的片段的多膚或融合蛋白， 所述異源多膚序列不是天然連接至所述VWF。其他變體包括VWF結(jié)構(gòu)域的多聚體形式，其中 所述VWF結(jié)構(gòu)域是對(duì)GPIb具有親合力的那些VWF片段。
[0052] 如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)"片段"包括給定多膚的至少5個(gè)、優(yōu)選至少10個(gè)或至少20個(gè) 連續(xù)氨基酸的天然或重組的部分氨基酸序列。
[0053] 可用于涂覆本發(fā)明裝置的VWF變體的實(shí)例包括但不限于，重組VWF-AU氨基酸 Q1238-P1471)多膚，其可在大腸桿菌中表達(dá)，或重組VWF-A1A2A3(氨基酸D1261-G1874)多 膚，其可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并如Mart in, C.，Morales，L.D.和Cruz, M.A. (2007)， Journal of Thrombosis and Haemostasis,5:1363-1370.doi:10.1111/j.1538- 7836.2007.02536. X之前所描述的純化。
[0054] 或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W選擇VWF類似物，即不與VWF-級(jí)氨基酸序列共有序列 同源性，但表現(xiàn)出與巨核細(xì)胞和/或血小板結(jié)合親合力類似性質(zhì)的蛋白或多膚。運(yùn)種類似物 可選自但不限于纖維蛋白原、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白和肌腫蛋白。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的射流裝置的通道可W通過(guò)其進(jìn)口和其出口之間的長(zhǎng)度L來(lái)限定。通 道橫截面(優(yōu)選在通道的整個(gè)長(zhǎng)度上相同）可W是圓形、卵形、長(zhǎng)方形或正方形。如本文所使 用，通道高度Η是指通道截面中兩個(gè)相對(duì)的壁之間測(cè)量的最小距離。例如，在圓形截面中，通 道高度Η是通道圓形截面的直徑。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述通道可具有基本上正方形 或長(zhǎng)方形截面，其中底壁和頂壁決定通道高度Η，和側(cè)壁決定通道寬度W。通道優(yōu)選是直的且 直通道的軸限定通道的縱向。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，射流裝置是微射流裝置，即裝置的橫截面尺寸之一 小于1毫米。通道可W稱為微通道。
[0057] 關(guān)于通道尺寸，運(yùn)些可W根據(jù)可用于血小板生產(chǎn)的巨核細(xì)胞的平均尺寸來(lái)優(yōu)化。 貫穿說(shuō)明書稱為化HS的運(yùn)種參數(shù)定義為用于本發(fā)明方法的懸液中巨核細(xì)胞的平均直徑，且 可W通過(guò)不同技術(shù)測(cè)量，如阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(例如美國(guó)專利2,656,508描述的庫(kù)爾特計(jì)數(shù) 器)或光學(xué)顯微術(shù)和隨后的圖像分析。
[005引取決于所使用的前體細(xì)胞來(lái)源和巨核細(xì)胞生產(chǎn)方法，化瞞通常為扣m-150皿，例如7 μπι-100μπι，和例如10-50μπι。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明裝置的化雕優(yōu)化的尺寸選自W下尺 寸：15μηι、20μηι、25μηι、30μηι、35μηι、40μηι 和 45μηι。
[0059] 在具體的實(shí)施方式中，通道的高度Η可W為路賄-1mm，優(yōu)選Da?-100ym。通道寬度W可 W為化碰-Im，優(yōu)選10址§碰-1cm。通道長(zhǎng)度L可W為1mm-lOm，優(yōu)選lOmm-lm，更優(yōu)選lOcm-lm。
[0060] 本發(fā)明射流通道的生產(chǎn)室可W包含不同或相同的單個(gè)通道或多個(gè)通道。當(dāng)使用多 個(gè)通道時(shí)，平行化通道共有相同的流進(jìn)口（16)和流出口（17)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方式，生產(chǎn)室可W包含多個(gè)平行化通道。生產(chǎn)室中通道數(shù)N可W為2-1，000,000,優(yōu)選2- 100,000。
[0061 ]當(dāng)使用平行化通道時(shí)，生產(chǎn)室優(yōu)選進(jìn)一步包含分配通道，其將進(jìn)口懸液分配到每 個(gè)通道。分配通道可為Ξ角形。有利地，分配通道的形狀使得它避免用過(guò)高剪切率破壞細(xì) 胞，例如通過(guò)使其高度高于平行化通道中所使用的高度。
[0062] 通道的內(nèi)表面在至少一部分具有紋理。所述通道的紋理部分的長(zhǎng)度可W為通道長(zhǎng) 度L的1 % -通道長(zhǎng)度L的100 %，優(yōu)選為通道長(zhǎng)度L的50 % -通道長(zhǎng)度L的100 %。
[0063] 紋理通過(guò)多個(gè)障礙物產(chǎn)生?？蒞確定所述障礙物的密度、尺寸和形狀W便在障礙 物和/或通道內(nèi)壁的表面上捕獲巨核細(xì)胞，從而進(jìn)一步血小板脫落。
[0064] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"捕獲"是指巨核細(xì)胞接觸障礙物和/或內(nèi)通道的表面并且較 之流動(dòng)的平均速度大幅減速。接觸障礙物表面后，巨核細(xì)胞可能停止。
[0065] 障礙物例如可W具有桿形、柱形、束形、月牙形、刺穿的月牙形、星形、空腔形或金 字塔形。優(yōu)選地，障礙物是桿或束。桿形可優(yōu)選具有正方形或圓形或Ξ角形橫截面，且其可 W通過(guò)半徑r和高度h定義。如本文所使用，桿的"半徑"定義為桿橫截面的最大尺寸的一半。 束可W優(yōu)選具有長(zhǎng)方形或正方形橫截面，且其可W通過(guò)長(zhǎng)度1束=W、寬度W束二化和高度h定 義。
[0066] 關(guān)于桿的尺寸:桿的高度h可W優(yōu)選為0-H，更優(yōu)選為化雕/2至化-D細(xì)6/2)。桿的半徑 r可W優(yōu)選為化醜/100至100址細(xì)6,更優(yōu)選為化醜/10至10址細(xì)6?；裢ǔ?-150μπι，桿的高度h 可W優(yōu)選為0-lmm。桿的半徑Γ可W優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選為500nm-l. 5mm。
[0067] 關(guān)于束的尺寸:束的高度h可W優(yōu)選為0-H，更優(yōu)選為化雕/2至化-D細(xì)fi/2)。束的寬度 化可W優(yōu)選為化醜/10至100址細(xì)6,更優(yōu)選為化雕至10址細(xì)6?；裢ǔ?-150皿，束的高度h可 W優(yōu)選為0-lmm。
[006引束的寬度化可W優(yōu)選為500nm-l 5mm，更優(yōu)選為如m-1.5mm。
[0069] 障礙物可W隨機(jī)放置于通道內(nèi)表面或根據(jù)具體的圖案放置。因此，紋理可W是不 規(guī)則或規(guī)則的。規(guī)則圖案可W通過(guò)一些特征來(lái)表征，如其周期性結(jié)構(gòu)、晶格間距和相對(duì)于通 道縱向的晶格方向的傾斜。如果圖案是不規(guī)則的，其可通過(guò)障礙物的密度或通過(guò)障礙物之 間的平均距離來(lái)表征。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，障礙物可W布置在至少一部分通道的內(nèi)表面W形成 規(guī)則圖案。
[0071] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，障礙物密度可W沿著通道改變。
[0072] 根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，障礙物是具有半徑為r的基本上圓形截面桿，且所述桿 布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上w形成具有六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案，例 如：
[0073] (i)兩個(gè)桿中屯、之間的最近距離P為至少等于2r，優(yōu)選（2r+D細(xì)胞/10)至（2" 100曲纖），更優(yōu)選（2r+D§碰)至（化+10曲纖）；
[0074] (ii)角度α，其是通過(guò)通道縱向和六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的原始細(xì)胞的晶格矢量之 一來(lái)定義的最低角度例如是：
[0077] (iii)任選所述桿的高度h為如0<h《H，優(yōu)選化醜/2<h《化-化醜/2)，其中Η是通道高 度。
[0078] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，障礙物是具有半徑為r的基本上圓形截面的桿（12)，且 所述桿布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上W形成具有六邊形的周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖 案，例如：
[0079] (i)桿的半徑r優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選500nm-l .5mm;
[0080] (ii)兩個(gè)桿中屯、之間的最近距離p為至少等于lOOnm，優(yōu)選100nm-50mm，更優(yōu)選 500nm-10mm，甚至更優(yōu)選如m-lmm;
[0081] (iii)角度α，其是通過(guò)通道(14)縱向和六邊形布拉維晶格的晶格矢量之一定義的 最低角度例如α為0-90°，優(yōu)選0-30%
[0082] (iv)任選所述桿的高度h為如0<h《H，其中Η是指通道截面中兩個(gè)相對(duì)的壁之間測(cè) 量的最小距離。
[0083] 射流裝置可優(yōu)選根據(jù)微射流系統(tǒng)的已知制造技術(shù)來(lái)制造，例如通過(guò)軟光刻技術(shù) (Xia等.1998."Soft lithography".Annual Review of Materials Science.vol.28,n°1, p.153-184)。
[0084] 具有至少部分帶紋理的通道的正突起(positive relief)的裝置的主體(master) 可通過(guò)常規(guī)方法制備：一種方法可W從包含通道設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)輔助的設(shè)計(jì)文件產(chǎn)生透明 片。然后，運(yùn)些透明片可用作掩模將圖案轉(zhuǎn)移入負(fù)性光刻膠W形成主體。
[0085] 射流裝置可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成并密封在載玻片上。該材料對(duì)于所述裝 置的視覺(jué)控制是有利的。然而，其他材料如娃、玻璃、聚苯乙締、聚碳酸醋、聚氯乙締、環(huán)狀締 控共聚物、聚（甲基丙締酸甲醋）、熱固性聚醋、聚氨醋甲基丙締酸醋、Norland光學(xué)粘合劑、 水凝膠(例如藻酸鹽、膠原蛋白、瓊膠糖、聚丙締酷胺、多糖)可用于制造射流裝置。
[0086] 有利地，射流裝置和更具體地生產(chǎn)室允許在無(wú)菌條件下工作。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，所述射流裝置是無(wú)菌的。生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明射流裝置的方法可W包含將裝置滅菌的步驟。 滅菌步驟可W發(fā)生在密封裝置之前或之后。
[0087] 此外，生產(chǎn)方法可W包含用對(duì)于巨核細(xì)胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血 友病因子(VWF)或其功能性變體涂覆通道內(nèi)表面的至少具有紋理的部分的步驟。在具體的 實(shí)施方式中，通道內(nèi)表面通過(guò)用血管性血友病因子或其功能性變體的溶液解育來(lái)涂覆。通 常用于涂覆固相的VWF的濃度為5-100yg/mL。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，VWF的濃度為20-4化g/ mL。在一個(gè)實(shí)施方式中，通道內(nèi)表面涂覆有選自下組的VWF的功能性變體:在大腸桿菌或在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中W單體或二聚多膚表達(dá)的重組野生VWF或突變VWF多膚。
[0088] 除生產(chǎn)室之外，根據(jù)本發(fā)明的射流裝置可W包含任選的裝置例如：
[0089] -流速控制器，用于控制通道中所述懸液的流動(dòng)；
[0090] -任選的巨核細(xì)胞分煉器和/或混合器，用于富集含巨核細(xì)胞的懸液并均質(zhì)化所述 巨核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度，其位于生產(chǎn)室的上游；
[0091] -生產(chǎn)室下游的任選的血小板分煉器，用于通過(guò)從巨核細(xì)胞或其他細(xì)胞殘余物分 煉血小板來(lái)純化流出懸液；
[0092] 流速控制器可位于通道上W控制流速，優(yōu)選在通道進(jìn)口處或通道出口處。該裝置 可任選與累連接，所述累使得巨核細(xì)胞懸液流入射流裝置。
[0093] 生產(chǎn)室上游使用巨核細(xì)胞分煉器可W有利地獲得在細(xì)胞群方面均勻的懸液和為 血小板的工業(yè)生產(chǎn)獲得一致的產(chǎn)量和質(zhì)量。尤其是，巨核細(xì)胞分煉器包括將巨核細(xì)胞與血 小板和其他細(xì)胞殘余物分離的裝置?？墒褂萌缦滤鲇糜谘“寮?xì)胞分煉器的常規(guī)細(xì)胞分 煉器。尤其是，使用巨核細(xì)胞分煉器允許獲得巨核細(xì)胞富集的細(xì)胞懸液，即，懸液中至少 50%，優(yōu)選至少70%、80%、95%或約100%的細(xì)胞是巨核細(xì)胞。
[0094] 使用混合器可W進(jìn)一步有利地確保進(jìn)入射流裝置的生產(chǎn)室的懸液的良好均勻性， 尤其是如果生產(chǎn)室包含若干個(gè)通道。細(xì)胞混合器可W例如是Stroock等公開的類型 ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)。 [OOM]在生產(chǎn)室的出口，流出物包含所生產(chǎn)的血小板，但其可進(jìn)一步包含裸核和/或完整 的巨核細(xì)胞。因此將用于分離所生產(chǎn)的血小板的裝置有利地放置在生產(chǎn)室的下游。可W使 用常規(guī)的細(xì)胞分煉器裝置，例如適合于微射流技術(shù)或大體積如分離技術(shù)的那些。血小板分 煉器可選自交叉流過(guò)濾裝置、基于層流的細(xì)胞分煉器、介電電泳活化的細(xì)胞分煉器、基于光 學(xué)力的細(xì)胞分煉器、基于磁力的細(xì)胞分煉器、基于聲學(xué)力的細(xì)胞分煉器和基于慣性力的細(xì) 胞分煉器。在基于層流的細(xì)胞分煉器中，裝置可W是基于壓流分饋技術(shù)的細(xì)胞分煉器，如 Takagi等戶片公開（"Continuous particle separation in a microchannel having 曰symmetric曰lly 曰rr曰nged multiple br曰nches"，L曰b Chip,vol.5,n°7,p.778,2005)，或 基于確定性橫向位移的細(xì)胞分煉器，如L. R. Huang等所描述（"Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement".Science,304,987,2004)。
[0096] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法。所述方法通過(guò)使 用根據(jù)W上公開的本發(fā)明射流裝置來(lái)進(jìn)行。因此上述公開的射流裝置的所有具體特征和實(shí) 施方式是方法的特征和實(shí)施方式。
[0097] 首先，方法包含將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引入根據(jù)本發(fā)明的射流裝置的步驟。 所述懸液可產(chǎn)生并通過(guò)任選與流速控制器連接的累控制。通常，生產(chǎn)室的各通道定義單一 流，允許巨核細(xì)胞或其片段的懸液從其進(jìn)口流過(guò)生產(chǎn)室到其出口。因此，物流方向從通道進(jìn) 口到通道出口。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，將物流引入射流裝置是連續(xù)的。
[0098] 如上所公開，巨核細(xì)胞懸液可W是從供體分離或通過(guò)祖細(xì)胞分化獲得的懸液，所 述祖細(xì)胞例如選自造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
[0099] 在射流裝置中，將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引入生產(chǎn)室。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，在 進(jìn)入生產(chǎn)室之前，將所述懸液用細(xì)胞分煉器分煉和/或均質(zhì)化。均質(zhì)化可W在生產(chǎn)室上游的 混合器中進(jìn)行。然后，將巨核細(xì)胞或其片段的懸液引至生產(chǎn)室中的一個(gè)或多個(gè)通道的進(jìn)口 處。
[0100] 將其引入后，在生產(chǎn)室的通道中使巨核細(xì)胞或其片段的懸液在適于巨核細(xì)胞的延 伸、破碎和血小板釋放的剪切率下流動(dòng)。
[0101] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"壁剪切率'(ig是指用于表征物流與通道表面、障礙物或巨 核細(xì)胞的相互作用的參數(shù)
[0102] 壁剪切率iv在任何局部表面元件處定義。具體的表面元件可被定義為法向矢量S 和與表面相切的矢量為擬及局部方向中的流體速度妄，只要是平面直角坐標(biāo)系。然后 穿9? 通過(guò)一定義壁剪切率。剪切率的SI測(cè)量單位是S-1。 巧巧
[0103] 壁剪切率的值將由于障礙物的尺寸、形狀和位置而局部變化。因此，在根據(jù)本發(fā)明 的裝置的具有紋理部分的通道中，使巨核細(xì)胞或其片段的懸液在最小值和最大 之間改變的剪切率下家流動(dòng)。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，流速可W固定在能夠?qū)⒕哂屑y理部分的通道中的所 述巨核細(xì)胞經(jīng)歷0到最大值，優(yōu)選不超過(guò)30,000s^優(yōu)選ΙΟ,ΟΟΟεΛ更優(yōu)選8,000s^哺 甚至更優(yōu)選5, OOOs^的壁剪切率f。、的值的范圍內(nèi)。
[0105] 對(duì)于給定的通道幾何形態(tài)、懸液液相參數(shù)和流速，根據(jù)本發(fā)明的裝置的具有紋理 部分的通道中的剪切率可W利用有限元素法通過(guò)數(shù)字計(jì)算。
[0106] 比較起來(lái)，在人循環(huán)中，壁剪切率從最大靜脈中的30-40S-1至微循環(huán)中的5000S-1 變化。
[0107] 在通道出口，收集的懸液包含所生產(chǎn)的血小板。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，通道出口 收集的懸液可W進(jìn)一步包含裸核和/或完整的巨核細(xì)胞。因此，方法可進(jìn)一步包含從所述懸 液純化、富集或分離血小板的步驟。此外，可W在通道出口處分煉出所述血小板。分煉可W 用上文公開的生產(chǎn)室下游的細(xì)胞分煉器進(jìn)行。例如，分煉可通過(guò)選自W下的方法來(lái)進(jìn)行:交 叉流過(guò)濾、基于層流的分煉、基于介電電泳的分煉、基于光學(xué)力的分煉、基于磁力的分煉、基 于聲學(xué)力的分煉或基于慣性力的分煉。
[0108] 有利地，本發(fā)明射流裝置可高產(chǎn)量同時(shí)保持新產(chǎn)生血小板的功能質(zhì)量的方式 從巨核細(xì)胞懸液生產(chǎn)血小板。
[0109] 通過(guò)所述方法獲得的血小板可用于制備藥物組合物，例如用于治療血小板計(jì)數(shù)減 少病癥，尤其是血小板缺乏和血小板病。例如，可向患有血小板生產(chǎn)病癥的受試者輸注有效 量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的血小板。
[0110] 此外，本發(fā)明用于生產(chǎn)血小板的方法適于大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的血小板。 因此，所生產(chǎn)的血小板可用于診斷目的。它們可用作血小板功能標(biāo)準(zhǔn)化的正常對(duì)照。事實(shí) 上，血小板功能檢測(cè)要求來(lái)自正常個(gè)體和感染個(gè)體的天然功能性條件下的新鮮血小板。血 小板功能檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)每批所進(jìn)行的血小板功能檢測(cè)進(jìn)行正常對(duì)照。然 而通過(guò)靜脈穿刺術(shù)連續(xù)定期的采血引起若干健康問(wèn)題和倫理問(wèn)題。有利地，通過(guò)本發(fā)明方 法獲得的血小板可用作測(cè)量血小板功能的體外診斷測(cè)試中的陽(yáng)性對(duì)照。
【附圖說(shuō)明】
[0111] 將根據(jù)僅W說(shuō)明性目的提供的W下非限制性實(shí)施例連同附圖進(jìn)一步理解本發(fā)明， 其中：
[0112] 圖1是根據(jù)本發(fā)明血小板生產(chǎn)射流裝置的一個(gè)實(shí)施方式的流程圖。
[0113] 圖2闡明了本發(fā)明射流裝置的生產(chǎn)室的一個(gè)實(shí)施方式。
[0114] 圖3用示意圖表示具有桿形障礙物的具有紋理的表面。圖3.a是透視圖。圖3.b是頂 視圖。圖3. C是剖視圖。
[0115] 圖4用示意圖表示具有束形障礙物的具有紋理的表面。圖4.a是透視圖。圖4.b是頂 視圖。圖4. C是剖視圖。
[0116] 圖5表示實(shí)施例中使用的Ξ種不同的通道幾何形態(tài)：圖5.a的"通道幾何形態(tài)Γ、圖 5.b的"通道幾何形態(tài)2"和圖5. C的"通道幾何形態(tài)3"。
[0117] 圖6.a是實(shí)施例中所使用的平行化通道上游的細(xì)胞分配的頂視圖和圖6.b是實(shí)施 例中所使用的平行化通道上游的細(xì)胞分配的剖視圖。
[0118] 圖7是代表具有紋理的表面對(duì)捕獲巨核細(xì)胞的作用的圖?？胀?、圓對(duì)應(yīng)于非紋理通 道中粘附的巨核細(xì)胞的密度0,而實(shí)屯、圓對(duì)應(yīng)于虛線之間具有紋理的通道中粘附的巨核細(xì) 胞的密度0。紋理對(duì)應(yīng)于通過(guò)r=15μm、p = 85μm、H=34μm和h = 20皿定義的幾何形狀。X軸表 示從通道進(jìn)口的距離。該圖像在實(shí)驗(yàn)開始后50min記錄。
[0119] 圖8闡明了 VWF對(duì)捕獲細(xì)胞的作用。（a)用VWF(實(shí)屯、圓）和BSA(空屯、圓）表面涂覆通 道選擇性進(jìn)行的八個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中粘附的巨核細(xì)胞的表面密度OdX軸表示從通道進(jìn)口的距 離。灌注50min后進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù)?；疑珔^(qū)域表示微通道的紋理部分。（b)當(dāng)使用VWF涂覆 的微通道時(shí)灌注50min后表面的典型圖像。（C)當(dāng)使用BSA涂覆的微通道時(shí)灌注50min后表面 的典型圖像。比例尺是80皿。
[0120] 圖9是闡明塊密度(plot density)在幾何形狀1中對(duì)粘附的巨核細(xì)胞的表面密度 的作用的圖像，其中r等于15皿。不同的通道分別用P等于120皿、85μηι和60μηι形成圖案。最后 的通道是陰性測(cè)試。圖像在實(shí)驗(yàn)50min后拍攝。當(dāng)將Ρ降低到某一闊值時(shí)，我們觀察到巨核細(xì) 胞明顯的聚集，如P = 60]im的本實(shí)施例中的情況。比例尺是1 OOjim。
[0121] 圖10是闡明巨核細(xì)胞對(duì)桿陣列的不同性能的圖像。（a)在桿的平坦表面上從平流 到移位捕獲巨核細(xì)胞。順序顯示兩種不同的時(shí)標(biāo)和輸送性能。從0ms到3ms，巨核細(xì)胞通過(guò)流 動(dòng)平流輸送，產(chǎn)生幾 mm.的速度。從14ms到1431ms，巨核細(xì)胞在桿的平坦表面上移位，產(chǎn)生 幾皿的速度。（b)在桿的圓形表面上捕獲巨核細(xì)胞。順序顯示兩種不同的輸送性能：從 0ms到3ms，巨核細(xì)胞平流輸送至桿，然后從7ms到1823ms在桿圓形表面上移位，最終從 2111msW平流釋放。（C)通過(guò)桿的平坦表面捕獲巨核細(xì)胞，并捕獲于其右側(cè)。我們觀察到從 4s到978s巨核細(xì)胞的延伸，形成像線上的珠的結(jié)構(gòu)。比例尺是30]im。
[0122] 圖11是闡明成熟巨核細(xì)胞的延伸和破碎的圖像。時(shí)間蒙太奇顯示捕獲的正在經(jīng)歷 延伸結(jié)構(gòu)的Ξ次破裂的具有像線上的珠的結(jié)構(gòu)的巨核細(xì)胞。各白色箭頭顯示將W平流釋放 的延伸的部分，因?yàn)樗谙旅鎴D像上消失。比例尺是30WI1。
[0123] 圖12是闡明血小板釋放細(xì)節(jié)的圖像。時(shí)間蒙太奇顯示捕獲的具有延伸的像線上的 珠方面的巨核細(xì)胞。破裂發(fā)生在8.5ms-9ms。巨核細(xì)胞仍然是捕獲的（左側(cè))和釋放的前血小 板被流動(dòng)牽引。比例尺是20]im。
[0124] 圖13a和b是闡明從延伸的巨核細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)血小板的實(shí)施例的圖像，所述巨核 細(xì)胞同時(shí)被捕獲于大量桿上。圖像闡明使得血小板從成熟巨核細(xì)胞脫落過(guò)程的二維平行化 的單一通道的細(xì)節(jié)，所述巨核細(xì)胞源自（a)廝帶血造血干細(xì)胞和(b)外周血造血干細(xì)胞。注 意較長(zhǎng)的延伸覆蓋在后一種情況中的整個(gè)觀察視野。比例尺是100μπι。圖13c和d表示微射流 裝置中血小板生產(chǎn)的定量評(píng)價(jià)。微射流裝置VS對(duì)照中在2小時(shí)期間從源自（C)廝帶血造血干 細(xì)胞和(d)外周血造血干細(xì)胞的成熟巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的比較。在該實(shí)驗(yàn)中，巨核細(xì)胞懸 液在閉環(huán)循環(huán)中通過(guò)管道循環(huán)入五個(gè)平行的微射流忍片(微射流裝置）。對(duì)照巨核細(xì)胞在沒(méi) 有微射流忍片的閉環(huán)循環(huán)中通過(guò)管道循環(huán)(對(duì)照）。血小板濃度通過(guò)在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù) 而獲得。（C)提供微射流裝置(黑條)vs對(duì)照(淡灰條)在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(普通條，t = 0min)和在 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（陰影線條，t=120min)的平均值±SEM(n = 5)。利用Student t檢測(cè)對(duì)微射流裝 置VS對(duì)照中血小板濃度的成對(duì)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t = 120min時(shí)獲得的P值表示顯著差異 (***p<0.005)"(d).提供微射流裝置(黑條)vs對(duì)照(n = l)(淡灰條)在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(普通條， t = 0min)和在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（陰影線條，t = 120min)的平均值±561(11 = 3)。
[0125] 圖14是微射流裝置中生產(chǎn)的血小板與缺少微射流忍片的對(duì)照系統(tǒng)中獲得的那些 相比的流式細(xì)胞儀分析的圖像，如圖13的圖例中詳細(xì)描寫。
[0126] (a)血小板受體的單一顏色流式細(xì)胞儀分析，表明微射流裝置(黑條)vs對(duì)照(淡灰 條）中生產(chǎn)的血小板表面上CD61、CD42b和CD49b受體的數(shù)目。提供平均值±SEM(n = 3)，利用 S化dent t檢測(cè)對(duì)微射流裝置VS對(duì)照中不成對(duì)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較受體數(shù)目。CD4化柱狀 圖的星號(hào)表示顯著差異(P<〇.05)。
[0127] (b)血小板受體的兩種顏色流式細(xì)胞儀分析，表明微射流裝置中生產(chǎn)的CD41 + CD42b+血小板群體VS對(duì)照中的背景值。
[0128] (C和d)血小板受體的兩種顏色流式細(xì)胞儀分析，其中用或不用刺激人PAR-1凝血 酶受體(TRAP)的激動(dòng)劑膚S化LR腳舌化CD41 /CD61受體。在圖14. C中，柱狀圖表明了在血小板 和CD42b+口內(nèi)，在微射流裝置(黑條)和對(duì)照（淡灰條）中生產(chǎn)的血小板在TRAP活化之前(普 通條)或之后（陰影線條）的PAC-1陽(yáng)性單元％。提供平均值±SEM(n = 6)，利用Student t檢 測(cè)對(duì)不成對(duì)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較非刺激血小板vs TRAP-刺激的血小板。P值的星號(hào)表示 在微射流裝置中，但并非在對(duì)照中生產(chǎn)的血小板在TRAP活化之前或之后PAC-1陽(yáng)性單元％ 之間的顯著差異(P<〇.05)。圖14.d顯示血小板口內(nèi)的相應(yīng)點(diǎn)圖，表明在微射流裝置（左圖） 和對(duì)照（右圖）中生產(chǎn)的非刺激(上圖）和TRAP-刺激樣品（下圖）中的PACrCD4化+血小板群。 注意在缺少對(duì)照的微射流裝置中生產(chǎn)的TRAP-刺激的血小板中PACrCD4化+群的移動(dòng)。
[0129] 圖15是顯示在微射流裝置中生產(chǎn)的血小板與在缺少微射流忍片的對(duì)照系統(tǒng)中獲 得的那些相比的粘附和聚集的顯微圖像，如圖13.C的圖例中詳細(xì)描寫。
[0130] (a)在不存在(頂圖）或存在凝血酶(底圖）的情況下在通過(guò)射流裝置(左圖）或?qū)φ?(右圖）生產(chǎn)的樣品中用抗微管蛋白抗體間接免疫巧光標(biāo)記（用第二AlexaFluor488抗小鼠 抗體顯影和AlexaFluor546鬼筆環(huán)膚進(jìn)行F-肌動(dòng)蛋白染色）。用Axio Observer顯微鏡 (26133)^40^.6-倍放大率用91(：1^4斗-化1?-12數(shù)字〇：0照相機(jī)(9成像)獲取圖像。在射流 裝置出口處收集的樣品中觀察到表示未活化的血小板的特征的環(huán)狀微管蛋白染色(上左）， 而從對(duì)照收集的樣品中回收不含環(huán)狀微管蛋白染色的較大片段(上右）。在射流裝置出口處 收集的樣品中觀察到表示活化的血小板的特征的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維(下左），而從對(duì)照收集 的樣品中回收不含組織化應(yīng)力纖維染色的較大元件(下右）。比例尺是如m。
[0131] (b)在不存在(上圖）或存在（下圖）通過(guò)模擬人PAR-1凝血酶受體TRAP-1的激動(dòng)劑 膚S化LR腳舌化的情況下在射流裝置(上左）出口處和從對(duì)照（右）收集的樣品中回收的血小 板或元件的掃描電子顯微圖像。各條件包括粘附牛血清白蛋白或纖維蛋白原。比例尺是扣 m"(c)在纖維蛋白原和化C12存在下的聚集。用模擬人PAR-1凝血酶受體TRAP-1的激動(dòng)劑膚 S化LR腳舌化之前(上圖）或之后（下圖）觀察到血小板聚集。在射流裝置出口處收集的樣品中 可見(jiàn)大的聚集體(下左圖）。在對(duì)照樣品中回收的片段在激動(dòng)劑膚的存在下沒(méi)有聚集(下右 圖）。比例尺是10皿。
[0132] 圖16包括顯示引入微射流混合器的成熟巨核細(xì)胞懸液的圖像。（a)在微混合器進(jìn) 口處拍攝的400副圖像的重疊。細(xì)胞W平流方式從左至右流過(guò)X方向且相對(duì)于y軸聚焦。（b) 在微混合器出口處拍攝的400副圖像的重疊。細(xì)胞流在y方向是均質(zhì)的。（C)混合器中成熟巨 核細(xì)胞的軌跡。間隔為1ms的200副連續(xù)圖像的重疊。比例尺是1 OOwii。
[0133] 圖17顯示細(xì)胞分煉器的兩個(gè)實(shí)施例。圖17. a是顯示通過(guò)壓流分饋法分煉血小板的 圖像。進(jìn)口細(xì)胞懸液由固定血小板和DAMI細(xì)胞組成。將混合物引入通道（1)。將不含細(xì)胞的 緩沖液引入通道(2)。從通道(3)中回收血小板和從通道(4)中回收DAMI細(xì)胞。圖像是間隔為 1ms的30副連續(xù)圖象的重疊，W顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是200μηι。圖17.b是顯示通過(guò)確 定性橫向位移分煉血小板的圖像。進(jìn)口細(xì)胞懸液由固定血小板和DAMI細(xì)胞組成。將混合物 從進(jìn)口處引入并在出口處分煉(顯示于圖像上）：將DAMI細(xì)胞偏離并在中央出口巧）中分煉， 而血小板不偏離并在側(cè)向出口（6)上分煉。圖像是間隔為0.3ms的485副連續(xù)圖像的重疊 ，W 顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是lOOwn。
[0134] 在圖1中，射流裝置1用示意圖表示。射流裝置1由側(cè)向細(xì)胞混合器2、生產(chǎn)室3和細(xì) 胞分煉器4串聯(lián)組成。將巨核細(xì)胞懸液5引入射流裝置1。收集流出懸液6。在流入懸液5和流 出懸液6之間實(shí)施流速控制器7。流速可W通過(guò)壓差或流速源，例如開放系統(tǒng)中的注射器累、 閉合環(huán)路系統(tǒng)中的蠕動(dòng)累(未顯示)來(lái)施加。
[0135] 圖2更更詳細(xì)地展示射流裝置的生產(chǎn)室3。生產(chǎn)室3包含具有兩個(gè)孔9、10的一個(gè)通 道8:用于引入巨核細(xì)胞懸液5的一個(gè)進(jìn)口 9和用于收集流出懸液6的一個(gè)出口 10。通道的縱 向用箭頭14表示。通道8具有長(zhǎng)度L、寬度W和高度H。根據(jù)本發(fā)明，通道8在其內(nèi)表面的至少一 部分11處具有紋理。
[0136] 表面的紋理通過(guò)多個(gè)置于至少一部分通道的內(nèi)表面的障礙物產(chǎn)生。
[0137] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，障礙物是桿且如圖3所示安排。桿12位于一個(gè)通道壁13 的內(nèi)表面。各桿12具有半徑為r的基本上圓形的截面，和布置所述桿W形成具有六邊形的周 期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案。兩個(gè)桿中屯、之間的最近距離用P表示。角度α是通道的縱向14和六邊 形的周期性結(jié)構(gòu)的原始細(xì)胞的晶格矢量之一定義的最低角度。桿的高度用h表示，其例如是 0<h《H，其中Η是通道高度。
[0138] 根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，障礙物是束且如圖4所示安排。束15位于一個(gè)通道壁 13的內(nèi)表面。各束15具有高度為h和寬度為化的基本上長(zhǎng)方形的截面。束的長(zhǎng)度等于通道寬 度W的長(zhǎng)度。束放置為垂直于通道的縱向14。兩個(gè)束中屯、之間的最近距離用P表示。束的高度 用h表示，其例如是0<h《H，其中Η是通道高度。
【具體實(shí)施方式】
[0139] 材料和方法
[0140] CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)和分化
[0141 ] 將CD34+細(xì)胞通過(guò)之前報(bào)告的免疫磁性技術(shù)(Miltenyi Biotec，Paris，F(xiàn)rance)從 人月齊帶血（UCB)或外周血分離（參見(jiàn)？0；[則111古-如33 33(3等/前0古(311/061古3431容1131；!_打容 inhibits human megakaryocytic terminal differentiation，'，Blood，vol.116，η°25， p. 5670-5678,2010)。根據(jù)Helsinki聲明在知情同意和經(jīng)我們的學(xué)會(huì)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后獲 得這些血樣D將CD34+細(xì)胞在37"C下在5%C02中在由Iscove modified Dulbecco medium (IMDM;G;LbcoInvitrogen，Saint-Aubin，F(xiàn)rance)組成的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ) 充有15%BIT 9500血清替代物（Stem Cells Technologies,Grenoble,化31106)、0-單硫代 甘油（Sigma-Al虹ich，Saint-QuentinFallavier，F(xiàn)'rance)和脂質(zhì)體（5葬脂醜基-膽堿、膽固 醇和油酸；SigmaAldi'ich)。在第0天將人重組干細(xì)胞因子（SCF, lOng/mL;Miltenyi Biotec) 和促血小板生成素版激動(dòng)劑AF13948(TP0,50nM)(參見(jiàn)Dunois-Lard旨等，"E邱osureof human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production，，， 6100(1，￥01.114，11°9,9.1875-1883,2009)添加至培養(yǎng)基，然后在第7天添加不含5〔尸的20禮 TPO。將培養(yǎng)12-14天后獲得的成熟UCB巨核細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中稀釋至0.7-1.2xl06mL的濃 度，因此比之前報(bào)告的實(shí)驗(yàn)少濃縮大約10倍。發(fā)現(xiàn)測(cè)量的平均直徑化HS是12.5+/-1.7皿。就 在暴露于剪切之前去除培養(yǎng)期間形成的血小板的通過(guò)BSA梯度根據(jù)(Robert A，Codin V， Gamier A,Pineault N.Megakaryocyte and platelet production from human cord blood stem cells.Methods Mol Biol.2012;788:219-47)報(bào)告的方法來(lái)進(jìn)行。然后將濃度 調(diào)節(jié)至200 000個(gè)巨核細(xì)胞/mL。除非另有說(shuō)明，結(jié)果為源自UCB CD34+的巨核細(xì)胞。
[01創(chuàng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)
[0143] 將成熟巨核細(xì)胞懸液引入固定于W至少3(K)rpm旋轉(zhuǎn)的軌道混合器（IKA MS3基本 型)上的25cm2燒瓶(Corning，USA)中。軌道混合器用于保持懸液中細(xì)胞濃度的均勻性。燒瓶 中巨核細(xì)胞濃度范圍為至少lOOmL-i且不能超過(guò)10xl06mL-i。
[0144] 可通過(guò)不同組分用許多方法控制物流:例如差壓控制器、注射累和蠕動(dòng)累。當(dāng)使用 差壓控制器時(shí)，將氣壓進(jìn)口和懸液出口密封插入燒瓶軟木塞。通過(guò)壓力控制器(MFCS-4C, Fluigent S.A. ,France)將氣壓施加于燒瓶。將燒瓶與具有聚酸酬酸(P邸K)管（Upchurch Scientific，USA)的微射流忍片的進(jìn)口連接?？墒褂闷渌?Tygon R-1000，Saint-Gobain， France,PT陽(yáng) tubing,Saint Gobain,France for instance)。在出口收集懸液。當(dāng)使用蠕 動(dòng)累(Reglojsmatec, Switzerland)時(shí)，進(jìn)口和出口管到達(dá)同一個(gè)旋轉(zhuǎn)的燒瓶。可在微射流 元件的上游或下游塞住蠕動(dòng)累。還可W通過(guò)注射累(P皿2000,化rvard apparatus, US)引 入巨核細(xì)胞懸液。
[0145] Ξ個(gè)微射流元件串聯(lián)實(shí)施：巨核細(xì)胞分煉器和/或上游側(cè)向細(xì)胞混合器、血小板生 產(chǎn)通道和下游細(xì)胞分煉器，如圖1所示。細(xì)胞混合器和細(xì)胞分煉器是任選的。
[01W 裝置制造
[0147]微射流元件根據(jù)軟光刻技術(shù)快速成型制造 (Xia等.1998. "Soft lithography" ? Annual Review of Materials Science.vol.28,n°l,p.153-184)。首先，從包含微通道設(shè) 計(jì)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)文件制造透明片。運(yùn)些透明片用作掩模通過(guò)常規(guī)的照相平版印刷術(shù)將 圖案轉(zhuǎn)移入負(fù)性光刻膠(SU-8 2000和3000系列，Microchem，US)，產(chǎn)生具有微通道正突起的 主體。兩個(gè)通道均由模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS, Sy 1 gard, Dow Corning, USA)制成，密封 于載玻片上。混合PDMS預(yù)聚物和固化劑并脫氣。將混合物倒在主體上，在70°C固化化，切成 單個(gè)忍片，打進(jìn)口和出口孔。用異丙醇清潔載玻片并干燥。PDMS單個(gè)結(jié)構(gòu)和載玻片均在氧等 離子體烘箱中處理，然后密封。
[014引血小板生產(chǎn)通道
[0149] 具有紋理的表面通過(guò)通道壁(玻璃或PDMS)上的3D圖案來(lái)定義。運(yùn)里我們提出運(yùn)些 可能的圖案的兩個(gè)實(shí)例：（〇xy)平面上的六角形圓盤陣列和(Ox)方向上的1D束陣列。那些圖 案的幾何形狀描述于圖3和圖4。桿陣列的設(shè)計(jì)通過(guò)Ξ個(gè)參數(shù)定義：圓盤半徑r、兩個(gè)圓盤中 屯、之間的距離P W及進(jìn)口的物流方向和通過(guò)兩個(gè)柱中屯、定義的方向之間的角度α。在本文我 們用于實(shí)驗(yàn)的幾何形狀中，α通過(guò)W下標(biāo)準(zhǔn)定義：sina = r/p。該標(biāo)準(zhǔn)幾何上暗示著，一旦投 影在垂直于初始物流方向的軸上，兩個(gè)相鄰的圓盤中屯、通過(guò)一個(gè)半徑分離。用實(shí)驗(yàn)方法，r 為15皿-20皿和P為60μηι-120皿。圖3. C和圖4. C顯示(0巧)平面上的障礙物(束或桿）。通道的 高度和障礙物的高度分別通過(guò)Η和h來(lái)定義。用實(shí)驗(yàn)方法，參數(shù)h/H為0.22(小桿)和1(完整的 柱)。
[0150] Ξ種不同的通道幾何形態(tài)用于該實(shí)施例，闡明于圖5. a、圖5. b和圖5. C:
[0151] -第一個(gè)，所謂的"通道幾何形態(tài)Γ，用于測(cè)量通道紋理對(duì)于巨核細(xì)胞捕獲的影響。 它由8個(gè)平行通道組成：6個(gè)具有紋理的通道和兩個(gè)光滑通道。從x = 0mm(進(jìn)口）到x = 20mm (部分1)所有通道是光滑的。圖案遵循參數(shù)r = 15皿、H= 36皿、h/H = 0.55?？趯?duì)于不同的具有 紋理的通道是變化的：ρ = 60μπι(2個(gè)通道）、ρ = 85μπι(2個(gè)通道)和ρ = 120μπι(2個(gè)通道）。通過(guò) 改變不同Ρ參數(shù)的具有紋理的長(zhǎng)度使得所有的流體阻力相等。對(duì)于ρ = 8扣m，在通道的20- 22mm之間構(gòu)造紋理且在22-40mm之間保持光滑。
[0152] -第二個(gè)，所謂的"通道幾何形態(tài)2"，用于測(cè)量蛋白質(zhì)表面涂層效應(yīng)和紋理效應(yīng)。它 由8個(gè)平行通道組成。所有通道的長(zhǎng)度均為四厘米且僅在第一和第Ξ厘米之間構(gòu)造紋理。通 道幾何形態(tài)2用參數(shù)r = 15皿、H=36皿、h/H=0.55和p = 85皿組成圖案。
[0153] -第Ξ個(gè)，所謂的"通道幾何形態(tài)3"，用于利用障礙物效果使血小板生產(chǎn)過(guò)程平行 化。它由8個(gè)蛇形平行通道組成（顯示為圖5.C中的塊狀物）。所有通道的長(zhǎng)度均為17.3cm且 在通道的直線部分(代表77%的總長(zhǎng)度)上構(gòu)造紋理。通道幾何形態(tài)3用參數(shù)r=15ym、H=52 4111、11/^=巧化=8541]1組成圖案。
[0154] 剪切率
[0155] 我們?cè)谕ǖ辣谏隙x了表面元件，不管在玻璃或PDMS(包括PDMS障礙物)上。在該 表面元件上，我們通過(guò)垂直于它的矢量寇定義平面的單位矢量。測(cè)定與表面相切且在流體 速度V的局部方向的單位矢量品W使得(某滯)是平面直角坐標(biāo)系。然后通過(guò)^定義壁 涅巧. 剪切率(S-1)。壁剪切率通過(guò)裝置中的流速和裝置的幾何形狀來(lái)控制。整個(gè)射流系統(tǒng)的水動(dòng) 阻力通過(guò)在進(jìn)口和出口之間施加壓差、借助于壓力控制器和通過(guò)測(cè)量由此產(chǎn)生的流速來(lái)表 征（Flowell,Fluigent,France)。 郵]影像顯微鏡系統(tǒng)
[0157] 將微射流忍片設(shè)置在倒置顯微鏡（DMI6000B，Leica Microsystems GmbH, Germany)平臺(tái)上。用計(jì)算機(jī)輔助的機(jī)動(dòng)化平臺(tái)控制器記錄沿著通道長(zhǎng)度的位置。我們記錄 了觀測(cè)視野位置和隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間它們之間的交替錄像。用微分干設(shè)差鏡頭記錄10X-40X之 間的影片和圖像。用CMOS高速照相機(jī)(化steam SA3,陸otron,USA)W〇.5到1500化的頻率記 錄圖像。
[0158] 從記錄的通道圖像人工計(jì)數(shù)表面粘附細(xì)胞，當(dāng)樣品成塊時(shí)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和庫(kù) 爾特計(jì)數(shù)器(Scepter II，Mi 11 ipore，US)計(jì)數(shù)懸液中的細(xì)胞。
[0159] 蛋白質(zhì)表面處理
[0160] 血管性血友病因子（VWF)是Laboratoirel·化n^aisdu fractionnement et des Biotechnologies的禮物。將它W40yg.mL-i稀釋于不含巧離子和儀離子的憐酸鹽緩沖鹽水 (PBSKLonza，Belgium)，并灌注于密封的微通道中。我們僅在血小板生產(chǎn)通道中使用該表 面涂層。
[0161] 將牛血清白蛋白（Sigma-Al化ich La ￥6巧;[116'63,化曰]1。6)^4〇4邑.111[1稀釋于憐 酸鹽緩沖鹽水(PBS)中并灌注于微通道中。
[0162] 對(duì)于兩種蛋白質(zhì)處理，忍片的進(jìn)口和出口通過(guò)蓋玻片覆蓋。將忍片在4°C解育過(guò)夜 并在實(shí)驗(yàn)前用PBS洗涂。玻璃和PDMS上的VWF吸附通過(guò)巧光標(biāo)記來(lái)證實(shí)，所述巧光標(biāo)記使用 第一多克隆兔抗VWF抗體(Dako，10yg.mL-i)和第二Alexa fluor 546多克隆山羊抗兔抗體。 [01創(chuàng)細(xì)胞混合器
[0164] 混合器的設(shè)計(jì)直接產(chǎn)生自Stroock等公開的微通道的無(wú)序混合器的人字形結(jié)構(gòu) ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)?？?慮到Stroock等的參數(shù)，細(xì)胞混合器設(shè)計(jì)Wh = 50ym、w = 300ym、a = 1、p = 2/3或1/3和q = 0.63μηι制備。
[01化]血小板生產(chǎn)通道的平行化
[0166] 期望流入裝置的巨核細(xì)胞流速高W增加血小板生產(chǎn)數(shù)。對(duì)于給定的障礙物圖案和 通道高度，可通過(guò)增加通道寬度來(lái)增加細(xì)胞流速。PDMS通道的機(jī)械限制利用最大的寬度與 高度之比W避免通道塌陷，我們平行化通道W增加有效寬度。
[0167] 通過(guò)管將巨核細(xì)胞引入血小板生產(chǎn)通道。將細(xì)胞通過(guò)Ξ角形進(jìn)口分配到平行通道 中，所述進(jìn)口使細(xì)胞到達(dá)每個(gè)通道（圖6)。對(duì)于給定的通道高度，壁剪切率與通道寬度成反 比。因此，壁剪切率在靠近進(jìn)口壁處比在平行化通道進(jìn)口之前高得多。
[0168] 為避免施加可能破壞細(xì)胞的壁剪切率，用高于平行化剪切通道中使用的高度制造 分配通道。運(yùn)兩個(gè)高度之比通常為2-20。
[01~]血小板分煉
[0170]可W通過(guò)從血小板生產(chǎn)通道中串聯(lián)分煉流出懸液來(lái)將裸核和完整的巨核細(xì)胞從 血小板中去除，如圖1所示。運(yùn)可W用微射流技術(shù)進(jìn)行。大體積也可考慮析離技術(shù)。我們提供 使用壓流分饋技術(shù)（Τ曰k曰邑i等，（'Continuous p曰rticle sep曰ration in曰microch曰nnel having asymmetrically arranged multiple branches"，Lab Chip,vol.5,n°7,p.778, 2005)和確定性橫向位移化.R.Huang等."Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement" ,Science,304,987,2004)分煉血小板的兩個(gè)實(shí)施 例。對(duì)于壓流分饋技術(shù)，用寬度為50μπι的壓段來(lái)制造裝置(圖17)。細(xì)胞懸液由多聚甲醒固定 的血小板（來(lái)自全血）和DAMI細(xì)胞（巨核細(xì)胞細(xì)胞系，Greenberg等.1988. ('Characterization of a new megakaryocytic cell line: the Dami cell，'.Blood.72: 1968-1977)組成。圖17.a顯示可利用該技術(shù)將DAMI細(xì)胞和血小板在不同的出口分支中分 饋。確定性橫向位移(DLD)是基于通過(guò)微米級(jí)障礙物的周期陣列的層流的被動(dòng)的結(jié)構(gòu)依賴 性粒徑分離方法。DAMI細(xì)胞和固定的血小板的混合物基于最初由L.R.化ang等.（Science, 304,987(2004))描述和由K丄outherback等.（AIP Advances 2,042107(2012))開發(fā)的裝置 來(lái)分煉。該裝置由一個(gè)進(jìn)口、球形的桿陣列和兩個(gè)出口（中央和側(cè)向的）組成。在圖17.b上， 裝置長(zhǎng)度為5cm，寬度為3mm和高度為40皿。桿直徑為85皿且桿之間的距離為15皿。桿行移位 形成0.05弧度的角度。表面涂覆有BSA涂層。將DAMI細(xì)胞偏離并在中央出口（6)中分煉，而血 小板不偏離并在側(cè)向出口（5)上分煉。裝置提供100%的血小板純度和80%的血小板回收 率。圖像是通過(guò)0.3ms分離的485副連續(xù)圖像的重疊，W顯示不同的細(xì)胞軌跡。比例尺是10化 ΓΠ 〇
[0171] 收集的血小板的表征
[0172] 將幾何形狀3的微射流裝置中的血小板生產(chǎn)與由不存在微射流忍片的管道組成的 對(duì)照樣品相比。用流式細(xì)胞儀抓巧光激活的細(xì)胞分煉器(FACS)Calibur(BD Biosciences， Le化nt de Claix，F(xiàn)rance)表征CD41和CD42抗原的表達(dá)。用異硫氯酸巧光素(FITC)-結(jié)合 的抗人CD41(aIIb)和R-藻紅蛋白（PE)-結(jié)合的抗人CD42b(GPIba)(兩者均來(lái)自Beckman Coulter, Villepinte ,France)和FITC-結(jié)合的抗人活化的日1化63(808;[03。16]1。6 3)在22"€ 解育血小板 15分鐘。用FITC小鼠 IgGi(Beckman Coulter)、陽(yáng)小鼠 IgGi(Beckman Coulter)進(jìn) 行對(duì)照。用GP篩選分析(Bio巧tex,Marseille ,France)進(jìn)行血小板受體的單色流式細(xì)胞儀 分析?；谛?zhǔn)的珠標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將巧光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為每個(gè)血小板結(jié)合的單克隆抗體的相 應(yīng)數(shù)目來(lái)測(cè)定抗原性位點(diǎn)數(shù)。如在上文引用的Dunois-Lard自的出版物中之前報(bào)告的進(jìn)行纖 維蛋白原粘附分析和外巧光表征，除了活化是在凝血酶或PAR-1凝血酶受體的激動(dòng)劑膚存 在的情況下獲得。用高分辨率生物成像平臺(tái)化MCCD MGi Plus Qimaging Rolera camera, Roper Scientific,Ενιτ,France)分析在494nm和522nm(分別為吸收和發(fā)射）的外巧光。通 過(guò)在涂有2%BSA或纖維蛋白原(0.2mg/ml)的載玻片上添加血小板來(lái)進(jìn)行30min的掃描電子 顯微術(shù)。之后，將一滴包含肥陽(yáng)8 5〇1111化(：1、135111]\1化2+、2111]\1?。42%和戊二醒4%的溶液添 加到載玻片上用于血小板固定，然后將載玻片在包含相同溶液的浴中解育過(guò)夜。次日，將樣 品洗涂并用25%、50%、75%、95%和最后是100%的乙醇脫水，然后通過(guò)真空干燥機(jī)干燥。 用雙重通道全血/光學(xué)Lumi-聚集度計(jì)(Model 700化ronolog Co巧oration)進(jìn)行聚集。 陶]巨核細(xì)胞混合
[0174]人字形凹槽在通道的(Oyz)平面產(chǎn)生無(wú)序微縱滿，導(dǎo)致細(xì)胞的橫向位移（圖16)。它 們還使得細(xì)胞打破其軌跡，進(jìn)入相對(duì)于物流軌跡旋轉(zhuǎn)45Γ的小道，然后退出小道并在主通 道中繼續(xù)。那些無(wú)序的位移導(dǎo)致均質(zhì)的側(cè)向細(xì)胞流速，如圖16b.所描述。
[01巧]巨核細(xì)胞捕獲
[0176]我們通過(guò)獨(dú)立于其移位速度(包括非移動(dòng)細(xì)胞）的表面粘附的巨核細(xì)胞定義捕獲 的巨核細(xì)胞。我們根據(jù)束或桿（圖3和圖4定義）的不同幾何形狀評(píng)估了巨核細(xì)胞捕獲。結(jié)果 顯示于圖7。沿著非紋理的第一部分通道，粘附的巨核細(xì)胞的密度非常低(cKlOOmnf2)。相反， 沿著具有紋理的一部分通道，密度高得多(〇〉750mnf2)。作為對(duì)照，光滑通道顯示巨核細(xì)胞的 表面密度不可檢測(cè)。也證實(shí)了桿間距離p = 60μηι、ρ = 85μηι和p = 120]im的捕獲增強(qiáng)。
[0177]沿著接著紋理部分且缺乏障礙物的最后部分，我們觀察到具有紋理的通道（ο~ 250mm-2)和不具有紋理的通道(曰<10mm-2)之間的明顯密度差。運(yùn)是與巨核細(xì)胞的移位速度 聯(lián)合的部分2中發(fā)生的捕獲的直接后果(移位速度的分布從Ομπι. S-1擴(kuò)大至200μπι. S-1)。
[017引蛋白質(zhì)表面涂層的影響
[0179] 在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，當(dāng)通過(guò)結(jié)合其GPIb受體經(jīng)受高剪切率(〉1000s^)時(shí)，VWF允許 循環(huán)血小板的移位化 uizinga 等，Shuctures of Glycoprotein ]；baand Its complex with von Willebrand Factor AlDomain", Science ,vol.297,n°5584,p.1176-1179, 2002)。在體外，VWF的吸附允許巨核細(xì)胞、血小板和前血小板移位到PDMS和玻璃表面上 (Dunois-Lard有等，"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production" ,Blood,vol. 114,n° 9 ,p. 1875-1883,2009)。我們比較 了 VWF和BSA涂層對(duì)通道壁上巨核細(xì)胞的粘附的影響。
[0180] 我們用涂有VWF的通道幾何形態(tài)2進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)，用涂有BSA的通道幾何形態(tài)2進(jìn)行 四次實(shí)驗(yàn)。我們比較了 t = 50min時(shí)巨核細(xì)胞的表面密度。
[0181] 結(jié)果顯示于圖8。當(dāng)涂有VW即寸，通道光滑部分的平均巨核細(xì)胞密度為54mnf2,通道 紋理部分的平均巨核細(xì)胞密度為275mm 2。當(dāng)涂有BSA時(shí)，通道光滑部分的平均巨核細(xì)胞密度 為4mnf2,通道紋理部分的平均巨核細(xì)胞密度為39mnf2。運(yùn)證實(shí)了兩種涂層均發(fā)生了之前段 落中描述的捕獲效應(yīng)。此外，VWF明顯增加了通道中粘附細(xì)胞的密度。
[0182] 用纖維蛋白原涂層進(jìn)行第Ξ組實(shí)驗(yàn)。盡管已知纖維蛋白原W低剪切率結(jié)合巨核細(xì) 胞，但是在用于促進(jìn)巨核細(xì)胞延伸的高剪切率下不可能觀察到巨核細(xì)胞捕獲。
[0183] 那些結(jié)果沒(méi)有詳細(xì)描述表面上細(xì)胞的性能。我們定性地觀察到不具有紋理的通道 內(nèi)沿著X軸的距離，0明顯降低。在具有紋理的通道中，我們觀察到沿著紋理長(zhǎng)度，〇先略微增 加，隨后降低。運(yùn)些結(jié)果是瞬時(shí)的，并由巨核細(xì)胞的不同輸送機(jī)制產(chǎn)生。
[0184] 巨核細(xì)胞和血小板輸送
[0185] 細(xì)胞具有兩種不同的輸送方式:平流，產(chǎn)生幾 mm. 的速度，和移位，產(chǎn)生幾 μπι. 的速度。圖10提出了細(xì)胞和壁之間不同的可能相互作用。使用桿陣列，可W通過(guò)Dunois- Lardg等（ibid.)描述的通道壁捕獲細(xì)胞，也可W通過(guò)在桿的頂部或在桿的垂直側(cè)上移位來(lái) 捕獲細(xì)胞。當(dāng)通過(guò)桿捕獲時(shí)，細(xì)胞在通道壁上跟隨其移位，或W平流釋放（圖10.b)，否則停 止移位（圖10.C)并在桿后被捕獲。那些單細(xì)胞事件闡明了之前兩段中描述的較大規(guī)模的性 能。
[01化]巨核細(xì)胞破裂和血小板釋放
[0187] 我們觀察到血小板從表面粘附的巨核細(xì)胞脫落。當(dāng)巨核細(xì)胞移位到通道壁上時(shí)， 它們與壁表面上的VWF建立了瞬時(shí)相互作用，其逐漸導(dǎo)致形態(tài)變化直到血小板從巨核細(xì)胞 脫落。當(dāng)延伸體和細(xì)胞體均移位時(shí)發(fā)生脫落。該過(guò)程描述于上文引用的Dunois-Lard6的出 版物中和國(guó)際專利申請(qǐng)W0 2010/06382311中。破裂后，兩種實(shí)體繼續(xù)移位到壁表面上。
[0188] 當(dāng)細(xì)胞體移位直到在桿周圍或桿后被捕獲時(shí)，也發(fā)生脫落（圖10. C)。在幾分鐘的 時(shí)間范圍內(nèi)，巨核細(xì)胞經(jīng)歷形態(tài)變異，導(dǎo)致形成采用線上的珠的結(jié)構(gòu)的延伸體，如之前上文 引用的Dunois-Lard6的出版物中所報(bào)告。此外，與整個(gè)細(xì)胞與涂層表面接觸相反，一些延伸 體似乎與物流一起自由移動(dòng)(搖擺），盡管細(xì)胞通過(guò)至少一個(gè)接觸點(diǎn)保持在相同位置。隨著 線上的珠的延伸體的尺寸增長(zhǎng)，一些發(fā)生破裂，釋放血小板和/或前血小板。圖11報(bào)告了十 種巨核細(xì)胞延伸的Ξ種不同的破裂(數(shù)據(jù)未顯示）。搖擺釋放詳細(xì)描述于圖12的短時(shí)標(biāo)中。 破裂后，釋放的前血小板的速度測(cè)量為4cm每秒，其對(duì)應(yīng)于物流的速度。我們假定破裂后釋 放的元件平流輸送。
[0189] 各巨核細(xì)胞釋放的血小板的量可通過(guò)單個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間成像來(lái)估計(jì)。我們的觀察 結(jié)果顯示捕獲于桿上且經(jīng)歷剪切的巨核細(xì)胞可W釋放11個(gè)片段/小時(shí)。運(yùn)些片段具有線上 的珠的形狀。我們測(cè)量了釋放珠的尺寸分布，將它們中每一個(gè)固定為影像框架上的楠圓。假 定旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，我們估計(jì)了釋放珠的總體積并用它除W我們假定為血小板的最小的觀察到的 珠子體積。用該方法，我們發(fā)現(xiàn)血小板產(chǎn)量高達(dá)350個(gè)血小板/巨核細(xì)胞。通過(guò)比較，預(yù)期人 巨核細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)化為1〇2-1〇3個(gè)血小板（Thon et al,"Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release"，J Cell Biol,vol.191,n°4,p.961- 874,2010,and Thon et al.,"Platelet Formation",Seminars in Hematology,vol.47, n°3,p.220-226,2010)〇
[0190] 從巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的平行化
[0191] 我們通過(guò)制造用柱陣列組成圖案的平行化通道來(lái)擴(kuò)大血小板生產(chǎn)的過(guò)程。所有W 下實(shí)驗(yàn)使用上述幾何形狀3。幾何形狀3具有總共168770個(gè)柱。圖13. a和13. b是顯示總共66 個(gè)柱的柱陣列的細(xì)節(jié)，其中48個(gè)柱設(shè)及巨核細(xì)胞捕獲或伸長(zhǎng)過(guò)程。單獨(dú)地，我們注意到單個(gè) 柱能夠捕獲幾個(gè)巨核細(xì)胞。該過(guò)程是瞬時(shí)的，且在物流方向上與距離相關(guān)。圖13.a描繪了廝 帶血巨核細(xì)胞的捕獲和延伸，圖13.b描繪了外周血巨核細(xì)胞的捕獲和延伸。
[0192] 在"微射流裝置"結(jié)構(gòu)中，將20mL經(jīng)攬拌的巨核細(xì)胞懸液(200000個(gè)巨核細(xì)胞/mU 在閉環(huán)中通過(guò)5個(gè)根據(jù)幾何形狀3制造的平行裝置循環(huán)2小時(shí)。在"對(duì)照"結(jié)構(gòu)中，將20mL經(jīng)攬 拌的巨核細(xì)胞懸液在不具有任何微射流裝置的閉環(huán)中在單管(Tygon，0.57mm I. D.，Saint- Gobain,France)中循環(huán)。為量化血小板生產(chǎn)，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)在開始時(shí)和120min灌 注后通過(guò)微射流裝置或通過(guò)對(duì)照系統(tǒng)收集的細(xì)胞懸液。認(rèn)為直徑為lym-4wii的雙重折射細(xì) 胞是血小板。圖13. C和13. d顯示分別從廝帶血巨核細(xì)胞和從外周血巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)的結(jié)果。圖13. C顯示在t = 0min時(shí)，在微射流裝置和在對(duì)照中回收的血小 板濃度沒(méi)有顯著差異(273 800和301 000個(gè)血小板/mL)。在t = 120min，濃度分別為486 000 ±69 400個(gè)血小板/mL和1 360 000± 159 000個(gè)血小板/mL，顯示顯著差異（Student t檢 驗(yàn)，成對(duì)樣品，P<〇. 005)。我們假定運(yùn)種濃度增加是通過(guò)微射流裝置的結(jié)果。圖13. d顯示了 類似的趨勢(shì)，但沒(méi)有對(duì)在微射流裝置和對(duì)照中回收的血小板濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[OW] 射流裝置中生產(chǎn)的血小板的表征
[0194]灌注兩小時(shí)后，裝置中循環(huán)的細(xì)胞懸液包含的血小板的含量大于在對(duì)照系統(tǒng)中循 環(huán)的細(xì)胞懸液。因此可W通過(guò)上述的不同方法分煉運(yùn)些血小板。在射流裝置中生產(chǎn)的血小 板顯示出與天然血小板（即從血分離的血小板或循環(huán)血小板)相當(dāng)?shù)娜舾商卣?。我們發(fā)現(xiàn)從 對(duì)照系統(tǒng)中獲得的樣品不具有運(yùn)些特征，所述對(duì)照系統(tǒng)由除了射流通道之外的所有元件組 成。如圖14.a所示，射流裝置生產(chǎn)的血小板中CD42b受體的表達(dá)明顯高于對(duì)照樣品中回收的 血小板樣顆粒(P<〇.05)。如使用血小板所觀察到的，在微射流裝置中生產(chǎn)的血小板中鑒定 了CD41+CD42b+元件的清晰群體，而在對(duì)照樣品中回收的血小板樣顆粒中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)（圖 14.b)。有趣的是，TRAP刺激后，血小板能夠經(jīng)歷類似于已知的表征血小板的活化特征，例如 增加其與特異于anb盼受體的活性構(gòu)象的PACl單克隆抗體的結(jié)合水平，而在對(duì)照樣品中回 收的血小板樣顆粒中沒(méi)有運(yùn)個(gè)發(fā)現(xiàn)（圖14.C和14.d)。圖15.a顯示表示血小板特征的微管蛋 白環(huán)存在于從射流裝置收集的樣品中，但不存在于從對(duì)照樣品收集的樣品中。一旦它們被 凝血酶活化，通過(guò)射流裝置生產(chǎn)的血小板顯示出線狀偽足、板狀偽足和肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維， 表明肌動(dòng)蛋白微絲如在從血分離的凝血酶激活的血小板中一樣重組。對(duì)照樣品缺少血小板 功能的兩種標(biāo)志。掃描電子顯微鏡（圖15.b)顯示了通過(guò)射流裝置生產(chǎn)的TRAP激活的血小板 中線狀偽足和板狀偽足的存在，而運(yùn)些形式在對(duì)照樣品中沒(méi)有檢測(cè)到。圖15 . C顯示從通過(guò) 射流裝置的通路中回收的樣品中的血小板聚集。再一次，在對(duì)照中回收的血小板中沒(méi)有運(yùn) 種大的聚集。因此該報(bào)告首次表明，從通過(guò)平行化微射流裝置的巨核細(xì)胞暴露中收集的樣 品中觀察到清楚的血小板特征，運(yùn)是在缺少微射流忍片的對(duì)照中回收的血小板樣顆粒所缺 少的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于從巨核細(xì)胞懸液巧)生產(chǎn)血小板的射流裝置（1)，包含： -生產(chǎn)室(3)，包含通過(guò)非多孔壁定界的至少一個(gè)通道(8)，和在一端的其中能引入包含 巨核細(xì)胞或其片段的懸液的至少一個(gè)進(jìn)口孔(9)，和在另一端的其中可W收集血小板的至 少一個(gè)出口孔(10); 其中所述通道(8)的壁的內(nèi)表面的至少一部分(11)構(gòu)造成具有多個(gè)障礙物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的射流裝置，其中所述通道(8)的內(nèi)表面的紋理部分（11)進(jìn)一步 涂有對(duì)巨核細(xì)胞具有結(jié)合親合力的配體，例如血管性血友病因子(VWF)、其功能性變體或包 含血管性血友病因子的片段的重組多膚、或纖維蛋白原或纖連蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的射流裝置，其中確定所述障礙物的密度、尺寸和形狀W便 將巨核細(xì)胞捕獲于通道內(nèi)表面的所述紋理部分上，從而血小板脫落。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述障礙物是桿(12)或束（15)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述通道(8)具有基本上正方形或長(zhǎng) 方形的截面。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述障礙物是具有半徑為r的基本上 圓形截面的桿（12)，且所述桿布置在至少一部分所述通道的內(nèi)表面上W形成具有六邊形的 周期性結(jié)構(gòu)的規(guī)則圖案，例如： (i) 桿的半徑r優(yōu)選為50nm-15mm，更優(yōu)選500nm-l .5mm; (ii) 兩個(gè)桿中屯、之間的最近距離p為至少等于10化m，優(yōu)選100nm-50mm，更優(yōu)選500nm- 10mm，甚至更優(yōu)選如m-lmm; (iii) 角度α，其是通過(guò)通道縱向（14)和六邊形布拉維晶格的晶格矢量之一定義的最低 角度，例如α為0-90°，優(yōu)選0-30% (iv) 任選所述桿的高度h為如0<h《H，其中Η是指通道截面中兩個(gè)相對(duì)的壁之間測(cè)量的 最小距離。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的射流裝置，其中所述通道的高度Η為扣m-lmm。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的射流裝置，其中所述生產(chǎn)室(3)包含至少一個(gè)或多個(gè) 在其內(nèi)表面上具有紋理部分的平行通道，例如2個(gè)通道-106個(gè)通道。9. 從巨核細(xì)胞或其片段生產(chǎn)血小板的離體方法，所述方法包含： -將包含巨核細(xì)胞或其片段的細(xì)胞懸液引入根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的射流裝置； -在生產(chǎn)室的通道中，使所述懸液在適于巨核細(xì)胞的延伸、破碎和血小板釋放的剪切率 下流動(dòng);和 -收集通道出口處的血小板。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中將流速固定在能夠?qū)⒕哂屑y理部分的通道中的所 述巨核細(xì)胞經(jīng)歷最小值到最大壁剪切率?&,χ的范圍內(nèi)，所述最大壁剪切率不超過(guò)30，〇〇〇s -1、優(yōu)選10，OOOs-i、更優(yōu)選8，OOOs-i和甚至更優(yōu)選5，OOOs-i。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述通道出口處收集的血小板進(jìn)一步包含裸 核和/或完整的巨核細(xì)胞，所述方法進(jìn)一步包含從所述懸液純化、富集或分離血小板的步 驟。12. 根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述懸液是通過(guò)W下步驟獲得的懸液： (i)提供巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞； (i i)擴(kuò)增所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞； (i i i)將所述擴(kuò)增的細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述巨核細(xì)胞祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞選自造血干細(xì) 胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述巨核細(xì)胞懸液在進(jìn)入生產(chǎn)室之 前均質(zhì)化和/或純化。15. 根據(jù)權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血小板在通道出口通過(guò)選自下組 的方法分煉:交叉流過(guò)濾、層流、介電電泳、光學(xué)力、磁力、聲學(xué)力或慣性力。16. 根據(jù)權(quán)利要求9-15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血小板是可W如循環(huán)血小板一樣 被激活的功能性血小板。
【文檔編號(hào)】B01L3/00GK105980057SQ201480062983
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年11月18日
【發(fā)明人】D·巴呂什, A·P·M·布林, A·馬涅, S·沙薩克, A·勒格夫, M·雷薩特
【申請(qǐng)人】普拉托德公司, 巴黎市工業(yè)物理化學(xué)學(xué)校