一種凝血因子Ⅷ親和層析樹脂的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凝血因子Ⅷ親和層析樹脂的制備方法。首先稱取保存的瓊脂糖凝膠進行洗滌處理，然后采用環(huán)氧氯丙烷活化法進行活化凝膠，得到活化凝膠；將得到的活化凝膠與間隔臂分子N?羥基琥珀酰亞胺進行手臂連接反應(yīng)，得到手臂連接的凝膠；將得到手臂連接的凝膠與肽配基進行配基偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物進行處理反應(yīng)得到凝血因子Ⅷ親和層析樹脂；所得樹脂進行洗滌處理，最后于凝膠體積3倍的20％乙醇溶液中在4℃條件下存放。將本發(fā)明產(chǎn)品層析樹脂用于從血漿中提取凝血因子Ⅷ，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子Ⅷ。
【專利說明】
一種凝血因子Vl親和層析樹脂的制備方法 一、
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種凝血因子珊親和層析樹脂的制備方 法。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 凝血因子VI能夠十分有效地對甲型血友病患者進行替代治療。隨著各種層析工藝 的開發(fā)與應(yīng)用，比活性可以達到lOIU/mg蛋白的中純凝血因子VI產(chǎn)品開始用于臨床治療。 1992年Baxter公司成功推出第一個基因重組的凝血因子VI產(chǎn)品。
[0003] 盡管基因重組類的凝血因子VI產(chǎn)品己經(jīng)有了較好的臨床應(yīng)用效果，但并不意味著 我們就要放棄血漿來源的凝血因子珊。一方面血漿來源的凝血因子Vi成本要低于重組類的 凝血因子珊，而且因為是從人血漿中提取的天然蛋白質(zhì)，基本沒有臨床副反應(yīng)的發(fā)生；另一 方面，血漿是一種寶貴的資源，除提取凝血因子VI外，還可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋 白、人凝血酶原復合物、纖維蛋白原等產(chǎn)品。而且如果以低溫離心冷沉淀為起始原料提取凝 血因子Vi的話，基本對上述產(chǎn)品的提取沒有影響，既提高了血漿的綜合利用效率和使用價 值，又分攤了單個血液產(chǎn)品的成本。但是，目前從血漿中提取凝血因子Vi過程中，分離技術(shù) 不甚理想。1959年，美國醫(yī)生Pool首先觀察到在血漿冷沉淀中含有大部分FVIII促凝血活 性，并于1965年與Shannon等開發(fā)了從密閉無菌系統(tǒng)中自單份血楽;分離制備冷沉淀制劑的 方法。但是冷沉淀制劑比活不確定、純度較低、含有顆粒物和血型抗體、可導致過敏反應(yīng)等。 20世紀70年代后開發(fā)了以冷沉淀為原料分離純化的制備方法，生產(chǎn)比活為0.2~lOIU/mg蛋 白的各種凍干FVIII制劑。到90年代，有兩種采用單克隆抗體親和層析制備的高純度FVIII 制劑面世，產(chǎn)品比活達700~3500IU/mg，幾乎不含其他雜蛋白，但容易造成單抗親和層析中 鼠類蛋白的污染。因此，本發(fā)明利用肽配基和靶蛋白之間類似抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的原理及 肽配基分子量小，即使脫落也容易在后續(xù)的純化中分離而不對產(chǎn)品造成污染的優(yōu)勢，制備 瓊脂糖凝膠肽配基親和層析柱純化FVIII。
[0004] 瓊脂糖是瓊脂中不帶電荷的中性成分，瓊脂糖為白色或微黃色粉末，高親水性，含 有大量羥基，有特殊的膠凝性質(zhì)，可制成多孔性凝膠，進而用于分離大分子物質(zhì)，己廣泛應(yīng) 用于醫(yī)藥食品、紡織化工等行業(yè)，由于其具有很好的生物相容性，又是優(yōu)良的生物分離介 質(zhì)。
[0005] 間隔臂又稱"手臂"，生物分子間的親和作用有立體特異性，配基結(jié)合位點通常位 于大分子內(nèi)部或表面的裂隙深處，若配基直接固定于載體表面則會由于空間位阻導致結(jié)合 常數(shù)下降。不溶性載體親和純化的空間位阻大，通常需要引入一定長度的"手臂"分子，以保 證親和配基有合適的空間取向和伸展靈活性，常用的間隔臂分子一般為小于十個碳原子且 分子兩端具有活性基團的小分子有機物，如二氨基亞胺、氨基己酸、二氨基己烷、琥珀酸、乙 二胺等。
[0006] 載體偶聯(lián)配基后剩余的活性基團仍可通過基團共價結(jié)合或電荷離子交換引起不 可逆性吸附。因此，應(yīng)對其進行掩蔽以降低載體的不可逆吸附，良好的封閉劑不僅能封閉載 體剩余活性基團和電荷，又不應(yīng)產(chǎn)生新的活性基團、電荷，如巰基乙醇、氨基乙酸、乙醇胺、 巰基乙胺、半胱氨酸、醋酸酐等。為防止不可逆性吸附，應(yīng)除去凝膠上的氨基及羧基基團，對 于氨基采用羧酸酐進行封閉；羧基掩蔽可采用乙醇胺進行封閉。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:為了克服現(xiàn)有從血漿中提取凝血因子VI產(chǎn)品分離技 術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法。將本發(fā)明產(chǎn)品層 析樹脂用于從血漿中提取凝血因子珊，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子珊。
[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0009] 本發(fā)明提供一種凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述制備方法包括以下步 驟：
[0010] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0011] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0012] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入 的體積量是濕瓊脂糖凝膠重量的3~5倍;然后在25~35°C(優(yōu)選為30°C)條件下恒溫震蕩 0.5~2h，恒溫震蕩時振動速度為100~200轉(zhuǎn)/min(優(yōu)選為150轉(zhuǎn)/min);
[0013]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3~5倍;然后在20 ~30°C(優(yōu)選為25°C)、180~220轉(zhuǎn)/分(優(yōu)選為190轉(zhuǎn)/分鐘)條件下恒溫振蕩30~40分鐘(優(yōu) 選為35分鐘）；震蕩后靜置30~40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0014] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50 %的二甲基亞礬或占沉淀凝膠體積 百分比50%的1，4_二氧六環(huán)為活化溶劑，并加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙 烷，在25~35°C(優(yōu)選為30°C)、180~220轉(zhuǎn)/分(優(yōu)選為190轉(zhuǎn)/分鐘）條件下恒溫振蕩反應(yīng)9 ~12h(優(yōu)選為IOh);反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗 滌至濾液為中性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0015] c、手臂連接：
[0016]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5~8(優(yōu) 選為摩爾比1:6)，所述碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55~65°C (優(yōu)選為60°C )、180~220轉(zhuǎn)/分(優(yōu)選為190轉(zhuǎn)/分鐘）條件下恒溫振蕩1~1.5h(優(yōu)選為1小 時），進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0017] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0018] 稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基及碳化二亞胺EDC，在25~35°C (優(yōu)選為30°C)、180~220轉(zhuǎn)/分(優(yōu)選為190轉(zhuǎn)/分 鐘)條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反應(yīng)1.5~2.5h(優(yōu)選為2小時）；
[0019] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25~35°C (優(yōu)選為30°C )、100~200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2~2.5h;震蕩后所得產(chǎn) 物裝入層析柱中將液體抽濾后，采用去離子水洗滌3~4次;每次加入去離子水的體積為濕 凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25~35°C(優(yōu)選為30 °C )、100~200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2~2.5h;所得產(chǎn)物即為凝血因子VI親和層析樹 脂；
[0020] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20%乙醇溶液沖洗3~4次，每次 加入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20 %乙醇 溶液中在4°C條件下存放。
[0021] 根據(jù)上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，步驟a中所述瓊脂糖凝膠 Sepharose CL-6B即瓊脂糖凝膠CL-6B由瓊脂糖凝膠微球或葡聚糖凝膠微球替代。
[0022] 根據(jù)上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，步驟d中所述肽配基為肽配基 EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一種。
[0023]根據(jù)上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常規(guī)多肽合成方法制備而成。
[0024]根據(jù)上述的凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，所述肽配基EYCPC、肽配基 GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
[0025] 本發(fā)明的積極有益效果：
[0026] UFVIII是甲型血友病患者需要終身反復使用的一類藥品。隨著技術(shù)的革新，各種 層析技術(shù)、層析載體和方法的應(yīng)用，制備高純度和高回收率的FVIII制品已成為可能，但是 國內(nèi)生產(chǎn)血液制品的企業(yè)僅有上海萊士、華蘭生物等少數(shù)幾家回收FVIII，造成了原料血漿 大量浪費。本發(fā)明有效避免了冷沉淀制劑回收FVIII比活不確定、純度較低、含有顆粒物和 血型抗體、可導致過敏反應(yīng)等問題、離子層析法對工藝條件要求較高及單克隆抗體親和層 析制備容易造成單抗親和層析中鼠類蛋白的污染問題，可豐富FVIII純化方法、有效提高原 料血漿的利用率。
[0027] 2、本發(fā)明技術(shù)方案選用了針對人凝血因子VI的特異、通用的肽配基，并通過試驗 證實所采用的肽配基偶聯(lián)物能快速、特異、高效的純化凝血因子珊。將本發(fā)明產(chǎn)品層析樹脂 用于從血漿中提取凝血因子珊，能夠快速、特異、高效的純化凝血因子珊。
[0028] 3、本發(fā)明采用肽配基理性設(shè)計篩選凝血因子VI特異性肽，開發(fā)了高效、廉價和易 制備的特異性親和配基。將該特異性親和配基偶聯(lián)在瓊脂糖微球載體上，可用于純化凝血 因子珊。偶聯(lián)方法采用環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠并鍵和間隔臂，用碳二亞胺鹽酸鹽偶聯(lián) 肽配基后采用化學試劑掩蔽殘余基團電荷。對于氨基采用羧酸酐進行封閉；羧基掩蔽可采 用乙醇胺進行封閉。 四、【具體實施方式】：
[0029] 以下結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0030] 以下實施例中采用的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC均 按照常規(guī)多肽合成方法制備而成。制備而成的肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基 RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
[0031] 實施例1:
[0032]本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0033] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0034] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0035] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的4倍;然后在30°C條件下恒溫震蕩1.5h，恒溫震蕩時振動速度為 150車專/min;
[0036]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在25 °C、 190轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩30分鐘;震蕩后靜置30min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0037]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在30°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) IOh;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0038] c、手臂連接：
[0039]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0040] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0041]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基EYCPC及碳化二亞胺EDC，在30°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反 應(yīng)2.Oh;
[0042] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.2h;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0043] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0044] 實施例2:
[0045] 本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0046] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0047] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0048] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.4M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的5倍;然后在28°C條件下恒溫震蕩1.8h，恒溫震蕩時振動速度為 120轉(zhuǎn)/min;
[0049] 震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的5倍;然后在30 °C、 180轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩40分鐘;震蕩后靜置35min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0050] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環(huán)為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在25°C、180轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) 12h;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0051 ] c、手臂連接：
[0052]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55°C、180轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1.5小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0053] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0054]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基GCVSGCLCWEYC及碳化二亞胺EDC，在25°C、180轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基 偶聯(lián)反應(yīng)2.5h;
[0055] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在25°C、120轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2.5h;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25°C、120轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.5h;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0056] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0057] 實施例3:
[0058]本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0059] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0060] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0061 ] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.2M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的3倍;然后在35°C條件下恒溫震蕩0.8h，恒溫震蕩時振動速度為 100轉(zhuǎn)/min;
[0062]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3倍;然后在20 °C、 220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0063]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環(huán)為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在35°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) 9h;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中性， 洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0064] c、手臂連接：
[0065]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:7,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在65°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1.2小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0066] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0067]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基RKWNCTDHEYC及碳化二亞胺EDC，在35 °C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基 偶聯(lián)反應(yīng)1.5h;
[0068] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在35°C、100轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2. Oh;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在35°C、100轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.Oh;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0069] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0070] 實施例4:
[0071] 本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0072] a、首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0073] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0074] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的3倍;然后在25°C條件下恒溫震蕩2.0h，恒溫震蕩時振動速度為 180轉(zhuǎn)/min;
[0075]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在22 °C、 220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置38min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0076]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在28°C、220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) I Ih;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0077] c、手臂連接：
[0078]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:8,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在58°C、220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0079] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0080] 稱取步驟C所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基EYCPC及碳化二亞胺EDC，在28°C、220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反 應(yīng)2.2h;
[0081] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在28°C、180轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在28 °C、180轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.Oh;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0082] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0083] 實施例5:
[0084]本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0085] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0086] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0087] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1 M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的5倍;然后在32°C條件下恒溫震蕩0.5h，恒溫震蕩時振動速度為 200轉(zhuǎn)/min;
[0088]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的4倍;然后在25 °C、 190轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩30分鐘;震蕩后靜置30min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0089]得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的二甲基亞礬為活化溶劑，并加 入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在30°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) IOh;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0090] c、手臂連接：
[0091]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0092] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0093]稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基(肽配基采用肽配基EYCPC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合時二者摩 爾比為1:1)及碳化二亞胺EDC，在30°C、190轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反應(yīng) 2.Oh；
[0094] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30 °C、150轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2.2h;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌3次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.2h;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0095] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗3次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
[0096] 實施例6:
[0097]本發(fā)明凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，該制備方法的詳細步驟如下：
[0098] a、首先稱取保存于冰箱中20 %乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊 脂糖凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂 糖凝膠；
[0099] b、環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠：
[0100] 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.3M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積 量是濕瓊脂糖凝膠重量的4倍;然后在30°C條件下恒溫震蕩1.2h，恒溫震蕩時振動速度為 120轉(zhuǎn)/min;
[0101]震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾(抽濾至無液滴滴下），然后 加入到lmol/L的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3倍;然后在20 °C、 200轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩35分鐘;震蕩后靜置40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠；
[0102] 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50%的1，4_二氧六環(huán)為活化溶劑，并 加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩反應(yīng) IOh;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾，抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中 性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠；
[0103] c、手臂連接：
[0104]將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度 為9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:6,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在60°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩 1.0小時，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠；
[0105] d、配基偶聯(lián)反應(yīng)：
[0106] 稱取步驟C所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾 數(shù)的肽配基(肽配基采用肽配基RKWNCTDHEYC和肽配基GCVSGCLCWEYC二者的混合物，混合時 二者摩爾比為1:1)及碳化二亞胺H)C，在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反 應(yīng)1.5h;
[0107] e、稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水 溶液，在30°C、120轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2. Oh;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液體抽濾 后，采用去離子水洗滌4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后加入濕凝膠 體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在30°C、150轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩反應(yīng)2.Oh;所得產(chǎn)物即 為凝血因子VI親和層析樹脂；
[0108] f、將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20 %乙醇溶液沖洗4次，每次加 入的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶 液中在4°C條件下存放。
【主權(quán)項】
1. 一種凝血因子VI親和層析樹脂的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步 驟： a、 首先稱取保存于冰箱中20%乙醇水溶液中的瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖 凝膠CL-6B，采用過量蒸餾水進行反復洗滌，除去瓊脂糖凝膠表面的乙醇，得到濕瓊脂糖凝 膠； b、 環(huán)氧氯丙烷活化法活化凝膠： 稱取步驟a所得濕瓊脂糖凝膠，置于0.1~0.5M的NaOH溶液中，所述NaOH溶液加入的體 積量是濕瓊脂糖凝膠重量的3~5倍;然后在25~35°C條件下恒溫震蕩0.5~2h，恒溫震蕩時 振動速度為100~200轉(zhuǎn)/min; 震蕩后取出凝膠進行充分水洗，水洗后進行真空抽濾，然后加入到lmol/L的NaOH溶液 中，所述NaOH溶液加入的體積量是凝膠重量的3~5倍;然后在20~30°C、180~220轉(zhuǎn)/分條 件下恒溫振蕩30~40分鐘;震蕩后靜置30~40min，將上清液棄去，得到沉淀凝膠； 得到沉淀凝膠后，以占沉淀凝膠體積百分比50 %的二甲基亞礬或占沉淀凝膠體積百分 比50%的1，4_二氧六環(huán)為活化溶劑，并加入占沉淀凝膠體積百分比20%的環(huán)氧氯丙烷，在 25~35°C、180~220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩反應(yīng)9~12h;反應(yīng)結(jié)束后對所得產(chǎn)物進行抽濾， 抽濾后所得產(chǎn)物采用蒸餾水反復洗滌至濾液為中性，洗滌后進行抽濾，得到活化凝膠； c、 手臂連接： 將步驟b所得活化凝膠與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS懸浮于2mol/L、酸堿度為 9.5的碳酸鹽緩沖溶液中，所述活化凝膠與間隔臂分子之間加入量的摩爾比為1:5~8,所述 碳酸鹽緩沖溶液的加入量為活化凝膠體積的3倍;然后在55~65°C、180~220轉(zhuǎn)/分條件下 恒溫振蕩1~1.5h，進行"手臂"分子鍵合反應(yīng);反應(yīng)后得到手臂連接的凝膠； d、 配基偶聯(lián)反應(yīng)： 稱取步驟c所得手臂連接的凝膠，加入與間隔臂分子N-羥基琥珀酰亞胺NHS等摩爾數(shù)的 肽配基及碳化二亞胺EDC，在25~35°C、180~220轉(zhuǎn)/分條件下恒溫振蕩進行配基偶聯(lián)反應(yīng) 1.5~2.5h; e、 稱取步驟d偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物，加入所得產(chǎn)物溶液體積1/10的lmol/L的醋酸水溶液， 在25~35°C、100~200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩2~2.5h;震蕩后所得產(chǎn)物裝入層析柱中將液 體抽濾后，采用去離子水洗滌3~4次;每次加入去離子水的體積為濕凝膠5倍體積;洗滌后 加入濕凝膠體積1/2的lmol/L的乙醇胺，接著在25~35°C、100~200轉(zhuǎn)/min條件下恒溫振蕩 反應(yīng)2~2.5h;所得產(chǎn)物即為凝血因子珊親和層析樹脂； f、 將步驟e所得產(chǎn)物采用去離子水沖洗，最后再用20%乙醇溶液沖洗3~4次，每次加入 的乙醇溶液體積為濕凝膠5倍體積;沖洗后將所得產(chǎn)物存放于凝膠體積3倍的20%乙醇溶液 中在4°C條件下存放。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于：步驟a中 所述瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B即瓊脂糖凝膠CL-6B由瓊脂糖凝膠微球或葡聚糖凝膠微 球替代。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于：步驟d中 所述肽配基為肽配基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC或肽配基RKWNCTDHEYC均按照常規(guī)多肽合成方法制備而成。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝血因子珊親和層析樹脂的制備方法，其特征在于:所述肽配 基EYCPC、肽配基GCVSGCLCWEYC和肽配基RKWNCTDHEYC的純度均彡95 %。
【文檔編號】B01J20/30GK106040196SQ201610493721
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】陳正躍, 詹合琴, 陳美光, 王璐, 靳玫, 高夏歡
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學院