專利名稱：納米顆粒介導的序列特異性核酸酶的投遞的制作方法
納米顆粒介導的序列特異性核酸酶的投遞對相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年4月7日提交的美國臨時申請61/167，389的權(quán)益。
背景技術(shù)：
可以利用納米顆粒的獨特性質(zhì)來將DNA投遞到細胞中。在所調(diào)查的納米顆粒(例如鎢、鋁、鎳等)中，金納米顆粒(GNP)趨向為投遞DNA的卓越候選物。低細胞毒性和容易用有生物學意義的多種配體官能化使金納米顆粒成為轉(zhuǎn)化的優(yōu)先選擇。金納米顆粒的大小范圍可以為1.2nm-600nm。通常使用的GNP合成對20-400nm的顆粒生成帶負電荷(例如檸檬酸鹽包被)的表面，而更小的I-IOnm范圍的GNP是帶正電荷的。質(zhì)粒DNA(其具有足以部分解開其堿基的柔性)可以暴露于金納米顆粒。在檸檬酸鹽官能化的GNP的情況中，質(zhì)粒DNA能部分解開。DNA主鏈上的負電荷足夠遠，從而使得堿基與金納米顆粒間的范德華引力引起質(zhì)粒DNA的附著，并包被金顆粒的表面。而在帶正電荷的GNP的情況中，靜電力和范德華力可以促成DNA的包被或附著。在金屬納米顆粒外，還已經(jīng)使用大小范圍在3-5nm內(nèi)的半導體納米顆粒(例如量子點)(“QD”)作為載體來將分子投遞到細胞中。DNA和蛋白質(zhì)可以包被或連接到用配體多官能化的 QD 表面(參見，例如 Patolsky，F(xiàn).等，J. Am. Chem. Soc. 125，13918 (2003))?？梢酝ㄟ^使用標準的生物綴合方案(參見例如Pinaud, F.，D. King, H. -P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126,6115(2004) ；Bruchez, Μ. .，Μ. Moronne, P. Gin, S. Weiss, Α. P. Alivisatos, Science 281，2013 (1998))來將經(jīng)羧酸或胺多官能化的QD與含有硫醇基團(參見例如 Dubertret B 等，Science 298,1759(2002) ；Akerman, Μ. E.，W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatia, Ε. Ruoslahti，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99，12617 (2002) ；Mitchell, G. P.， C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121，8122 (1999))或 N-羥基琥珀酰亞氨基 (NHS)酯基團的分子交聯(lián)。一種備選的方式是經(jīng)由與鏈霉親合素的綴合來多官能化QD。鏈霉親合素與生物素化的蛋白質(zhì)、寡聚物或抗體綴合(參見例如Dahan M.等，Science 302， 442(2003) ；Pinaud, F.，D. King, H. -P.Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126,6115(2004)； Dahan Μ.等，Science 302,442(2003) ；ffu. Χ. Y.等，Nature Biotechnol. 21,41(2003)； Jaiswal, J. K. , H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simon, Nature Biotechnol. 21,47(2003)；及 Mansson, Α.等，Biochern. Biophys. Res. Commun. 314, 529 (2004)。已經(jīng)使用納米顆粒來將質(zhì)粒DNA投遞到多種動物細胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在將經(jīng)DNA 包被的納米顆粒與沒有細胞壁的細胞一起溫育時，細胞吸收該納米顆粒，并開始表達DNA 上編碼的任何基因。在期望對通常具有細胞壁的細胞進行的納米顆粒投遞的情況中，在將所述顆粒添加至原生質(zhì)體前將細胞壁剝離(參見Torney，F(xiàn).等，Nature Nanotechnol. 2, 0007)。在植物細胞中，細胞壁充當投遞外源應用的分子的屏障。已經(jīng)采用許多侵入性方法，如基因槍(生物射彈)、顯微注射、電穿孔、和土壤桿菌(Agrobacterium)來實現(xiàn)將基因和小分子投遞至這些有壁的植物細胞中。將小分子和蛋白質(zhì)投遞穿過細胞壁并進入植物細胞中對于開發(fā)使得體外和體內(nèi)操作完整植物的細胞、組織、和器官能夠進行的技術(shù)會是有利的。
雖然在細菌、酵母、動物細胞、和苔蘚中得到完全建立，但是基因添加(將外來DNA 導入預定的基因組位置中)在高等植物中仍然是一項重大的挑戰(zhàn)。與隨機整合相比，位點特異性轉(zhuǎn)基因整合在植物細胞中以非常低的頻率發(fā)生，即使在引入的DNA含有大段與宿主 DNA同源的序列時(Halfter等1992 ；Lee等1990 ；Mia和Lam(1995)。例如，高效的基于土壤桿菌的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和除草劑選擇導致在稻中多至切10_4的基因靶向頻率。在植物中提高基因靶向效率的嘗試已經(jīng)包括使用負選擇標志，及使用遺傳工程化改造成展現(xiàn)出較高靶向頻率的植物。盡管有這些努力，但是經(jīng)由非同源過程的隨機DNA整合仍然是植物中基因靶向的主要障礙。鑒于對于靶向基因的添加在用于農(nóng)業(yè)和工業(yè)生物技術(shù)的作物的修飾中所設想的廣泛效用，迫切需要此問題的解決辦法。在這點上，已經(jīng)在宿主細胞中的特定基因組位置處誘導DNA雙鏈斷裂(DSB)(其刺激天然的細胞過程，即同源性指導的DSB修復)后觀察到一大批植物和動物模型系統(tǒng)中的基因靶向頻率的實質(zhì)性升高。已經(jīng)以此方式使用識別位點在植物基因組中罕見的天然存在的位點特異性內(nèi)切核酸酶來驅(qū)動轉(zhuǎn)基因整合至靶序列中，所述靶序列先前經(jīng)由隨機整合而轉(zhuǎn)移到所述植物基因組中。這些研究突出顯示了靶向性DSB誘導在植物細胞中刺激基因靶向的潛力，盡管在天然的基因座中引入DSB的挑戰(zhàn)仍然存在。在動物細胞中，經(jīng)由多種核苷酸序列特異性結(jié)合蛋白諸如亮氨酸拉鏈、鋅指蛋白等來實現(xiàn)靶向性基因組調(diào)控/操作的解決辦法。這些蛋白質(zhì)涉及作為轉(zhuǎn)錄因子的基因調(diào)節(jié)和/或可以用于在天然基因組位置處誘導DSB?？梢酝ㄟ^數(shù)類不同序列特異性核酸酶諸如大范圍核酸酶、亮氨酸拉鏈、鋅指蛋白等和新近開發(fā)的新型嵌合型式的這些蛋白質(zhì)來提供 DSB0描述得最好的核苷酸特異性結(jié)合蛋白之一是鋅指蛋白(ZFP)。C2H2鋅指在兩棲動物轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)，并且從此發(fā)現(xiàn)它是所有后生動物物種中最常見的DNA識別基序。 C2H2ZFP，即Zif268的X射線晶體結(jié)構(gòu)揭示了蛋白質(zhì)-DNA識別的顯著字節(jié)模式，其中每個鋅指規(guī)定串聯(lián)布置背景中的3或4bp亞位點，而且提示了使用此肽基序作為具有新特異性的DNA結(jié)合域的支架的可能性。從那時起，已經(jīng)在人工轉(zhuǎn)錄因子和其它功能性嵌合蛋白的背景中在許多不同實驗室成功使用了工程化改造成結(jié)合新序列的大量ZFP。已經(jīng)使用C2H2 鋅指蛋白域作為序列特異性DNA結(jié)合的支架(Pavelitch和Pabo 1991)，并通過融合鋅指蛋白域與源自IIS型限制性內(nèi)切核酸酶R)kl的非序列依賴性核酸酶域來生成ZFN(Kim等 1996)。已經(jīng)使用經(jīng)工程化改造的ZFN來驅(qū)動對經(jīng)轉(zhuǎn)化的(Moehle等2007)和原代的人細胞(Lombardo等2007)中的內(nèi)源基因組基因座的高效率靶向。在植物中使用ZFN上的最初嘗試已經(jīng)是有希望的(Lloyd等2005 Jright等2005 ； Maeder等2008)。將攜帶在誘導型啟動子控制下的ZFN基因及其相應的識別序列的構(gòu)建體穩(wěn)定整合到擬南芥(Arabidopsis)中，并且顯示了在誘導的后代幼苗中以平均值為7.9% 的頻率在識別位點處引入源自非同源末端連接的靶向突變(Lloyd等2005)。類似地，在從用設計為在SuRA基因座處切割的ZFN轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生的66株煙草植物中，3株展現(xiàn)出在靶位點處源自非同源末端連接修復的單堿基對缺失(Maeder等2008)。煙草細胞(其含有預先整合的、非功能性報告基因，該報告基因缺少正好在鋅指識別序列側(cè)翼的600bp) 在與含有相應的ZFN基因和供體DNA的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化時顯示同源性指導的報告基因修復的證據(jù)，所述供體DNA與包含缺少的600bp的預先整合的序列同源(Wright等2005)。最近， 使用基于酵母的測定法來鑒定能夠切割植物內(nèi)切殼多糖酶基因的ZFN(Cai等，2009)。含有
4ZFN和供體DNA構(gòu)建體兩者的Ti質(zhì)粒的土壤桿菌投遞精確地對ZFN切割位點產(chǎn)生多至10% 靶向的、同源性指導的轉(zhuǎn)基因整合，所述供體DNA構(gòu)建體包含pat除草劑抗性基因盒，其側(cè)翼有小段與內(nèi)切殼多糖酶基因座的同源性。重要的是，注意已經(jīng)在植物中證明了基于C3H1 設計的其它鋅指設計(Shukla等，2009，Cai等2009)。本發(fā)明涉及使用納米顆粒來將序列特異性核酸酶非侵入性投遞到具有細胞壁的植物細胞中的方法。發(fā)明概述以下實施方案與意為例示性和說明性，而非限制范圍的系統(tǒng)、工具和方法結(jié)合描述。依照本發(fā)明，提供了將序列特異性核酸酶導入植物細胞中的方法，該方法包括提供具有細胞壁的植物細胞；用至少一種序列特異性核酸酶包被納米顆粒；將所述具有細胞壁的植物細胞與經(jīng)序列特異性核酸酶包被的納米顆粒彼此接觸地放置；并允許經(jīng)序列特異性核酸酶包被的納米顆粒被攝取入所述包含細胞壁的植物細胞中。在上文所描述的例示性方面和實施方案外，其它方面和實施方案鑒于以下描述也會變得顯而易見。附圖簡述

圖1和圖2分別顯示了加有組氨酸標簽的(1)和未加組氨酸(2)標簽的ZFN-ILl FokI的大腸桿菌(E. coli)表達。圖3顯示了由IL-I鋅指-Fokl融合蛋白刺激的染色體間同源重組；其中A代表靶載體，而B代表具有重建的GFP基因的重組體。圖4顯示了質(zhì)粒pDAB1585的圖示。圖5顯示了在溫育細胞后2小時顯示GNP介導的YFP內(nèi)在化的BY2-E單細胞系； 小圖A(FITC)、B (羅丹明)、C(DIC)、D (A+B)、E (A+B+C)、F(倒置的反射圖像)如經(jīng)由熒光顯微術(shù)觀察到的YFP內(nèi)在化。圖6顯示了由大范圍核酸酶HceI蛋白刺激的染色體間同源重組；其中A代表靶載體，而B代表具有重建的GFP基因的重組體。圖7顯示了質(zhì)粒pDAB100375的圖示。發(fā)明詳述在以下的描述和表中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下定義回交?；亟豢梢允怯N人員將雜種后代往回與親本之一，例如第一代雜種F1與該 F1雜種的親本基因型之一重復雜交的過程。胚。胚可以是成熟的種子內(nèi)含有的小植物。納米顆粒。一種具有小于1納米級尺寸，通常小于IOOnm的微觀顆粒。適合于用于本發(fā)明的納米顆?？梢跃哂衛(wèi)nm-0. 4um的大小。量子點可以具有Inm-lOnm，優(yōu)選地2-4nm 的中值直徑。如本申請中所使用的納米顆粒包括但不限于金納米顆粒、鎢納米顆粒、經(jīng)金包被的納米顆粒、多孔納米顆粒、介孔納米顆粒(mesoporous nanoparticle)、硅納米顆粒 (silica nanoparticle)、聚合物納米顆粒、明膠納米顆粒、納米殼(nanoshell)、納米核心 (nanocore)、納米球(nanosphere)、納米棒(nanorod)、磁性納米顆粒、半導體納米顆粒、量子點、納米基質(zhì)(nanomatrix)、樹枝狀聚合物納米基質(zhì)(dendrimeric nanomatrix)及其組
口 O量子點。量子點是限制導帶電子、價帶空穴、或激子(導帶電子和價帶空穴的束縛對(bound pair))在所有三個空間方向上的運動的半導體納米顆粒。該限制可以由靜電勢 (由外部電極、摻雜、應變、雜質(zhì)產(chǎn)生)、不同半導體材料間界面的存在(例如在核心-殼納米晶體系統(tǒng)中)、存在半導體表面(例如半導體納米晶體)、或這些的組合所致。量子點可以具有離散的量子化能譜。相應的波函數(shù)在空間上位于量子點內(nèi)，但是延續(xù)經(jīng)過晶格的多個周期。量子點含有小的有限數(shù)目(1-100級)的導帶電子、價帶空穴、或激子(即，有限數(shù)目的基元電荷)。納米基質(zhì)包括但不限于樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物是球體或球狀(spheroid or globular)納米顆粒，其被工程化改造成攜帶封裝于其內(nèi)部空隙空間中或者附著于表面的分子。該分子是重復分枝的分子；分枝容許表面與散裝材料(bulk material)間的多價相互作用。樹枝狀聚合物的例子是球形陽離子聚酰胺胺(PAMAM)級聯(lián)聚合物。這些聚合物由表面上的伯胺和內(nèi)部中的叔胺組成。此類樹枝狀聚合物通過在溶劑分解溶劑中的熱處理來部分降解，由此導致較小的空間約束和較大的柔性。樹枝狀聚合物的高正電荷便于與DNA 的靜電相互作用，并且柔性結(jié)構(gòu)容許樹枝狀聚合物在與DNA結(jié)合時壓緊，而在自DNA釋放時膨脹。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化效率由于樹枝狀聚合物的正電荷和柔性結(jié)構(gòu)特性而升高。樹枝狀聚合物可以獲自 Qiager^Qiagen，Germantown，MD)，樹枝狀聚合物以 Superfect Transfection Reagent (產(chǎn)品目錄編號301305)對公眾出售。多官能化。除非另有規(guī)定，術(shù)語“多官能化”會用于描述單或多官能化的納米顆粒。單官能化的顆粒應當指其上已經(jīng)化學結(jié)合單一類型的官能團的官能化納米顆粒或納米顆粒的團聚。多官能化顆粒應當指其上已經(jīng)化學結(jié)合至少兩種，且可能三種或更多種不同類型的官能團的納米顆?；蚣{米顆粒的團聚。對除草劑的抗性。對一定劑量的除草劑的抗性指植物幸免于(即植物可以不被殺死)會抑制生長和/或?qū)е路强剐灾参锊荒艽婊畹幕钚猿煞值乃鰟┝康哪芰?。在一些情況中，耐受性植物可能暫時變黃或者在其它方面展現(xiàn)出一些除草劑誘導的損傷(例如，過度分蘗和/或生長抑制)，但是能恢復。穩(wěn)定化的。穩(wěn)定化的指從同一品種的近交植物的一個世代可再現(xiàn)地 (reproducibly)傳遞給下一世代的植物特征。攝取。攝取指顆粒或基質(zhì)，諸如納米顆粒，例如金、樹枝狀聚合物、或量子點穿過細胞壁或細胞膜的易位，其中所述易位不僅僅由于除攝取顆粒的細胞外的某物對顆粒賦予的動量而發(fā)生。僅由于對顆粒賦予的動量而引起顆粒穿過細胞壁或細胞膜的易位的裝置或方法的非限制性例子是生物射彈、基因槍、顯微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技術(shù)。核酸。術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”、和“寡核苷酸”可互換使用，指線性或環(huán)形構(gòu)象及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚合物、或其它核苷酸或核苷聚合物。出于本公開內(nèi)容的目的，這些術(shù)語不應解釋為限制聚合物的長度。術(shù)語可以涵蓋天然核苷酸的已知類似物，及在堿基、糖和/或磷酸酯模塊(例如硫代磷酸酯主鏈)中進行修飾的核苷酸。一般地，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對特異性；即A的類似物會與T進行堿基配對。
染色體。染色體指構(gòu)成細胞的整個或部分基因組的染色質(zhì)復合物。細胞的基因組經(jīng)常以其核型表征，所述核型是構(gòu)成細胞基因組的所有染色體的集合。細胞的基因組可以包含一條或多條染色體。“附加體”指不是細胞的染色體核型的一部分的復制型核酸、核蛋白復合物或其它包含核酸的結(jié)構(gòu)。附加體的例子包括質(zhì)粒和某些病毒基因組?！翱杉皡^(qū)” 指細胞染色質(zhì)中存在于核酸中的靶位點可以被識別該靶位點的外源分子結(jié)合的位點。不希望受限于任何具體的理論，認為可及區(qū)指不被包裝成核小體結(jié)構(gòu)的?？杉皡^(qū)的獨特結(jié)構(gòu)經(jīng)?？梢酝ㄟ^其對化學和酶探針，例如核酸酶的敏感度來檢測。“靶位點”或“靶序列”指定義為只要存在足以結(jié)合的條件結(jié)合分子便會與之結(jié)合的核酸的部分的核酸序列。例如，序列 5”-GAATTC-3’是Eco RI限制性內(nèi)切核酸酶的靶位點?；?。出于本公開內(nèi)容的目的，基因包括編碼基因產(chǎn)物的DNA區(qū)，及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的所有DNA區(qū)，不論此類調(diào)節(jié)序列是否鄰近編碼和/或轉(zhuǎn)錄的序列。因而，基因包括但不必限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列諸如核糖體結(jié)合位點和內(nèi)部核糖體進入位點、增強子、沉默基因、絕緣子(insulator)、邊界元件、復制起點、基質(zhì)附著位點和基因座控制區(qū)。表達。術(shù)語表達或基因表達可互換使用，且指將基因中含有的信息轉(zhuǎn)化成基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可以是基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu) RNA或任何其它類型的RNA)或通過mRNA翻譯生成的蛋白質(zhì)。基因產(chǎn)物還包括通過諸如加帽(capping)、聚腺苷酸化、甲基化、和編輯等過程修飾的RNA，和通過例如甲基化、乙?；?、 磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻?；?myristilation)、和糖基化修飾的蛋白質(zhì)?；虮磉_的“調(diào)控(modulation)”指基因活性的變化?；虻恼{(diào)控可以包括但不限于基因激活和基因阻抑。蛋白質(zhì)。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語還適用于其中的一個或多個氨基酸是相應的天然存在氨基酸的化學類似物或經(jīng)修飾的衍生物的氨基酸聚合物。序列。術(shù)語“序列”指任何長度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA，可以是線性、環(huán)形或分枝的，而且可以是單鏈或雙鏈。術(shù)語“供體序列”指插入基因組中的核苷酸序列。供體序列可以是任何長度的，例如長度為2-25，000個核苷酸(或其間或其上的任何整數(shù)值)， 優(yōu)選地長度為約100-5，000個核苷酸(或其間的任何整數(shù))，更優(yōu)選地長度為約200-2，500 個核苷酸。同源序列。同源序列指與第二序列共享一定程度的序列同一性，而且其序列可以與所述第二序列的序列相同的第一序列?！巴础⒉幌嗤男蛄小敝概c第二序列共享一定程度的序列同一性，但是其序列與第二序列的序列不同的第一序列。例如，包含突變體基因的野生型序列的多核苷酸與突變體基因的序列同源而不相同。在某些實施方案中，兩個序列間的同源性程度足以容許利用正常的細胞機制在其間進行同源重組。兩個同源不相同序列可以是任何長度，并且其非同源性程度可以小到單一核苷酸(例如，對于通過靶向同源重組來改正基因組點突變)或大到10千堿基或更多(10 or more kilobase)(例如，對于在染色體中的預定位點處插入基因)。包含同源不相同序列的兩個多核苷酸不需要是相同長度。例如，可以使用20-10，000個核苷酸或核苷酸對的外源多核苷酸(即供體多核苷酸)。重組。重組指兩個多核苷酸間的遺傳信息交換的過程。出于本公開內(nèi)容的目的，“同源重組(HR.)”指例如在細胞中修復雙鏈斷裂過程中發(fā)生的此類交換的特殊化形式。此過程需要核苷酸序列同源性，使用“供體”分子來進行對“靶”分子(即，經(jīng)歷雙鏈斷裂的分子)的模板修復，而且以不同的名稱稱為“非交換基因轉(zhuǎn)變”或“短道基因轉(zhuǎn)變”，這是因為它導致遺傳信息從供體轉(zhuǎn)移至靶物。不希望受限于任何具體的理論，此類轉(zhuǎn)移可以涉及斷裂的靶物與供體間形成的異源雙鏈體DNA的錯配改正，和/或“合成依賴性鏈退火”(SDSA) (其中使用供體來再合成會變?yōu)榘形锏囊徊糠值倪z傳信息)，和/或相關(guān)過程。此類特殊化的HR經(jīng)常導致靶分子的序列改變，使得供體多核苷酸的部分或整個序列被摻入靶多核苷酸中。切害I]。“切割”、“誘導雙鏈斷裂”和“切”可互換使用，指DNA分子的共價主鏈的斷裂。切割可以通過多種方法，包括但不限于對磷酸二酯鍵的酶或化學水解來啟動。單鏈切割和雙鏈切割都是有可能的，并且雙鏈切割可作為兩個獨特的單鏈切割事件的結(jié)果而發(fā)生。 DNA切割可以導致平端或交錯末端的生成。在某些實施方案中，使用融合多肽來進行靶向雙鏈DNA切割?！扒懈钣颉卑环N或多種擁有用于DNA切割的催化活性的多肽序列。切割域可以包含在單一多肽鏈中，或者切割活性可以產(chǎn)生自兩條(或更多條)多肽的聯(lián)合。“切割半域”指與第二多肽(相同或不同)一起形成具有切割活性(優(yōu)選地雙鏈切割活性)的復合物的多肽序列。雙鏈斷裂和雙鏈切割可互換使用。染色質(zhì)。染色質(zhì)指包含細胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細胞染色質(zhì)包含核酸(主要為 DNA)和蛋白質(zhì)，包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白質(zhì)。大多數(shù)真核細胞染色質(zhì)以核小體形式存在，其中核小體核心包含與包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩個的八聚物結(jié)合的約150 個堿基對的DNA;并且接頭DNA(隨生物體而具有可變長度)在核小體核心間延伸。組蛋白 HZ的分子一般與接頭DNA結(jié)合。出于本公開內(nèi)容的目的，術(shù)語“染色質(zhì)”想要涵蓋所有類型的細胞核蛋白(原核的和真核的兩者)。細胞染色質(zhì)包括染色體和附加體染色質(zhì)兩者。結(jié)合。結(jié)合指大分子間(例如蛋白質(zhì)與核酸間)的序列特異性、非共價相互作用。 不是結(jié)合相互作用的所有組分都需要是序列特異的(例如，與DNA主鏈中的磷酸酯殘基接觸)，只要總體上的相互作用是序列特異的即可。此類相互作用一般以ΙΟ—Μ—1或更低的解離常數(shù)(Kd)為特征?！坝H和力”指結(jié)合強度升高的結(jié)合親和力與較低的Kd關(guān)聯(lián)?？刹僮鬟B接。術(shù)語“可操作連接”和“可操作連接的”(或“可操作地連接”)就兩個或更多個組件(諸如序列元件)的并置而言可互換使用，其中將組件排列為使得兩個組件均正常發(fā)揮功能，而且容許至少一個組件可以介導對至少一個其它組件發(fā)揮的功能的可能性。舉例而言，若轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列響應一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的存在或缺失而控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，則轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列諸如啟動子與編碼序列可操作連接。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列一般與編碼序列可操作連接，但是不需要與其直接相鄰。例如，增強子是與編碼序列可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，即使它們不是連續(xù)的。就融合多肽而言，術(shù)語“可操作連接的”可以指每個組件在與另一組件的連接中與其沒有如此連接時執(zhí)行相同的功能的事實。例如，就其中 ZFP DNA結(jié)合域與切割域融合的融合多肽而言，若在融合多肽中，ZFP DNA結(jié)合域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，同時切割域能夠切割靶位點附近的DNA，則ZFP DNA結(jié)合域和切割域為可操作連接。序列特異性核酸酶(SSN)包括數(shù)類雙功能性蛋白質(zhì)，其能夠識別特定且獨特的核苷酸序列(天然的或定制的識別位點)，諸如但不限于大范圍核酸酶、亮氨酸拉鏈和鋅指蛋白。大范圍核酸酶代表在存在二價金屬離子(Ca、Mn、Mg)的情況中能以高特異性切割雙鏈DNA的酶家族。然而，它們在其識別特性和結(jié)構(gòu)上與限制性內(nèi)切核酸酶不同(Belfort， Μ. Roberts RJ. Homing endonucleases :keeping the house in order ；Nucleic Acid Research 1997，25 :3379-3388)。具體地，在限制酶識別短的核酸序列(3_8bp)的情況中， 大范圍核酸酶識別更長的序列(12_40bp)，其對DSB靶向提供改善的特異性。(Mueller， JE, Bryk, Μ. Loizos,N.Belfort Μ. Homing endonucleases. In Nucleases第 2 版 Linn, SM, Lloyd, RS,Roberts,RJ( He) Cold Spring Harbor Laboratory Press :1993111-143.)。亮氨酸拉鏈是在作為與基因表達有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子的許多真核調(diào)節(jié)蛋白中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中涉及的一類蛋白質(zhì)。亮氨酸拉鏈指橫跨數(shù)個界(包括動物、植物、酵母等) 的這些轉(zhuǎn)錄因子中共享的共同的結(jié)構(gòu)基序。亮氨酸拉鏈是由兩個多肽(同二聚體或異二聚體)形成的，所述多肽以如下方式結(jié)合特定的DNA序列，其中亮氨酸殘基在α-螺旋中均勻地隔開，使得兩個多肽的亮氨酸殘基在螺旋的同一面上結(jié)束。鋅指DNA結(jié)合蛋白。鋅指DNA結(jié)合蛋白ZFP(或結(jié)合域)是經(jīng)由一個或多個鋅指以序列特異性方式結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或較大蛋白質(zhì)內(nèi)的域，所述鋅指是結(jié)合域內(nèi)經(jīng)由鋅離子配位來使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化的氨基酸序列的區(qū)域。術(shù)語鋅指DNA結(jié)合蛋白經(jīng)?？s寫為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結(jié)合域可以“工程化改造”為結(jié)合預定的核苷酸序列。用于工程化改造鋅指蛋白的方法的非限制性例子是設計和選擇。設計的鋅指蛋白是自然界中不存在的蛋白質(zhì)，其設計/組成主要源自理性標準。用于設計的理性標準包括應用取代規(guī)則和計算機化算法，以供處理儲存現(xiàn)有ZFP設計和結(jié)合數(shù)據(jù)信息的數(shù)據(jù)庫中的信息。參見例如美國專利 6，140，081 ；6，453，242 ；6，534，261 ；及 6，785，613 ；還可參見 WO 98153058 ；WO 98153059 ； WO 98153060 ；WO 021016536 和 WO 031016496 ；及美國專利 6，746，838 ;6，866，997 ；和 7，030，215?；蚪M序列?；蚪M序列包括那些存在于染色體、附加體、細胞器基因組(例如線粒體、葉綠體)、人工染色體和存在于細胞中的任何其它類型的核酸，諸如例如擴增的序列雙微小染色體和內(nèi)源或感染細菌和病毒的基因組?；蚪M序列可以是正常的(即野生型) 或突變體；突變體序列可以包含例如插入、缺失、易位、25重排、和/或點突變?；蚪M序列還可以包含許多不同等位基因之一。植物細胞。植物細胞包括但不限于單子葉(單子葉植物)或雙子葉(雙子葉植物)植物或藻類或苔蘚的細胞。單子葉植物的非限制性例子包括谷類植物，諸如玉米、稻、 大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、sugarmaye、菠蘿、洋蔥、香蕉、和椰子。雙子葉植物的非限制性例子包括煙草、番茄、向日葵、棉花、甜菜、馬鈴薯、萵苣、甜瓜、大豆、may0la(油菜籽)、和苜蓿。植物細胞可以來自植物的任何部分和/或來自植物發(fā)育的任何階段。感興趣的區(qū)域。感興趣的區(qū)域是期望結(jié)合外源分子的核酸聚合物的任何區(qū)域，諸如例如基因或基因內(nèi)或與基因鄰近的非編碼序列。結(jié)合可以是為了靶向DNA切割和/或靶向重組。感興趣的區(qū)域可以存在于例如染色體、附加體、細胞器基因組(例如線粒體、葉綠體)、質(zhì)粒、感染性病毒基因組、或任何其它核苷酸序列中。感興趣的區(qū)域可以在基因的編碼區(qū)內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)諸如例如前導序列、尾隨序列或內(nèi)含子內(nèi)，或者在編碼區(qū)上游或下游的非轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)。感興趣的區(qū)域的長度可以小到單一核苷酸對或達25，000個核苷酸對，或任何整數(shù)數(shù)值的核苷酸對。
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依照本發(fā)明的實施方案，提供了將序列特異性核酸酶導入包含細胞壁的植物細胞中的方法，該方法包括將經(jīng)序列特異性核酸酶包被的納米顆粒與所述植物細胞接觸地放置，并容許穿過植物細胞壁的攝取。在本發(fā)明的特定的方面，納米顆?？梢允侨魏渭{米顆粒，并且可以可逆地或不可逆地含有、包被有、或以其它方式結(jié)合有和/或攜帶鋅指核酸酶、和/或大范圍核酸酶。在某些實施方案中，可以在與具有細胞壁的植物細胞接觸前或與將納米顆粒導入具有細胞壁的植物細胞同時將鋅指核酸酶導入納米顆粒?？梢栽诒景l(fā)明的實施方案中使用的納米顆粒的例子包括但不限于金、量子點、經(jīng)金包被的納米顆粒、多孔納米顆粒、介孔納米顆粒、硅納米顆粒、聚合物納米顆粒、鎢納米顆粒、明膠納米顆粒、納米殼、 納米核心、納米球、納米棒、磁性納米顆粒、半導體納米顆粒、量子點、納米基質(zhì)、樹枝狀聚合物和/或其組合。依照本發(fā)明的實施方案，具有細胞壁的植物細胞可以是包含完整的且全部的細胞壁的任何植物細胞。本發(fā)明的實施方案可以包括來自任何組織或找到它們的任何地方(包括但不限于在胚、分生組織細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢、莖、懸浮培養(yǎng)物、和組織培養(yǎng)物中)的包含細胞壁的細胞。在本發(fā)明的具體實施方案中，SSN可以是可以依照本發(fā)明投遞到植物細胞的任何 ZFN。例如，ZFN可以包括包含切割域(或切割半域)和鋅指結(jié)合域的融合蛋白、編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸以及多肽和編碼多肽的多核苷酸的組合。鋅指結(jié)合域可以包含一個或多個鋅指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多個鋅指)，而且可以工程化改造成結(jié)合感興趣的任何區(qū)域。如此，通過鑒定期望切割或重組的感興趣的靶區(qū)域，可以依照本文中所公開的方法來構(gòu)建一種或多種融合蛋白，其包含切割域(或切割半域)和工程化改造成識別所述感興趣的區(qū)域中的靶序列的鋅指域。細胞中存在這種融合蛋白(或多種蛋白)會導致融合蛋白對其結(jié)合位點的結(jié)合和所述感興趣的區(qū)域內(nèi)或附近的切割。此外，若與感興趣的區(qū)域同源的外源多核苷酸也存在于這種細胞中，則在雙鏈斷裂核苷酸序列與外源多核苷酸間以高比率發(fā)生同源重組。在具體的實施方案中，對細胞提供至少一種SSN可以包括通過納米顆粒對細胞直接提供一個或多個拷貝的SSN蛋白。在其它實施方案中，對細胞提供至少一種SSN可以包括給細胞提供包含編碼該SSN的核酸的納米顆粒，并允許細胞從編碼該SSN的核酸生成該 SSN0在其它實施方案中，對細胞提供的一種或多種SSN能夠在一個或多個感興趣的區(qū)域處或附近單獨地或與其它SSN —齊進行切割。在具體的實施方案中，一個或多個感興趣的區(qū)域可以在高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的編碼序列內(nèi)。在一些實施方案中，一個或多個感興趣的區(qū)域可以在包含編碼高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的基因座附近和/或之內(nèi)。在其它實施方案中，核苷酸序列可以是在單一感興趣的區(qū)域處的雙鏈斷裂。在其它實施方案中，核苷酸序列可以是在兩個或更多個感興趣的區(qū)域處的雙鏈斷裂。在具體的實施方案中，一個或多個雙鏈斷裂可以位于高度、 更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的編碼序列中。在其它實施方案中，一個或多個雙鏈斷裂可以在包含編碼高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的基因座附近和/或之內(nèi)。在生成至少兩個雙鏈斷裂的具體的實施方案中，修復雙鏈斷裂可以包括除去雙鏈斷裂之間的物質(zhì)，并再連接核苷酸序列的末端，從而切除雙鏈斷裂之間的序列。在多個實施方案中，切除的序列可以包括(不限于)編碼整個或部分編碼高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的序列。在其它實施方案中，切除的序列可以包括(不限于)實現(xiàn)高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的表達的調(diào)節(jié)序列。在此類實施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的表達相對于切割前的表達水平是降低的。在生成至少兩個雙鏈斷裂的備選實施方案中，修復雙鏈斷裂可以包括除去雙鏈斷裂之間的物質(zhì)，將其用供體序列替換，從而用供體序列替換雙鏈斷裂之間的序列。在其它實施方案中，除去的序列可以包括(不限于)編碼整個或部分編碼高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的序列。在其它實施方案中，除去的序列包括(不限于) 實現(xiàn)高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的表達的調(diào)節(jié)序列。在此類實施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的表達相對于切割前的表達水平是降低的。在生成一個雙鏈斷裂的實施方案中，修復雙鏈斷裂可以包括將供體序列插入該雙鏈斷裂中或與其交叉地插入(insert a donor sequence into or across the double strand break) 0在某些實施方案中，可以將供體序列插入高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的編碼序列中。在多個實施方案中，此類序列的插入可以經(jīng)由(作為非限制性例子)存在符合讀碼框的終止密碼子而破壞高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在其它實施方案中，供體可以(不限于)破壞實現(xiàn)高度、更高度、 非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)序列的功能。在多個實施方案中，高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的表達相對于切割前的表達水平是降低的。在又一些實施方案中，供體序列可以編碼感興趣的蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，從供體序列表達感興趣的蛋白質(zhì)可以受存在于供體序列中的調(diào)節(jié)序列和/或存在于供體序列插入其中的序列中的調(diào)節(jié)序列控制、調(diào)節(jié)、或與存在于供體序列中的調(diào)節(jié)序列和/或存在于供體序列插入其中的序列中的調(diào)節(jié)序列可操作連接。在其它實施方案中，可以與供體序列分開或與供體序列一起向細胞提供編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸序列。在一些實施方案中，供體序列可以包含在與編碼感興趣的蛋白質(zhì)的序列相同的核酸分子內(nèi)。在其它實施方案中，作為非限制性例子，編碼高度、更高度、非常高度、或最高度表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以位于基因組、質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、附加體、或細胞中的其它核苷酸結(jié)構(gòu)中。除非另有指明，方法的實施及本文中所公開的組合物的制備和使用采用分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計算機化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA和相關(guān)領(lǐng)域中常規(guī)的技術(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。這些技術(shù)在文獻中有全面解釋。參見例如Sambrook等 MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 和第三版，2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons，New York，1987 和定期更新；叢書 METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press, San Diego, 1998 ；METHODS IN ENZYM0L0GY,第 304 卷，“Chromatin”(P. M. Wassarman 和 A. P. Wolfe 編)，Academic Press, San Diego，1999 ；及 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第119 卷，“Chromatin Protocols" (P. B. Becker 編)Humana Press, Totowa, 1999。對植物細胞的核酸投遞如上文所述的，可以通過多種常規(guī)的技術(shù)來將DNA構(gòu)建體導入期望的植物宿主 (例如導入其基因組中)。關(guān)于此類技術(shù)的綜述，參見例如W^eissbach &ffeissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988,Academic Press，N. Y.)部分 VIII，第 421 頁-第 463 頁；及 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed. ), Blackie, London,第
7章-第9章。例如，可以使用諸如對植物細胞原生質(zhì)體的電穿孔和顯微注射等技術(shù)來將DNA 構(gòu)建體直接導入植物細胞的基因組DNA中，或者可以使用生物射彈法，諸如DNA顆粒轟擊(參見例如Klein等(1987)Nature 327 :70-73)來將DNA構(gòu)建體直接導入植物組織中?；蛘?，可以將DNA構(gòu)建體與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)組合，并導入常規(guī)的根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)宿主載體中。根癌土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)(包括二元載體的解除(disarming)和使用)在科學文獻中充分描述。參見例如Horsch等(1984) Science 233 :496_498，及 Fraley 等(1983) Proc. Nat. Acad. ki. USA 80 :4803。另外，可以使用非土壤桿菌細菌或病毒諸如根瘤菌屬菌種(lihizobium sp.) NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium melioti)、百脈根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、馬鈴薯病毒X、花椰菜花葉病毒和木薯葉脈花葉病毒和/或煙草花葉病毒來實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，參見例如 Chung 等(2006)Trends Plant Sci.ll(l) :1_4。此外，可以使用與納米顆?；蛐蛄刑禺愋院怂崦溉诤系募毎┩鸽膩韺⒑塑账峄虻鞍踪|(zhì)序列投遞到植物細胞中?？梢詫⒓毎┩鸽谋磉_、分離、并用納米顆粒、核苷酸序列、 或蛋白質(zhì)功能化以在植物細胞內(nèi)投遞。能夠?qū)⒎肿庸δ苄酝哆f到植物細胞中的細胞穿透肽是本領(lǐng)域中已知的，并且可以包括但不限于TAT (Chugh等，Q008)FEBS 275 =2403-2414)； R9(Chang 等(2005)Plant Cell Physiol 46(3) :482-488 和 Chen 等(2007)FEBS Lett 581(9) :1891-1897) ；MPG(Ziegler 等(2008)Adv Drug Deliver Rev 6 :580-597和 Morris 等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :2730-2736) ；PEPl(Henriques 等(2005)Biochemistry US 44(3) :10189-10198)；和植物來源的細胞穿透肽。在使用二元T DNA 載體(Bevan (1984)Nuc. Acid Res. 12 :87118721)或共培養(yǎng)規(guī)程(Horsch等(1985) Science 227:1229-1231)通過細菌感染細胞時，根癌土壤桿菌宿主的毒力功能會指導構(gòu)建體和相鄰的標志物插入植物細胞DNA中。一般地，使用土壤桿菌轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來工程化改造雙子葉植物(Bevan等(198 Ann. Rev. Genet 16 :357-384 ；Rogers等 (1986) Methods Enzymo 1. 118 :627-641)。也可以使用土壤桿菌轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來將DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移到單子葉植物和植物細胞。參見美國專利No. 5，591，616 ；Hemalsteen等(1984)EMBO J3 30393041 ；Hooykass Van Slogteren 等(1984)Nature 311 :763-764 ;Grimsley 等(1987) Nature 325 :1677-179 ；Boulton 等(1989)Plant Mol. Biol. 12 :3140.；及 Gould 等(1991) Plant Physiol. 95 :426-434。備選的基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)染方法包括但不限于經(jīng)由鈣、聚乙二醇(PEG)或電穿孔介導的對裸DNA的攝取的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染(參見I^aszkowski等(1984)EMB0 J 3:2717-2722， Potrykus 等(1985)Molec. Gen. Genet. 199 :169-177 ；From 等(1985)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 :5824-5828 ；及 Shimamoto (1989) Nature 338 :274-276)和植物組織的電穿孔(D，Halluin等(1992) Plant Cell 4 1495-1505)。用于植物細胞轉(zhuǎn)染的其它方法包括顯微注射、碳化硅介導的DNA攝取(Ka印pier等(1990)植物細胞Importer 9 :415-418)、和微粒轟擊(參見 Klein 等(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 :4305-4309 ；及 Gordon Kim 等 (1990)Plant Cell 2:603—618)?？梢允褂霉_的方法和組合物來將外源序列插入植物細胞基因組中的預定位置中。由于導入植物基因組中的轉(zhuǎn)基因的表達嚴重依賴于其整合位點，所以這是有用的。因而，可以通過靶向重組將編碼例如營養(yǎng)物、抗生素或治療性分子的基因插入植物基因組中對其表達有利的區(qū)域中。可以培養(yǎng)通過任何上述轉(zhuǎn)染技術(shù)生成的經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物細胞以再生擁有該轉(zhuǎn)染的基因型及因此擁有期望的表型的整株植物。此類再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中操作某些植物激素，通常依賴于已經(jīng)與期望的核苷酸序列一起導入的殺生物劑和/或除草劑標志物。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生記載于Evans等，“ftOtoplasts Isolation and Culture” 于 Handbook of Plant Cell Culture，第 124 頁-第 176 頁，Macmillian Publishing Company, New York,1983 ； 及 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts，第21頁-第73頁，CRC Press, Boca Raton，1985。再生也可以從植物愈傷組織、外植體、器官、花粉、胚或它們的一部分獲得。此類再生技術(shù)概括地記載于Klee等 (1987)Ann. Rev. of Plant Phys. 38 :467-486?？梢允褂脤胫参锛毎械暮怂醽韺旧先魏沃参镔x予期望的性狀。可以使用本公開內(nèi)容的核酸構(gòu)建體和上文所提及的多種轉(zhuǎn)染方法來在本文中所描述的期望的生理學和農(nóng)藝學特征方面工程化改造極其多種植物和植物細胞系統(tǒng)。在優(yōu)選的實施方案中，供工程化改造用的靶植物和植物細胞包括但不限于那些單子葉和雙子葉植物，諸如作物，包括谷類作物(例如小麥、玉米、稻、黍、大麥)、果實作物(例如番茄、蘋果、梨、草莓、 柑橘(orange))、草料作物(例如苜蓿)、根菜作物(例如胡蘿卜、馬鈴薯、甜菜、薯蕷)、葉菜作物(例如萵苣、菠菜、甘藍)；有花植物(例如矮牽牛、薔薇/玫瑰(rose)、菊)、針葉樹(conifer)和松樹(例如松木冷杉(pine fir)、云杉)；植生治理(phytoremediation) 中使用的植物(例如重金屬積累植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽、大豆、棕櫚)和出于實驗目的使用的植物(例如擬南芥)。如此，所公開的方法和組合物在一大批植物的范圍內(nèi)有用，包括但不限于來自下述屬的種天門冬屬(Asparagus)、燕麥屬(Avena)、 蕓苔屬(Brassica)、柑橘屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、南瓜屬(Cucurbita)、古月蘿卜屬(Daucus)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、大麥屬(Hordeum)、萵苣屬(Lactuca)、番屬(Lycopersicon)、蘋果屬(Malus)、木薯屬 (Manihot)、煙草屬(Nicotiana)、稻屬(Oryza)、鱷梨屬(Persea)、豌豆屬(Pisum)、梨屬 (Pyrus)、李屬(Prunus)、蘿卜屬(Raphanus)、黑麥屬(Secale)、爺屬(Solanurn)、高粱屬 (Sorghum)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、豇豆屬(Vigna)、和玉蜀黍?qū)?Zea)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可，在將表達盒在轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定摻入并確認為可操作的后，可以通過有性雜交來將其導入其它植物中。根據(jù)要雜交的物種，可以使用多種標準育種技術(shù)之任一種。可以通過在由存在于轉(zhuǎn)染DNA上的標志物基因編碼的性狀方面選擇或篩選經(jīng)工程化改造的植物材料來鑒定并分離經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物細胞、愈傷組織、組織或植物。例如，可以通過將經(jīng)工程化改造的植物材料在含有抑制量的抗生素或除草劑(轉(zhuǎn)染基因構(gòu)建體賦予針對其的抗性)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來進行選擇。此外，也可以通過篩選可存在于重組核酸構(gòu)建體上的任何可見標志物基因(例如β -葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶、B或Cl基因)的活性來鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物和植物細胞。此類選擇和篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。也可以使用物理和生物化學方法來鑒定含有插入的基因構(gòu)建體的植物或植物細胞轉(zhuǎn)染子。這些方法包括但不限于l)S0Uthern分析或PCR擴增，其用于檢測并測定重組 DNA插入物的結(jié)構(gòu)；2) Northern印跡、引物延伸或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴增，其用于檢測并檢查基因構(gòu)建體的RNA轉(zhuǎn)錄物；幻酶測定法，其用于檢測酶或核酶活性，其中此類基因產(chǎn)物是由基因構(gòu)建體編碼的；4)蛋白質(zhì)凝膠電泳、Western印跡技術(shù)、免疫沉淀、或酶聯(lián)免疫測定法， 其中基因構(gòu)建體產(chǎn)物是蛋白質(zhì)力)單核苷酸多態(tài)性檢測技術(shù)、侵入者測定法、焦磷酸測序 (pyrosequencing) ,Solexa測序。也可使用其它技術(shù)諸如原位雜交、酶染色、和免疫染色來檢測在特定植物器官和組織中的重組構(gòu)建體的存在或表達。進行所有這些測定法的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以通過例如自感興趣的組織分離的RNA (例如mRNA)的Northern印跡來觀察使用本文中所公開的方法進行基因操作的效果。通常，若mRNA的量已經(jīng)升高，則可以假設相應的內(nèi)源基因正在以比之前更高的速率表達?？梢允褂脺y量基因活性的其它方法。根據(jù)所使用的底物和檢測反應產(chǎn)物或副產(chǎn)物的升高或降低的方法，可以使用不同類型的酶測定法。另外，所表達的蛋白質(zhì)的水平可以用免疫化學法，即ELISA、RIA、EIA和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它基于抗體的測定法，諸如通過電泳檢測測定法(通過染色或Western印跡)來測量。轉(zhuǎn)基因可以在植物的一些組織中或在一些發(fā)育階段選擇性表達，或者轉(zhuǎn)基因可以在基本上所有植物組織中，基本上在其整個生活周期期間表達。然而，任何組合表達模式也是可適用的。本公開內(nèi)容還涵蓋上文所描述的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子具有轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體。本公開內(nèi)容進一步涵蓋上文所描述的轉(zhuǎn)基因植物的后代、克隆、細胞系或細胞，其中所述后代、克隆、細胞系或細胞具有轉(zhuǎn)基因或基因構(gòu)建體。應用可以使用所公開的用于靶向切割的方法和組合物來誘導基因組序列中的突變。也可以使用靶向切割來創(chuàng)建基因敲除或基因敲低(例如功能基因組學或靶物確認)，并且便于將序列靶向插入基因組中(即序列敲入)。插入可以是依靠染色體序列的替換，其經(jīng)由 (作為非限制性例子)同源重組來或通過靶向整合，其中在預定靶位點處插入新序列(即不存在于感興趣的區(qū)域中的序列)。在某些例子中，此類新序列側(cè)翼可以有與染色體中的感興趣區(qū)域同源的序列。也可以使用相同的方法來用突變體序列替換野生型序列或者將一種等位基因轉(zhuǎn)變成不同等位基因?？梢允褂脤Ω腥拘曰蛘闲灾参锊≡w的靶向切割來治療植物宿主中的病原性感染，例如其通過切割病原體的基因組，使得其病原性得到降低或消除來實現(xiàn)。另外，可以使用對編碼植物病毒受體的基因的靶向切割來阻斷此類受體的表達，由此預防植物中的病毒感染和/或病毒擴散。例示性的植物病原體包括但不限于植物病毒，諸如Alfarnoviruses、α潛 Hi _ _ M (Alphacryptoviruses)、木干 # DNA _ _ M (Badnaviruses)、 β 替 Hi _ _屬(Betaciyptoviruses)、Bigeminiviruses、雀麥花葉病毒屬(Bromoviruses)、 大麥黃化花葉病毒屬(Bymoviruses)、毛狀病毒屬(Capilloviruses)、香石竹潛伏病毒屬(Carlaviruses)、香石竹斑駁病毒屬(Carrnoviruses)、花椰菜花葉病毒屬 (Caulimoviruses)、長線形病毒屬(Closteroviruses)、豆工豆花葉病毒屬(Comoviruses)、 黃瓜花葉病毒屬(Cucurnoviruses)、質(zhì)型彈狀病毒屬(Cytorhabdoviruses)、香石竹病毒屬(Dianthoviruses)、碗豆耳突花葉病毒屬(Enamoviruses)、蠶豆萎蔫病毒屬 (Fabaviruses)、斐濟病毒屬(Fi jiviruses)、真菌傳桿狀病毒屬(Furoviruses)、大麥病毒屬(Hordeiviruses)、Hybrigeminiviruses> 懸鉤子病毒屬(Idaeoviruses)、等徑易變病毒屬(Ilawiruses)、甘薯病毒屬(Ipomoviruses)、大麥黃矮病毒屬(Luteoviruses)、 玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomoviruses)、橙?；ㄈ~病毒屬(Macluraviruses)、玉米雷亞多非納病毒屬(Mara viruses)、單雙生病毒屬(Monogeminiviruses)、矮縮病毒屬(Nanaviruses)、壞死病毒屬(Necroviruses)、線蟲傳多角體病毒屬(Nepoviruses) > 核型彈狀病毒屬(Nucleorhabdoviruses)、水稻病毒屬(Oryzaviruses)、甜瓜病毒屬 (Ourmiaviruses)、植物呼腸病毒屬(Phytoreoviruses)、馬鈴薯 X病毒屬(Potexviruses)、 馬鈴薯Y病毒屬(Potyviruses)、黑麥草花葉病毒屬(Rymoviruses)、衛(wèi)星WAS、衛(wèi)星病毒屬(satelliviruses)、歐防風黃點病毒屬Gequiviruses)、南方菜豆花葉病毒屬(Sobemoviruses)、水稻條紋葉枯病毒屬(Tenuiviruses)、煙草花葉病毒屬 (Tobamoviruses)、煙草脆裂病毒屬(Tobraviruses)、番叢矮病毒屬(Tornbusviruses)、 番茄斑萎病毒屬(Tospoviruses)、蘋果褪綠葉斑病毒屬(Trichoviruses)、蕪菁黃花葉病毒屬(Tymoviruses)、傘形植物病毒屬(Umbraviruses)、巨脈病毒屬(Varicosaviruses) 和水稻矮化病毒屬(Waikaviruses)；真菌病原體諸如黑粉菌(例如黑粉菌目 (Ustilaginales))、銹菌(銹菌目(Uredinales))、麥角菌(Clavicepts pupurea)禾口霉菌 (mildew)；霄(mold)(卵菌綱(Oomycetes))諸如晚疫病菌(Phytophthora infestam)(馬鈴薯疫病(potato blight))；細菌病原體諸如歐文氏菌屬(Erwinia)(例如草生歐文氏菌 (E. herbicola))、假單胞菌屬(I^seudomonas)(例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、丁香假單胞菌(P. syringae)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)和惡臭假單胞菌(P. putida))、雷爾氏菌(I^alstonia)(例如青枯雷爾氏菌(R. solanacearum))、土壤桿菌屬和黃單胞菌屬 (Xanthomonas)；蟲回蟲(線蟲綱(Nematoda))；禾口 Phytomyxea (多粘霄屬(Polymyxa)禾口根月中菌屬(Plasmodiophora)) ο可以使用所公開的用于靶向重組生成感興趣的蛋白質(zhì)的方法來用不相同的序列替換任何基因組序列。例如，突變體基因組序列可以用其野生型對應物替換，由此提供用于治療植物疾病的方法；提供對植物病原體的抗性；提高作物產(chǎn)率等。以相似的方式，使用本文中所公開的靶向重組方法來將基因的一個等位基因用不同等位基因替換。在許多這些情況中，感興趣的區(qū)域包含突變，并且供體多核苷酸包含相應的野生型序列。相似地，野生型基因組序列可以用突變體序列替換，若這是期望的話。例如，癌基因的過表達可以通過使基因突變或者通過用支持較低的、非病理學表達水平的序列替換其控制序列來逆轉(zhuǎn)。實際上，可以使用本文中所公開的方法和組合物來改正或減輕以任何方式依賴于特定基因組序列的任何病理學。也可以使用靶向切割、插入、切除、和/或重組來改變非編碼序列(例如調(diào)節(jié)序列諸如啟動子、增強子、起始密碼子、終止子、剪接位點)以改變基因產(chǎn)物的表達水平?？梢詾榱死缰委熌康?、功能基因組學和/或靶物確認研究而使用此類方法?？梢允褂萌旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的靶向修飾來促進融合蛋白與細胞染色質(zhì)的結(jié)合。在其它實施方案中，在本文中所公開的鋅指切割域融合物外或取而代之，可以使用一種或多種在鋅指結(jié)合域與重組酶(或其功能性片段)間的融合物，以便于靶向重組。參見例如共同擁有的美國專利 No. 6，534，261 和 Akopian 等 000；3) Proc. Natl. Acad. ki. USA 100 :86888691。 在其它實施方案中，使用所公開的方法和組合物來提供ZFP結(jié)合域與轉(zhuǎn)錄激活或阻抑域的融合物，所述轉(zhuǎn)錄激活或阻抑域在其活性方面需要二聚化(同二聚化或異二聚化)。在這些情況中，融合多肽包含鋅指結(jié)合域和功能域單體(例如來自二聚體轉(zhuǎn)錄激活或阻抑域的單體)。兩個此類融合多肽對適當定位的靶位點的結(jié)合容許二聚化，從而重建功能性轉(zhuǎn)錄激活或阻抑域。此外，如上文所公開的，可以使用本文中所列的方法和組合物來將外源序列靶向整合到細胞基因組中感興趣的區(qū)域中，例如其中切割經(jīng)由同源性依賴性機制來增強插入 (例如，與一個或多個與預定基因組序列(即靶位點)相同，或同源但不相同的序列一起插入包含外源序列的供體序列)。供體序列在外源序列側(cè)翼的區(qū)域中可以含有足夠的同源性以支持基因組序列中的雙鏈斷裂的同源性指導的修復，由此在基因組靶位點處插入外源序列。因此，供體核酸可以是足以支持通過同源性依賴性修復機制(例如同源重組)來實現(xiàn)外源序列整合的任何大小。不希望受限于任何具體的理論，認為在外源序列側(cè)翼的同源性區(qū)域為斷裂的染色體末端提供了用于在雙鏈斷裂位點處再合成遺傳信息的模板。在某些實施方案中，在外源序列側(cè)翼存在兩個相同的序列或兩個同源但不相同的序列(或各一個)。外源序列(或外源核酸或外源多核苷酸)是含有通常不存在于感興趣的區(qū)域中的核苷酸序列的序列。例示性的外源序列包括但不限于cDNA、啟動子序列、增強子序列、表位標簽、標志物基因、切割酶識別位點和各種類型的表達構(gòu)建體。參見例如美國專利No. 6，833，252。 其它例示性的歸巢內(nèi)切核酸酶包括I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI、I-PanI, I-SceII, I-PpoI、I-SceIII, ICreI、I-TevI, I-TevII 和 I-TaiIII。它們的識別序列是已知的。還可參見美國專利 No. 5，420，032 ;Belfort 等(1997) Nucleic Acids Res. 25 3379-3388 ;Dujon 等(1989)Gene 82 :115-118 ;Perler 等(1994)Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127 Jasin(1996)Trends Genet. 12 :224-228 ；Gimble 等(1996)J. Mol. Biol. 263 163-180 ；Argast 等(1998) J. Mol. Biol. 280 :345353 及 New England Biolabs 產(chǎn)品目錄。標志物基因包括但不限于編碼介導抗生素抗性(例如氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白質(zhì)的序列、編碼有色或熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)(例如綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、螢光素酶)的序列、和介導增強的細胞生長和/或基因擴增的蛋白質(zhì)(例如二氫葉酸還原酶)的序列。如此，例示性的標志物基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦絲菌素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT，BAR)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、P"內(nèi)酰胺酶、兒茶酚雙加氧酶、a-淀粉酶、酪氨酸酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、水母發(fā)光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、茅草枯脫鹵素酶和鄰氨基苯甲酸合酶。在某些實施方案中，使用靶向整合來插入RNA表達構(gòu)建體，例如負責微小RNA或siRNA的調(diào)節(jié)性表達的序列。也可以在RNA表達構(gòu)建體中摻入啟動子、增強子和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，如上文所描述的。常規(guī)的轉(zhuǎn)化使用外來DNA的隨機整合以生成具有選擇的性狀的經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)基因作物植物，其在一些國外市場受到嚴格限制。另外，不想要的結(jié)果也源自DNA導入方法或源自轉(zhuǎn)基因?qū)蚪M的敏感區(qū)域的隨機插入，經(jīng)常為每個基因組中多次插入。特別地，不精確插入的效果在早期世代中本身可能不顯現(xiàn)，因為不同DNA差錯檢查機制在生長、繁殖、胚發(fā)生、和發(fā)育期間被激活。這些結(jié)果影響農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中的任何轉(zhuǎn)基因程序的時間和金錢成本。然而，在最近的Dow AgroSciences發(fā)明(W0/2008/021207)中，描述了一種用于精確插入轉(zhuǎn)基因的方法，其經(jīng)由鋅指核酸酶(ZFN)介導的同源重組進行。相反，在可以將ZFN蛋白在靶生物體外部表達并純化，然后投遞到靶植物細胞中的情況中，可以經(jīng)由非同源末端連接(NHEJ)來誘導手術(shù)特異性突變/基因敲除。如此，本發(fā)明可以生成非轉(zhuǎn)基因的經(jīng)遺傳修飾的植物，其會繞過對轉(zhuǎn)基因作物的限制，并且可以進行靶向基因編輯的過程而無需轉(zhuǎn)基因方法。用于異源表達序列特異性核酸酶蛋白諸如ZFN蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。 可適用的表達系統(tǒng)包括但不限于使用體外系統(tǒng)諸如小麥胚無細胞系統(tǒng)(參見美國專利 NO. 7，235，382，通過提及而將其收入本文)；熒光假單胞菌表達系統(tǒng)(Madduri等Q007) Protein Expres Purif，55(2) :352360)；和畢赤酵母屬(Pichia)蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(參見美國專禾Ij NO. 4，683，293 ；4，808，537 ；4，812，405 ；4，818，700 ；4，837，148 ；4，855，231 ； 4，857，467 ；4，879，231 ；4，882，279 ；4，885，242 ；4，895，800 ；4，929，555 ；5，002，876 ； 5，004，688 ；5，032，516 ；5，122，465 ；5，135，868 ；5，166，329，通過提及而將其收入本文)。本發(fā)明的具體的實施方案包括將外源表達的功能性ZFN與納米顆粒(NP)綴合， 并經(jīng)由NP介導的巧妙且隱蔽的投遞方法投遞到完整的植物細胞中以誘導雙鏈斷裂，并通過NHEJ來恢復受到破壞的基因的功能性。在其它實施方案中，經(jīng)由NP介導的巧妙且隱蔽的投遞方法將與NP綴合的功能性ZFN與DNA的供體片段一起投遞。其中ZFN切割基因組內(nèi)的特定序列，并且經(jīng)由同源重組將供體DNA整合到此基因座中。連接蛋白質(zhì)與NP的策略采用了四種主要辦法(1)靜電吸附、(2)與NP表面上的配體的綴合、(3)與蛋白質(zhì)能識別并結(jié)合的小的輔因子分子的綴合、和(4)與NP表面的直接綴合(Aubin Tam和Hamad khifferli，2008)。其它策略記載于Medintz等的綜述。這些標記策略中涉及的問題包括空間學(sterics)，或蛋白質(zhì)是否能“通過”配體到NP表面或相關(guān)連接基團。導致特定的連接(即不引起廣泛的交聯(lián))而且對于期望的目的而言穩(wěn)定的化學的選擇也是必要的考慮因素。ZFN肽需要在高DDT濃度下且在存在鋅離子的情況中官能化。為了保持綴合物的穩(wěn)定性，官能化會依照記載于Oh等，2010的綴合規(guī)程來進行。本發(fā)明借助于以下例示性實施例來進一步描述。
實施例實施例1 經(jīng)由體外翻譯或細菌表達來生成序列特異性核酸酶(SSN)。將SSN (IL1-L0/Fokl、ILl-43/Fokl、ILl-8/Fokl 和 UceI)工程化改造，并自含有所述SSN、附接的限制酶位點和6x組氨酸標簽的質(zhì)粒進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物插入Τ0Ρ0 載體pCR2. 1中以供克隆和測序。經(jīng)由限制性消化從所述質(zhì)粒取出含有所述SSN編碼序列的基因片段，并連接到表達載體PETKb的相容性限制性位點中。將這些樣品與PDAB4883一起轉(zhuǎn)化到BL21表達感受態(tài)大腸桿菌細胞中。對于有效的表達，通過用由PC0T4表達質(zhì)粒組成的質(zhì)粒PDAB4883轉(zhuǎn)化BL21來在BL21大腸桿菌DNA中降低SSN蛋白損傷，所述pCCTM 表達質(zhì)粒含有在也受IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導的啟動子下游的連接酶基因。這幫助修復SSN在過表達期間對BL21細胞基因組進行的任何損傷。將連接酶基因-pCCTM構(gòu)建體和SSN-pETKb構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到相同的BL21表達細胞中。將轉(zhuǎn)基因BL21的培養(yǎng)物在50mL具有氯霉素、羧芐青霉素、和ZnCl2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于37°C溫育，直至OD6tltlnm達到0. 5。用不同濃度的IPTG(0. 1-0. 7mM)誘導表達，并于不同溫度(1648°C )溫育，并經(jīng)由SDS-PAGE和Wfestern印跡來分析以檢測SSN蛋白的存在。如此，將ILl-L0/Fokl、ILl-43/Fokl、ILl-8/R)kl和HceI在大腸桿菌細胞中表達，并用Ni-NTA純化。純化后，基于自表達質(zhì)粒釋放特定片段的能力來證明SSN功能。或者，經(jīng)由體外翻譯來表達序列特異性核酸酶。來自Promega的商業(yè)試劑盒 TNT 提供了一種用于表達蛋白質(zhì)的有效且方便的方法。通過由試劑盒供應的蛋白質(zhì)表達酶體外表達含有從T7或SP6 RNA聚合酶啟動子下游克隆的序列特異性核酸酶基因的環(huán)形質(zhì)粒。遵循制造商的方案在50 μ L反應中在60-90分鐘內(nèi)生成合成的蛋白質(zhì)。其它商業(yè)試劑盒可用于蛋白質(zhì)的體外翻譯，可以使用的其它試劑盒包括來自Ambion的Activeftx) 、 來自 Ambion 的 PROTEINscript II、來自 New England Biolabs 的 PURExpress ，還有其它商品化的試劑盒。圖1和圖2顯示了加有組氨酸標簽的(1)和未加組氨酸標簽的(2)SSN，即 ZFN-ILlFokl的大腸桿菌表達。體外表達的ZFN-ILWokl從質(zhì)粒釋放意義明確的側(cè)翼為ZFN 結(jié)合位點的片段(ZFN-binding site-flanked fragment)。如此，大腸桿菌和體外表達的 SSN都可用于對靶DNA分子的有效且特異性的消化，并且它們在這項研究的整個過程中交
替使用。顯示了自克隆的SSN基因表達的蛋白質(zhì)是功能性的(即在切割供體DNA方面)。 例如，用ZFN-ILlR)kl處理質(zhì)粒pDAB1585 (顯示于圖4)。經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA是線性化的。 然后，將來自經(jīng)ZFN-ILWokl消化的質(zhì)粒的線性化片段自凝膠純化，并使用過夜體外連接規(guī)程來自我連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到化學感受態(tài)DH5 α大腸桿菌細胞中。將數(shù)個重組菌落回收，并通過限制樣式分析和DNA測序兩者來分析，表明PDAB1585按預期消化。實施例2 生成具有側(cè)翼有GFP報告基因片段的SSN結(jié)合位點的靶細胞培養(yǎng)物。靶序列由在β-葡糖醛酸糖苷酶(UidA)表達盒側(cè)翼的兩個綠色熒光蛋白(gfp) 基因片段(Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Russia)組成。在一個靶構(gòu)建體中,將具有識別序列的ZFN結(jié)合位點整合到所述靶構(gòu)建體中，所述識別序列由鋅指-FokI融合蛋白可以以同二聚體結(jié)合的反向重復序列組成(圖3)。所述結(jié)合位點含有ILl-FokI融合蛋白的識別序列的四個串聯(lián)重復，使得每個結(jié)合位點大小為約200bp以確保該識別序列易接近復雜染色質(zhì)環(huán)境中的所述鋅指-Fokl融合蛋白。在第二個構(gòu)建體中，將HceI結(jié)合位點整合到靶構(gòu)建體中(圖6)。在每個靶構(gòu)建體中，將結(jié)合位點與UidA編碼序列在N端融合。 5’和3’ gfp基因片段重疊MObp。這些重疊的序列提供在靶序列內(nèi)同源性，并且在5’ gfp 片段的3’端插入終止密碼子以確保沒有從靶序列的功能性gfp轉(zhuǎn)錄。使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化來將靶序列穩(wěn)定整合到BY2煙草細胞懸浮液中。將BY2培養(yǎng)物 (獲自 Jun Ueki of Japan Tobacco, Iwata, Shizuoka, Japan)在 pH 6. O 的培養(yǎng)基中維持，所述培養(yǎng)基含有 LS基礎(chǔ)鹽(PhytoiTechnology Labs, Shawnee Mission，KS，#L689)、170mg/L KH2PO4,30g/L 蔗糖、0. 2mg/L 2，4_D 和 0. 6mg/L 鹽酸硫胺。通過將 0. 25mL PCV 添加至 50mL 基于LS的培養(yǎng)基來將BY2細胞每7天進行傳代培養(yǎng)，所述基于LS的培養(yǎng)基在250mL燒瓶中在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于25°C和125RPM維持。為了生成具有整合的靶序列的轉(zhuǎn)基因BY2細胞培養(yǎng)物，將傳代培養(yǎng)之后4天的懸浮液的燒瓶分成10-12份4mL等分試樣，將其在100x25mm 培養(yǎng)皿中與 ΙΟΟμ L 含有 pZFN-TARGET pDAB1585(圖 4)或 ρ Hce I-TARGET pDAB100375(圖 7)的土壤桿菌菌株LBA4404共培養(yǎng)，所述土壤桿菌菌株LBA4404過夜培養(yǎng)至0D600為約 1. 5。將皿用Nescofilm (Azwelllnc.，Osaka, Japan)包裹，并于25°C在不搖動的情況中溫育3天，之后將過量的液體取出，并用IlmL含有500mg/L羧芐青霉素的LS培養(yǎng)基更換。 在將煙草細胞再懸浮后，將ImL懸浮液分配到LS培養(yǎng)基的100x25mm平板上，所述LS培養(yǎng)基含有用 8g/L TC 瓊脂(Phyto Technology,Shawnee Mission, KS)固化的 500mg/L 羧節(jié)青霉素和200mg/L潮霉素。平板于在黑暗中在打開的狀態(tài)下溫育。這導致針對單一處理的120-144塊選擇平板。單獨的潮霉素抗性分離株(isolate)在鋪板后10-14天出現(xiàn)，并將它們轉(zhuǎn)移到單獨的60x20mm平板(每塊平板一個分離株)，在這些平板上將它們按14天傳代培養(yǎng)日程表在選擇下作為愈傷組織維持，直至需要用于分析和后續(xù)的再轉(zhuǎn)化實驗。選擇含有單一全長整合拷貝的靶序列的潮霉素抗性、轉(zhuǎn)基因細胞培養(yǎng)物，并將其用于再啟動懸浮培養(yǎng)，其通過將約250-500mg愈傷組織放入40_50mL含有100mg/L潮霉素的LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并每7天進行傳代培養(yǎng)來進行，如上文所描述的。在所述實驗中使用細胞簇和單細胞(如DAS單細胞專利申請W0/2008/083233中所描述的那樣生成)兩者。實驗前3-4天，通過將2mL BY2懸浮聚集物轉(zhuǎn)移到250mL燒瓶中的40mL LSBY2培養(yǎng)基中來將一周時間的懸浮培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)到新鮮培養(yǎng)基，所述LSBY2 培養(yǎng)基含有原液濃度的4-氯-1，5-聯(lián)苯-IH-吡唑-3-基氧)乙酸乙酯(如記載于專利 TO/2008/083233的)、1_3%甘油、和0. 05-0. 1% (v/v)DMSO0在誘導單細胞的處理后3. 5 天或7天時收集單細胞。將ΒΥ2單細胞經(jīng)由流式細胞儀加工以測定細胞存活力，而且還經(jīng)由共焦顯微術(shù)來評估細胞穩(wěn)定性。通過觀察背景熒光水平(若有的話)來檢測穩(wěn)定性。較小百分比的細胞顯示與死亡細胞匹配的背景熒光，表明背景熒光來自經(jīng)歷壞死的細胞。在測試背景熒光后在所述實驗中使用單細胞和常規(guī)的懸浮聚集物兩者。實施例3 用SSN包被納米顆粒(NP)以供投遞到植物細胞中。直徑大小150nm 的金膠體(BBI International，GC150)、5_((2_(和 _3)_S(乙?；鶐€基)琥珀酰)氨基)熒光素(SAMSA熒光素=Invitrogen, A-685)、大小80和90nm 羧酸多官能化的金膠體的納米顆粒(TedPella，32019)、Sulf0-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)、EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]鹽酸碳二亞胺)(Pierce Bitoechnology, 24510, 22980)、MES (2-[N-嗎啉代]乙磺酸)(Fisher Scientific, AC32776-1000)、磷酸鹽緩沖鹽水緩沖包(Sigma，P536810PAK)、加有組氨酸標簽的GFP (Evrogen，激發(fā)最大值_482nm， 發(fā)射最大值_502nm，F(xiàn)P611)、turbo YFP (Evrogen，激發(fā)最大值_525nm，發(fā)射最大值538nm， FP611)、碘化丙啶(Sigma-P4864)、二乙酸熒光素(Sigma，F(xiàn)7378)是用SSN包被并用于投遞到靶細胞培養(yǎng)物中的多官能化NP的類型。(i)納米顆粒綴合物的制備(a)為對照處理合成沒有SSN的金-熒光素綴合物通過先前所描述的方法(Cannone等2006)來制備金-熒光素綴合物以在沒有SSN的情況中在BY2簇或單細胞中投遞并追蹤顆粒。將一(l)mg SAMSA熒光素在100 μ 1 0. IM NaOH中溶解，并渦旋振蕩15分鐘以除去保護硫醇的乙?；鶊F。然后，將活化的SAMSA與100μ 1 150nm金膠體(約109個顆粒/mL)混合。然后，將此溶液溫育1小時以確保反應的完成。然后，添加50 μ L IM HCl以中和溶液。以3000RPM將溶液離心30分鐘，并除去上清液。將獲得的黃色沉淀物在200 μ L 0. IM PBS中重懸，產(chǎn)生橙色的溶液。將此純化步驟重復兩次以確保除去游離的SAMSA熒光素。SAMSA與金的附著模式主要經(jīng)由硫醇鍵合。由于顯著的靜電排斥(SAMSA在ρΗ > 7時為雙陰離子的)，認為SAMSA與金膠體表面垂直(Carmone等2006)。使用此類NP來追蹤進入細胞中的此類發(fā)熒光的顆粒的數(shù)目的進入作為給定條件中的細胞適應性的指標的測量。(b)合成用SSN包被的金納米顆粒(GNP)使用略有修改的由Grabarek和 Gergely，1990所描述的方案來合成GNP-SSN綴合物。以3000RPM將0. 25mL20-150nm羧酸多官能化的金膠體溶液(約109個顆粒/mL)離心10分鐘。在棄去上清液后，將紅色的沉淀物在ImL活化緩沖液(0. IM MES,0. 5M NaCl，pH 6. 0)中懸浮。此后，將0. 4mg EDC和1. Img 硫代-NHS添加至此溶液，并于室溫渦旋振蕩15分鐘。然后，添加9 μ L ZFN-ILlFokl，并于室溫在黑暗中將所得的溶液溫育多達2小時以使蛋白質(zhì)和金完全起反應。通過尋找存在于金膠體上的羧酸數(shù)目來確定此反應中使用的金膠體與蛋白質(zhì)的比率。首先，通過用一個金顆粒的表面積(球體假設)除以被一個羧酸基團占據(jù)的表面(0. 20nm2 (Kimura等2002))來計算存在于一個金膠體上的羧酸基團的數(shù)目。然后，此結(jié)果乘以存在的金膠體的總數(shù)以獲得存在于整個金膠體溶液中的羧酸基團的總數(shù)。這等于存在于給定量的蛋白質(zhì)中的氨基基團的數(shù)目。金膠體經(jīng)由在存在于金膠體上的羧酸與存在于蛋白質(zhì)上的氨基基團間形成酰胺鍵而附著于蛋白質(zhì)(Grabarek和Gergely，1990)。大約有127，285個蛋白質(zhì)分子與一個金納米顆粒拴系在一起。(ii)細胞處理a)金攝取和細胞存活力的時間過程將下列樣品在M孔無菌板中制備(i) 500 μ L靶物懸浮簇或單細胞(對照)；(ii) 500 μ L ΒΥ2懸浮簇或單細胞 +20μ ^ΝΡ+25μ 二乙酸熒光素(FDA)+25 μ L碘化乙啶；和(iii)其它處理包括單獨的及與ZFN-ILlR)kl組合的40、60、80yL GNP及細胞和細胞存活力菌株。在5、20、120分鐘時及最終在M-48小時后在熒光顯微鏡下檢查經(jīng)處理的樣品以確認細胞的存活力。b)金-SAMSA熒光素處理在實驗前將下列樣品在M孔無菌板中制備(i) 500 μ L 靶物懸浮簇或單細胞(對照)；(ii) 500 μ L靶物懸浮簇或單細胞+20 μ LSAMSA-熒光素(對照)；和(iii)靶物懸浮簇或單細胞+20 μ L GNP-SAMSA-熒光素，其經(jīng)處理并將懸浮液在黑暗中于室溫溫育20分鐘以確認顆粒的進入。c)經(jīng)GNP包被的(例如加標簽的)ZFN-ILlFokl處理在細胞或懸浮簇處理前將下列樣品在M孔無菌板中制備(i) 500 μ L靶物懸浮簇或單細胞(對照)；(ii) 500 μ L靶物懸浮簇或單細胞+9-20 μ L ZFN(對照)；和iii) 500 μ L單細胞+10-40 μ L經(jīng)GNP包被的 (例如加標簽的)ZFN-ILlFokl。在實驗前將經(jīng)處理的細胞和簇在黑暗中于室溫溫育多達2 小時。在所有實驗中包括使用拴系有GFP/YFP的GNP的對照處理以確保非侵入性穿過和最佳進入的時機，其在實驗中作為指導使用(參見圖5)。另外，將融合細胞穿透肽(CPP)與NP融合(例如多官能化)以追蹤顆粒向靶物懸浮簇和單細胞中的實時進入。實施例4 合成加有量子點(QD)標簽的SSN綴合物。發(fā)光半導體納米晶體QD為許多已證明的生物學應用提供了一種有力的原型例子(Thermes V 等 2002 ;Windbichler 等，2007 ;Fajardo Sanchez 等，2008 ;Arnould S 等，2006)。它們的效用源自獨特的光物理特征和與大蛋白質(zhì)相當?shù)拇笮〉慕M合。親水性 CdSe-ZnS QD的流體動力學半徑從約5nm(對于與分子配體進行帽交換的納米晶體)變化至約20nm(對于封裝在嵌段共聚物內(nèi)的納米晶體)(Smith J等，2006)。將單一 QD與數(shù)種生物分子(諸如抗體、肽、DNA)綴合以提供具有增強的親合力的經(jīng)包被的QD生物綴合物。在本實施例中描述了使用與親水性QD綴合(例如包被)的ZFN-ILlR)kl作為便于其胞內(nèi)攝取和投遞到合適的靶DNA位點的備選策略。該方法一般遵循用于將QD-蛋白質(zhì)負載內(nèi)在化到活細胞中的規(guī)程，如記載于DAS專利申請65502中的。(i)QD 合成遵循所描述的規(guī)程(Lu 等，2007 ；Doyon 等 2006 ；Collins 等，2003 ； Lanio等，2000)使用熱配位溶劑混合物中的有機金屬前體的逐步反應來合成具有集中于 510和540nm的發(fā)射最大值的CcKe-ZnS核心-殼QD。將納米晶體多官能化，并通過用雙功能配體替換天然的加帽殼(其主要由三辛基膦和氧化三辛基膦(Τ0Ρ/Τ0Ρ0)組成)來使其親水，如先前所描述的(Lie等，2002 ；Mani等，2005 ；Desjarlais和Berg, 1993)。使用兩組親水性QD :(1)僅用二氫硫辛酸加帽的納米晶體；和( 用附加有聚(乙二醇)的二氫硫辛酸(PEG Mw約等于600，DHLA-PEG)和以生物素為末端的DHLA-聚(乙二醇)(PEG Mw約等于400,DHLA-PEG-生物素)的混合物以9 1摩爾比率的配體加帽的納米晶體。這些分別稱為 DHLA-QD 和 DHLA-PEG-生物素-QD。(ii)量子點生物綴合物的自我裝配為了以期望的價態(tài)自我裝配 QD-ZFN-ILlFokl綴合物，將合適摩爾比率的His-ZFN添加至IOmM Tris-ClpH 8緩沖液中的0. 3 μ M 5IOnm發(fā)射性的經(jīng)DHLA加帽的QD，并于室溫溫育30分鐘。類似地，將b_PE_鏈霉親合素添加至磷酸鹽緩沖鹽水(137mM NaClUOmM磷酸鹽、2. 7mM KCl，pH 7. 4,PBS)中的 0. 3 μ M 540nm發(fā)射性QD (以DHLA-PEG =DHLA-PEG生物素9 1比率加帽)，并于4°C溫育過夜；通過鏈霉親合素-生物素相互作用來驅(qū)動此情況中的綴合物形成。使用凝膠電泳來表征綴合物，其中監(jiān)測與附加有His的ZFN或經(jīng)鏈霉親合素標記的b-PE裝配的QD的電泳遷移率的變化。將樣品在 IxTBE 緩沖液(0. 09M Tris,0. 002MNa2_EDTA、0. 09M 硼酸，pH 8. 3) 中稀釋，并且對于QD-b-PE和YFP綴合物分別在或2%瓊脂糖凝膠上運行。特別地，監(jiān)測改變每個QD生物綴合物的ZFN-ILWokl分子數(shù)目的效果，若它們與供追蹤用的熒光蛋白融合的話。通過激發(fā)QD和/或蛋白質(zhì)，并捕捉凝膠內(nèi)分開的條帶的熒光圖像來收集凝膠圖像。通過監(jiān)測自我裝配后QD與熒光蛋白間的能量轉(zhuǎn)移的變化來確認綴合物形成。使用 325nm激發(fā)在Tecan &ifire雙單色儀多功能微量滴定板讀出器(Tecan，Research Triangle Park,NC)上收集熒光譜。對于胞內(nèi)投遞和成像實驗，以額定的(nominaDZFN QD摩爾比率將QD與ZFN-ILlR)kl的混合物進行自我裝配。(iii)量子點-熒光蛋白質(zhì)綴合物的胞內(nèi)攝取在無菌條件中實施細胞內(nèi)在化實驗，如先前所描述的。將QD生物綴合物稀釋到完全培養(yǎng)基中，添加至細胞培養(yǎng)物，并于37°C 以40-150 μ g/mL溫育1小時。以不同QD綴合物濃度將經(jīng)混合表面QD包被的綴合物與細胞培養(yǎng)物一起溫育，所述綴合物由1 5或1 10的具有1 1至1 2. 5裝配價態(tài)的ZFN和QD/b-PE，連同每QD 50個CPP的CPP組成。通過用PBS或細胞培養(yǎng)基將培養(yǎng)物清洗至少三次來除去過量的未結(jié)合的QD綴合物。然后，將細胞于室溫在3. 7%低聚甲醛中固定10分鐘，用PBS清洗兩次，并在含有DAPI染料(Invitrogen)的ftx)Long Antifade封固介質(zhì)中封固以進行細胞核染色。使用Leica顯微鏡來實施落射熒光圖像收集。使用裝備有565nm 二向性濾光器的DualView系統(tǒng)來收集并定量并排分開熒光圖像(Side-by-side split fluorescence)。對于 510nm QD-YFP/ZFN 細胞成像，以 488nm 激發(fā)樣品，并用 565nm 二向性濾光器(dichroic)來收集/分開發(fā)射，并將其解卷積(deconvolute)。以λ < 565nm 收集QD熒光，并以λ > 565nm收集YFP熒光尾。將向QD窗的YFP泄漏作為解卷積的一部分扣除。以488nm激發(fā)540nm QD和b-ΡΕ，并用565nm 二向性濾光器來分開其各自的發(fā)射，并將其解卷積。使用Xe燈來激發(fā)DAPI熒光，并使用DAPI濾色塊(DAPI cube)(用于激發(fā)的D350/50X，二向性400DCLP，用于檢測的D460/50m)來收集發(fā)射。使用Xe燈來激發(fā) AF647-TF，并使用Cy5濾色塊(激發(fā)HQ620/60x，二向性Q660LP，發(fā)射HQ700/75m)來檢測熒光。激發(fā)/檢測濾色塊都是由Chroma Technology提供的。使用明亮的光源來收集微分干涉相差(DIC)圖像。(iv)經(jīng)ZFN-ILWokl包被的QD的確認與納米晶體的富含Si的無機表面直接發(fā)生His相互作用。以攜帶由小的間隔物分開的兩個(His)6序列的N端和具有N端(His)S 序列的CPP工程化改造ZFN-ILWokl容許形成緊密的QD-蛋白質(zhì)/肽復合物。生物素-親合素結(jié)合是在其強烈的相互作用(KD約I(T15M)方面在本領(lǐng)域中已知的普遍存在的生物綴合策略。使用用以羥基和生物素為末端的PEG的混合物加帽的QD表面(DHLA-PEG-生物素-QD)容許與商品化的b-PE鏈霉親合素的容易的綴合(例如包被)。(v)QD-ZFN-ILlFokl綴合物的胞內(nèi)投遞為了證實用YFP/ZFN_ILlR)kl負載包被的經(jīng)多官能化的(例如表面官能化的)QD的攝取是通過納米晶體表面上的CPP存在而介導的，將靶BY2細胞系與三種類型的綴合物分別一起溫育=QD-CPP綴合物(每個QD為10-100 個CPP)、QD-ZFN-ILlR)kl/CPP、和裝配有ZFN-ILli^okl和CPP的混合物的QD (每個綴合物具有約 10 個 ZFN-ILlFokl 和約 50 個 CPP 的 QD-ZFN-ILli^okl-CPP)。將細胞與 5IOnm 發(fā)射性QD綴合物(為約75nM濃度)的溶液一起溫育，漂洗以除去任何未結(jié)合的材料，隨后使用落射熒光顯微術(shù)來成像。還用DAPI來對細胞復染色以允許分別顯現(xiàn)細胞核和內(nèi)體。當額外的CPP存在于QD表面上(混合表面QD-ZFN-ILlFokl-CPP綴合物)時，發(fā)生綴合物的實質(zhì)性胞內(nèi)攝取，如通過對這兩組細胞測量的明顯的熒光強度所指示的。此外，對這兩種培養(yǎng)物收集的圖像顯示了，在QD和ZFN-ILlFokl/YFP的熒光樣式間有幾乎完全的重疊。染色樣式和共定位樣式的評估指示核周分布，而且主要限于內(nèi)體區(qū)室內(nèi)。在存在CPP的情況中細胞系對QD綴合物的有效內(nèi)在化表明CPP促成用ZFN-ILlR)kl熒光融合蛋白負載多官能化 (例如表面官能化)的QD的胞內(nèi)攝取。與納米顆粒部分中所描述的NP處理類似地處理單細胞和聚集體簇，并將它們在沒有選擇的情況中鋪板，并在實驗后2-4周監(jiān)測GFP表達集落。實施例5 在經(jīng)由GNP和QD將SSN投遞到煙草細胞中后的同源性指導的修復將如上文所描述的那樣用與顆粒拴系在一起的ZFN-ILWokl或HceI處理的靶細胞系在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上鋪板，所述靶細胞系具有整合的ZFN或IIceI結(jié)合位點。處理后，將細胞鋪板到非選擇培養(yǎng)基上。綠色熒光焦點在7天后可見。為了確認觀察到的熒光源自功能性gfp基因的重建，分離發(fā)熒光的組織區(qū)段的集合，并經(jīng)由選擇性傳代培養(yǎng)的數(shù)次傳代來手工富集。將基因組DNA自這些發(fā)熒光的組織分離，并通過PCR用錨定于任意 gfp基因片段上的探針來測定。從經(jīng)SSN處理的發(fā)熒光的組織富集的樣品在擴增時產(chǎn)生預測的0. 6kb PCR產(chǎn)物，這指示預期的重組已經(jīng)在這些組織中重建功能性gfp基因。還在富集的樣品中觀察到另外的4. 11Λ PCR產(chǎn)物，這指示在細胞群體中存在非重組的報告序列。鑒于用于實現(xiàn)gfp陽性細胞富集的發(fā)熒光的組織的視覺選擇方法，這不是不可預期的。
雖然上文已經(jīng)討論了許多例示性的方面和實施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認可某些修飾、置換、添加和其亞組合。因此，意圖所附的權(quán)利要求書和引入的權(quán)利要求解釋為包括所有此類修飾、置換、添加和亞組合，如在其真正的精神和范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.一種將序列特異性核酸酶(SSN)導入植物細胞中的方法，該方法包括提供具有細胞壁的植物細胞；用SSN包被納米顆粒；將所述具有細胞壁的細胞與所述經(jīng)包被的納米顆粒彼此接觸地放置；并允許所述納米顆粒和所述SSN被攝取入所述包含細胞壁的植物細胞中。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中用SSN包被納米顆粒包括經(jīng)由所述納米顆粒的表面上的非共價吸收來固定化所述SSN。
3.依照權(quán)利要求1的方法，其進一步包括將所述SSN吸收到所述納米顆粒中。
4.依照權(quán)利要求1的方法，其進一步包括允許所述納米顆粒被攝取入所述包含細胞壁的植物細胞的區(qū)室中。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其進一步包括用細胞穿透肽和或亞細胞區(qū)室靶向蛋白包被所述納米顆粒。
6.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述區(qū)室選自下組細胞溶膠、細胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。
7.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述包含細胞壁的植物細胞選自下組煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔、油菜籽、棉花、棕櫚、花生、大豆、稻屬物種(Oryza sp.)、擬南芥屬物種 (Arabidopsis sp.)、蓖麻屬物種(Ricinus sp.)、和甘蔗細胞。
8.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細胞來自選自下組的組織胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢和莖。
9.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述納米顆粒選自下組金納米顆粒、金包被的納米顆粒、多孔納米顆粒、介孔納米顆粒、硅納米顆粒、聚合物納米顆粒、鎢納米顆粒、明膠納米顆粒、納米殼、納米核心、納米球、納米棒、磁性納米顆粒、半導體納米顆粒、量子點、納米基質(zhì)、 樹枝狀聚合物納米基質(zhì)及其組合。
10.依照權(quán)利要求1的方法，其進一步包括衍生化所述納米顆粒的表面。
11.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述SSN是由具有非序列依賴性核酸酶域的鋅指蛋白組成的鋅指核酸酶。
12.依照權(quán)利要求11的方法，其中所述非序列依賴性核酸酶域源自IIS型限制性內(nèi)切核酸酶I7OkI。
13.依照權(quán)利要求11的方法，其進一步包括選擇具有穩(wěn)定整合的所述ZFN的細胞。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中選定的細胞是可再生細胞。
15.依照權(quán)利要求14的方法，其進一步包括自所述可再生細胞再生植物。
16.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述納米顆粒是多官能化的納米顆粒。
全文摘要
提供了用于將序列特異性核酸酶導入包含細胞壁的植物細胞中的方法。提供了用于遺傳修飾或以其它方式修飾植物及在包含細胞壁的植物細胞中治療或預防疾病的方法。
文檔編號C12N15/82GK102369287SQ201080015582
公開日2012年3月7日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者J.佩托里諾, J.薩繆爾, K.姚, N.薩姆博朱, S.韋伯 申請人:陶氏益農(nóng)公司