用于密度梯度分離的方法和插入件的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種適合用于密度梯度分離的離心管的插入件。插入件包括元件，所述元件尺寸確定成配合在管內以用于將管分成頂部分和底部分?？蛇x地插入件具有支撐件，所述支撐件從元件延伸或懸掛以用于將元件定位在管內。至少兩個開口位于元件上，使得當插入件定位在離心管中時，第一開口相對于第二開口更靠近管的底端。也描述了一種使用離心管的插入件從樣本分離靶細胞群的方法。
【專利說明】用于密度梯度分離的方法和插入件
[0001]相關申請
[0002]本申請要求于2011年5月5日提交的共同未決的美國臨時申請N0.61/482，886的優(yōu)先權，上述申請的內容通過弓I用完整地被合并于本文中。
【技術領域】
[0003]本申請涉及一種用于分離細胞群的設備和方法，并且更具體地涉及用于離心管的插入件和使用密度梯度分離來分離細胞群的方法。
【背景技術】
[0004]在許多應用中，期望富集或替代地耗盡生物樣本中的細胞群。血液學、免疫學和腫瘤學的領域依賴于外周血和來自相關組織(例如骨髓、脾、胸腺和胎肝)的細胞懸液的樣本。特定細胞類型從這些不均勻樣本的分離對于這些領域中的研究以及某些惡性腫瘤和免疫/造血障礙的診斷和治療是關鍵。
[0005]諸如T細胞和抗原遞呈細胞的免疫細胞的純化群是免疫功能的研究所必需的并且在免疫療法中使用。細胞、分子和生化過程的研究需要孤立地分析某些細胞類型。許多技術已用于分離T細胞亞群、B細胞、嗜堿粒細胞、NK細胞和樹突細胞。
[0006]造血干細胞的分離也已成為很感興趣的領域并且純干細胞群將促進造血的研究。從外周血、臍帶血和/或骨髓移植造血細胞越來越多地與高劑量化學療法和/或放射療法組合使用以便治療包括惡性、非惡性和遺傳性疾病的各種疾病。這樣的移植物中的很少細胞能夠長期造血重建，并且因此強烈需要開發(fā)用于純化造血干細胞的技術。
[0007]此外，嚴重并發(fā)癥和甚至移植程序的成功在很大程度上取決于用于去除對移植受體構成風險的移植物中的細胞的程序的有效性。這樣的細胞包括同種移植物中為移植物抗宿主疾病(GVHD)負責的T淋巴細胞，和可能導致惡性生長的復發(fā)的自體移植物中的腫瘤細胞。通過去除非必要細胞并且因此減小待輸注的冷凍保存液(cyropreservant)的體積而緊實移植物也是重要的。
[0008]在某些情況下，期望去除或耗盡來自生物樣本，例如骨髓移植物中的腫瘤細胞。支氣管、乳腺導管以及胃腸道和泌尿生殖道的上皮癌代表如今看到的實體性腫瘤的主要類型。微轉移腫瘤細胞遷移被認為是患有上皮癌的患者的重要預后因素。檢測這樣的轉移性細胞的能力受到組織或流體采樣的有效性和腫瘤檢測方法的靈敏性限制。富集血液樣本中的循環(huán)上皮腫瘤細胞的技術增加檢測轉移性疾病的能力并且便于這樣的罕見細胞的研究和能夠進行疾病擴散的生物變化的確定。
[0009]造血細胞和免疫細胞在物理特性，例如密度的基礎上并且在對殺死連續(xù)分裂細胞的某些藥理學試劑的易感性的基礎上進行分離。細胞表面抗原的單克隆抗體的出現(xiàn)大大增加了區(qū)分和分離不同細胞類型的可能性。使用單克隆抗體使細胞群從血液和相關細胞懸液分離有兩種基本方法。它們的區(qū)別在于用(一種或多種)抗體區(qū)分/標記的是期望細胞還是非期望細胞。[0010]在陽性選擇技術中，期望細胞用抗體進行標記并且從剩余未標記/非需要細胞去除。在陰性選擇中，非需要細胞被標記并且被去除。抗體/補體治療和免疫毒素的使用是陰性選擇技術，但是熒光激活細胞分選(FACS)和多數(shù)分批免疫吸附技術可以適合于陽性和陰性兩種選擇。在免疫吸附技術中，細胞用單克隆抗體進行選擇并且優(yōu)選地結合到可以從細胞的剩余物去除的表面，例如珠柱、瓶、磁性顆粒。免疫吸附在臨床上和研究中贏得贊同，原因是它們用單克隆抗體保持靶細胞的高特異性，但是不同于FACS，它們可以按比例擴大以直接處理臨床采集中的大量細胞并且它們避免使用細胞毒性試劑，例如免疫毒素和補體的危險。然而它們需要使用“設備”或細胞分離表面，例如珠柱、淘瓶或磁體。 [0011]不管特定方法如何，用于從血液分離特定細胞(例如造血干細胞、免疫細胞和循環(huán)上皮腫瘤細胞)的當前技術大體上包括去除紅血細胞(RBC)的初始步驟。密度分離通常用于從外周血液去除 RBC。Ficoll-Paque? (Ficoll) (Amersham Pharmacia Biotech AB,烏普薩拉，瑞典)是用于該應用的使用最廣泛的密度分離介質(DSM)。其它DSM包括Lymphoprep?(Axis-Shield,挪威)，和 RosetteSep? DM_L(STEMCELL Technologies,加拿大)。在 Ficoll密度分離中，將全血層疊在Ficoll上并且然后離心。RBC和粒細胞沉淀到細胞團塊并且單核細胞保持在Ficoll-血漿界面處。該技術的成功依賴于單核細胞、粒細胞和RBC之間的密度的差異，由此單核細胞在Ficoll中漂浮而RBC和粒細胞則不然。
[0012]如果有血液與Ficoll的混合，則Ficoll的密度將被影響，因此在離心之前需要將血液小心地層疊到Ficoll層上。在離心之后，如果血漿和Ficoll之間的界面在管的操作期間被擾動，則可能難以在不也收集一些紅細胞和粒細胞的情況下回收單核細胞。
[0013]特定細胞可以例如使用RosetteS^)?連接到紅血細胞，以便形成免疫花環(huán)，從而使得在密度梯度分離期間靶細胞與紅血細胞形成團塊。許多不同的特定淋巴細胞和粒細胞群可以通過密度梯度分離與RosetteSep?的組合進行分離。另外，如果全血儲存超過24小時，則粒細胞改變密度并且將不會與紅細胞形成團塊。使用RosetteSep?將RBC連接到粒細胞可以改善這些樣本中的單核細胞的密度分離。
[0014]如果層疊和細胞回收的過程更可靠則將是有益的。已進行了一些研發(fā)管的工作以使用離心管中的各種類型的插入件簡化Ficoll過程。UniS印管(NovaMEd，以色列)具有由塑料支撐件保持就位的網(wǎng)狀圓盤的插入件。具有該插入件的管難以裝載Ficoll，原因是它們需要離心步驟，并且網(wǎng)會被細胞堵塞。Vacutainer? CPT?管(BD，新澤西州)具有在Ficoll狀密度分離介質上的凝膠屏障。管昂貴并且凝膠會被細胞堵塞，尤其在有紅細胞的任何免疫花環(huán)的情況下。美國專利N0.5，840，502描述一種具有圓錐形硅樹脂插入件的管，所述插入件壓配合到離心管中。這些管大體上需要離心以用密度分離介質填充管。
[0015]Accuspin? (Sigma-Aldrich,圣路易斯，密蘇里州)和 Leucosep? (GreinerBio-One,門羅，北卡羅萊那州)管具有將管分成頂部和底部部段的熔塊。需要離心步驟以用密度介質填充熔塊之下的體積并且在密度分離期間該熔塊可以脫離。熔塊可以變?yōu)橥扛灿屑t血細胞(RBC)并且有時堵塞，尤其當分離免疫花環(huán)細胞時。
[0016]因此，需要一種用于離心管的插入件，其允許管容易地裝載Ficoll或其它密度分離介質。此外，將有利的是在插入件之下俘獲的空氣的小體積在分離中不破壞管的使用。也將有利的是插入件未被小血凝塊或紅血細胞的聚集體或花環(huán)堵塞并且能夠倒置管以倒出富集樣本，而包含團塊的管的下部分中的液體不流出。最后，期望插入件可靠地保持就位，使得它脫離的機會很小。

【發(fā)明內容】

[0017]本公開大體上涉及一種用于離心管的插入件，其有用于使用密度分離介質(DSM)的密度梯度分離。在一個實施例中，插入件便于用DSM填充離心管并且將樣本層疊在離心管中的DSM的頂部上。在密度梯度分離方案期間，插入件也便于包含DSM的離心管的處理和操作。在一個實施例中，在密度梯度分離之后插入件幫助防止DSM與DSM和樣本的剩余體積之間的界面層之間的混合。
[0018]在一個實施例中，插入件包括元件，所述元件尺寸確定成配合在離心管內并且將管分成頂部分和底部分。在一個實施例中，插入件具有通過元件的至少兩個開口，使得當插入件定位在離心管中時，第一開口相對于第二開口更靠近管的底端。在一個實施例中，插入件包括支撐件，所述支撐件從元件延伸或懸掛以用于將元件定位在管內。在一個實施例中，當插入件向下推動到離心管中時，支撐件接觸離心管的底端并且限制插入件的位置。
[0019]在一個實施例中，當定位在離心管中時，第一開口允許流體流動到插入件之下的空間中。當離心管填充有液體時，第二開口允許空氣從元件之下的空間逸出?？蛇x地，插入件具有超過兩個開口。在一個實施例中，開口尺寸確定成提供橫越每個開口的表面張力，從而當?shù)怪霉軙r，防止包含在元件之下的流體流動通過開口。
[0020]在一個方面中，插入件有用于靶群從樣本的回收或分離。在一個實施例中，靶群是靶細胞群并且樣本是生物樣本。在一個實施例中，本文中所述的插入件有用于使用密度梯度分離從血液樣本分離和回收白細胞或單核細胞。
[0021]本文中所述的插入件提供許多優(yōu)點。在一個實施例中，插入件允許樣本倒入包含DSM的離心管中而不混合樣本和DSM，從而損害密度梯度分離。在一個實施例中，插入件允許離心管容易地填充有DSM。在一個實施例中，在密度梯度分離期間本文中所述的插入件不被例如血細胞或其它樣本成分堵塞。在一個實施例中，在密度梯度分離之后，離心管的頂部分中的樣本的體積可以被倒出離心管而不倒出包含在離心管的底部分中的液體。在一個實施例中，插入件允許被分離樣本被倒出或瀉出離心管而不擾動包含在管的底部分中的分離介質和任何團塊材料(例如紅血細胞)的底部分。本文中所述的插入件也可以容易地和經濟地使用注射模制或本領域中已知的其它技術制造為單件并且容易插入離心管中。
[0022]在另一方面中，提供一種用于從樣本分離靶細胞群的方法，其包括:
[0023]a)提供具有如本文中所述的插入件的離心管；
[0024]b)用密度分離介質(DSM)填充離心管的一部分，使得DSM覆蓋插入件的頂部；
[0025]c)將包含靶細胞群的樣本的體積加入離心管，以形成DSM和樣本之間的界面；
[0026]d)旋轉離心管以從樣本分離靶細胞群。
[0027]在一個實施例中，方法包括在旋轉離心管之后，從DSM和樣本之間的界面之上的樣本的體積回收靶細胞群。在一個實施例中，通過倒出元件之上的包含在離心管的頂部分中的樣本的體積從離心管回收靶細胞群。在一個實施例中，通過使用體積轉移裝置(例如移液管)去除元件之上的包含在離心管的頂部分中的樣本的體積回收靶細胞群?？蛇x地，方法包括在旋轉離心管之前，例如通過免疫花環(huán)(如通過引用被合并于此的美國專利N0.6，750，326中所述)將致密顆粒連接到樣本中的第二細胞群，以改善將靶細胞群從樣本的剩余部分分離。在一個實施例中，本文中所述的插入件可以在減速期間在制動器開啟的情況下在離心機中使用，而不損害從樣本回收靶細胞。
[0028]在另一方面中，提供一種離心管，所述離心管包括如本文中所述的用于離心管的插入件。在一個實施例中，插入件與離心管成一體。
[0029]在另一方面中，本說明書提供一種套件，所述套件包括如本文中所述的插入件。在一個實施例中，套件也包括一個或多個離心管、DSM的體積或用于執(zhí)行如本文中所述的任何方法的印刷手冊。
[0030]本公開的其它特征和優(yōu)點將從以下詳細描述變得明顯。然而應當理解詳細描述和具體例子盡管指示本公開的優(yōu)選實施例，但是僅僅作為示例被給出，原因是本領域的技術人員從該詳細描述將顯而易見本公開的精神和范圍內的各種變化和修改。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]為了更好地理解本文中所述的實施例并且更清楚地顯示它們可以如何實施例，現(xiàn)在將僅僅通過例子參考附圖，附圖顯示至少一個示例性實施例，并且其中:
[0032]圖1A顯示具有第一開口和第二開口之間的15度傾斜的用于離心管的插入件的一個實施例的透視圖。圖1B是圖1A中所示的插入件的俯視平面圖。圖1C是沿著線A-A的圖1B中所示的插入件的截面圖。
[0033]圖2A顯示具有凹頂表面、具有第一開口和第二開口之間的15度傾斜的用于離心管的插入件的一個實施例的透視圖。圖2B是圖2A中所示的插入件的俯視平面圖。圖2C是沿著線A-A的圖2B中所示的插入件的截面圖。
[0034]圖3A顯示具有凹頂表面、具有第一開口和第二開口之間的25度傾斜的用于離心管的插入件的一個實施例的透視圖。圖3B是圖3A中所示的插入件的俯視平面圖。圖3C是沿著線A-A的圖3B中所示的插入件的截面圖。
[0035]圖4顯示具有中心開口和圍繞元件的頂表面的周邊的三個開口并且具有中心開口和元件的周邊之間的15度傾斜的圓錐形插入件的一個實施例。中心開口在離心期間允許細胞的通過并且圍繞周邊的開口在用密度介質填充管期間允許空氣逸出。
[0036]圖5顯示具有中心開口和圍繞元件的頂表面的周邊的三個開口并且具有中心開口和元件的周邊之間的40度傾斜的圓錐形插入件的一個實施例。中心開口在離心期間允許細胞的通過并且圍繞周邊的開口在用密度介質填充管期間允許空氣逸出。
[0037]圖6顯示定位在離心管內的如本文中所述的插入件的一個實施例的截面圖。
[0038]圖7A顯示定位在離心管內的如本文中所述的插入件的一個實施例的截面?zhèn)纫晥D，其中管裝載有分離介質和層疊在分離介質的頂部上的樣本。圖7B顯示通過密度梯度離心將樣本分離成層之后的管。圖7C顯示倒置的管，其中分離介質在插入件之下保持在管中。
【具體實施方式】
[0039]本文中所述的插入件有用于與離心管組合以使用密度梯度分離來分離樣本中的靶群。例如，在一個實施例中，插入件可以定位在離心管中并且用于使用密度分離通過在離心機中旋轉管使單核細胞從外周血液的樣本中的其它細胞分離。具有比DSM大的密度的細胞和其它成分將沉淀到管的底部，而具有比DSM小的密度的細胞和其它成分將在樣本和DSM之間的界面處或之上沉淀。
[0040]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，本文中所述的插入件便于用DSM填充離心管。插入件也有用于層疊離心管中的樣本和DSM并且防止樣本和DSM之間的界面的破壞。在一個實施例中，插入件也有用于在密度梯度分離方案中回收靶細胞群。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的用于離心管的插入件的各種示例性實施例在圖1至5中顯示。
[0042]參考圖1，提供用于離心管的插入件10。插入件10具有元件12和支撐件14。支撐件14從元件12延伸以用于將插入件與離心管定位在一起。如圖1中所示，支撐件14可以采用圓柱形側壁的形式。在一些實施例中，支撐件可以采用從元件延伸或懸掛并且用于在離心管中定位或穩(wěn)定插入件的撐桿或腿的形式。
[0043]在一個實施例中，插入件具有通過元件的至少兩個開口。參考圖1，顯示通過元件12的第一開口 16和通過元件12的第二開口 18。在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，第一開口相對于第二開口更靠近離心管的底部?？蛇x地，如圖1中所示，第一開口 16和/或第二開口 18可以包括支撐件14的切口部分。在一個實施例中，開口的周邊包括支撐件14的切口部分和離心管的側壁的至少一部分。在一個實施例中，第一和/或第二開口為圓形。在一個實施例中，第一和/或第二開口為非圓形并且包括直或彎曲側或它們的組合。在一個實施例中，第一和第二開口是不同形狀。
[0044]圖2顯示用于離心管的插入件200的另一實施例，該插入件具有元件212、支撐件214以及第一和第二開口 216和218。元件212具有凹表面，所述凹表面具有從位于元件的周邊上的第一開口 216到第二開口 218的15度的傾斜。圖3顯示用于離心管的類似插入件300。支撐件314從元件312延伸，并且具有凹表面，所述凹表面具有從位于元件的周邊上的第一開口 316到第二開口 318的25度的傾斜。
[0045]圖4和5顯示用于離心管的插入件的另外的實施例，所述插入件具有用于分離管的頂和底部分的圓錐形元件。參考圖4，插入件400具有元件412、支撐件414、第一中心開口 416和圍繞元件的周邊的多個第二開口 418。元件412具有圓錐形頂表面，所述圓錐形頂表面具有從元件的底部處的第一開口到周邊的大約15度的傾斜。圖5顯示類似插入件，所述插入件具有元件512、支撐件514、第一中心開口 516和圍繞元件512的周邊的多個第二開口 518。元件512具有圓錐形頂表面，所述圓錐形頂表面形成從元件的底部處的第一開口到周邊的40度的傾斜?？蛇x地，插入件具有一個、兩個、三個、四個、五個或超過五個第二開口。在一個實施例中，第二開口具有不同尺寸。在一個實施例中，第二開口圍繞元件的周邊均勻地間隔。
[0046]在一個實施例中，元件尺寸確定成配合在離心管內以用于將管分成頂部分和底部分。參考圖6，插入件顯示為定位在空離心管50內并且元件12將離心管頂部分和底部分。如圖6中所示，支撐件14接觸離心管的圓錐形底部分并且防止插入件進一步下降到離心管中。在一個實施例中，從元件延伸或懸掛的支撐件也便于將插入件放置到離心管中并且在操作管時或在分離步驟(例如離心)期間防止插入件脫離。
[0047]在一個實施例中，本文中所述的插入件便于用DSM填充離心管。例如，第一開口允許元件之上的離心管的頂部分中的空間與離心管之下的離心管的底部分中的空間之間的空氣或流體連通。在一個實施例中，一個或多個第二開口也允許元件之上的離心管的頂部分中的空間與離心管之下的離心管的底部分中的空間之間的空氣或流體連通。在一個實施例中，當管的底端通過第一開口填充有液體時，第二開口允許空氣從元件之下的空間逸出。可選地，插入件具有一個、兩個、三個、四個、五個或超過五個第二開口。在一個實施例中，第二開口具有不同尺寸。在一個實施例中，第二開口圍繞元件的周邊均勻地間隔。
[0048]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，第一開口相對于第二開口更靠近管的底端。第一和第二開口的相對布置允許流體穿過第一開口并且填充管的底部分。當流體通過第一開口填充管時，空氣排出定位在便于用流體填充或裝載管的第一開口之上的第二開口。在一個實施例中，第一開口和第二開口在元件上分離的距離是第一開口的直徑的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或大于五倍。在一個實施例中，第一開口和第二開口在元件上分離的距離是第二開口的直徑的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或大于五倍。當在本文中使用時，“直徑”表示當插入件定位在離心管中時由任一開口的相對側限定的最大橫截面距離。
[0049]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，第一開口位于元件的頂表面的最下部分處。例如參考圖6，第一開口 16相對于離心管50的底端位于元件12的最下部分處。類似地，將領會，當圖2-5中所示的插入件定位在離心管內時，第一開口將相對于離心管的底部位于元件的頂表面的最下部分處。
[0050]在另一實施例中，當插入件定位在離心管中時，第二開口位于元件的頂表面的最高部分處。例如參考圖6，第二開口 18相對于離心管50的底端位于元件12的最高部分處并且最靠近管的敞開端部。在一個實施例中，當管填充有流體時，將第二開口定位在元件的最高部分處幫助防止氣泡被俘獲在插入件之下。在一個實施例中，第一和/或第二開口位于元件的周邊上或附近。在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，第一和/或第二開口鄰近離心管的側壁定位。例如，圖4顯示具有第一中心開口和位于元件的周邊上的多個第二開口的插入件。
[0051]在一個實施例中，開口尺寸確定成提供橫越開口的表面張力，從而當?shù)怪霉軙r防止包含在插入件之下的液體通過開口流動。例如，在一個實施例中，開口的每一個相對于離心管的橫截面積具有小于15%、小于10%、小于5%、在5%到1%之間或小于1%的面積。本領域的技術人員將容易能夠確定第一和第二開口的尺寸以允許流體(例如DSM)由橫越開口的表面張力保持在插入件之下。在一個實施例中，第一開口相對于第二開口較大。例如，在一個實施例中，第一開口具有從大約Imm到大約5mm的直徑。在一個實施例中,第一開口具有大約2_到大約4_的直徑。在一個實施例中，第二開口具有小于大約2_的直徑。
[0052]在一個實施例中，插入件具有從元件延伸或懸掛的支撐件以用于將元件定位在管內。在一個實施例中，支撐件接觸離心管的底部并且限制插入件可以向下推動到管中多遠。在一個實施例中，當向下朝著離心管的底端推動插入件時，例如當插入件向下插入管中時，或當包含插入件的管被離心時，支撐件抵抗壓縮。在一個實施例中，支撐件是從元件的底表面延伸的圓柱形側壁。在另一實施例中，支撐件可以包括從兀件的底表面延伸的一個或多個腿以用于接觸離心管的底端。在一個實施例中，離心管具有圓錐形底端并且支撐件接觸離心管的圓錐形底部分的至少一部分。
[0053]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，元件的頂表面的至少一部分與垂直于離心管的縱軸線的平面形成5度到75度之間的角?？蛇x地，當插入件定位在離心管中時，元件的頂表面的至少一部分與垂直于離心管的縱軸線的平面形成15度到65度之間、大約15度、大約25度或大約50度的角。
[0054]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，頂部元件的傾斜部分允許第一開口相對于第二開口更靠近離心管的底端。例如，當插入件定位在離心管中時，圖1中所示的插入件的元件12與垂直于離心管的縱軸線的平面形成15度的傾斜。圖4顯示具有圓錐形元件的插入件，當插入件定位在離心管中時，圓錐形元件與垂直于離心管的縱軸線的平面形成15度的傾斜。圖5顯示具有圓錐形元件的插入件，當插入件定位在離心管中時，圓錐形元件與垂直于離心管的縱軸線的平面形成40度的傾斜。
[0055]在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，元件的頂表面的至少一部分具有凹特征。在一個實施例中，凹特征具有圓錐或拋物線或圓錐或拋物線的一部分的形式?？蛇x地，凹特征從元件的周邊上的點傾斜到第一開口。在一個實施例中，當插入件定位在離心管中時，第一開口在凹特征的底部處。例如，圖2和3顯示具有元件的插入件，所述元件具有凹特征，所述凹特征具有從第二開口 218、318到與第二開口在直徑上相對的第一開口 216、316的傾角。圖4和5顯示具有元件的插入件，所述元件具有呈圓錐的形式的凹特征。當插入件定位在管內時允許第一開口相對于一個或多個第二開口定位在下方的附加元件也包括在本描述的范圍內。
[0056]在一個實施例中，當插入件定位在管中時，元件尺寸確定成配合在離心管內并且與離心管的側壁形成干涉配合。在一個實施例中，元件的周邊徑向延伸超出支撐件并且形成凸緣。在一個實施例中，元件和離心管之間的干涉配合防止液體通過元件和離心管之間。在一個實施例中，當插入件定位在管內時，支撐件尺寸確定成配合在離心管內并且與離心管的側壁形成干涉配合。在一個實施例中，支撐件和離心管之間的干涉配合防止液體在離心管的頂部分和底部分之間通過支撐件和離心管之間。
[0057]在一個實施例中，通過注射模制以形成由單件材料制造的插入件來制造本文中所述的插入件。替代地，元件和支撐件可以單獨地制造并且聯(lián)結以形成插入件。在一個實施例中，插入件的全部或部分由硅樹脂、塑料或橡膠或它們的組合制造。在一個實施例中，插入件的全部或部分由高密度聚丙烯、共聚多酯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯或它們的組合制造?？蛇x地，元件的周邊或凸緣由適合與離心管形成干涉配合的彈性材料制造。在一個實施例中，插入件優(yōu)選地由具有比用于分離靶細胞群的DSM的密度大的密度的材料制造。具有不同密度的商用DSM包括Ficoll? (GE Healthcare，密度=1.077g/mL)、RosetteSep DM_L?Stemcell Technologies,加拿大，密度=1.0Slg/mL)、RosetteSepDM-M? (Stemcell Technologies,加拿大，密度=1.085g/mL)、Lymphoprep? (Axis-Shield，挪威，密度=1.077g/mL)、Optiprep?Axis-Shield,挪威，密度=1.32g/mL)、Histopaque?(Sigma-Aldrich,圣路易斯，密蘇里州，密度=1.077、1.019、1.083g/mL)。具有比用于分離革巴細胞群的典型DSM大的密度的合適塑料包括但不限于Tritan (Eastman,金斯波特，田納西州，密度=1.18g/cm3)、聚碳酸酯(Lexan, SABIC Innovative Plastics,沙特阿拉伯,密度=1.2g/cm3)、聚四氟乙烯(Teflon, DuPont,特拉華州，美國，密度=2.2g/cm3)和具有比大約
1.08g/cm3大或更優(yōu)選地比1.lg/cm3大的密度的其它合適的塑料。由具有比DSM大的密度的材料制造的插入件將不在DSM中漂浮。當具有插入件的離心管以高速在離心機中旋轉時，插入件將受到浮力，所述浮力對抗管和插入件之間的干涉配合的力并且可能導致插入件漂浮。漂浮的插入件將不正確地定位在管中，使它對于密度梯度分離無效。在一個實施例中，插入件的密度大于1.08g/cm3。在一個實施例中,插入件的密度大于1.lg/cm3。在一個實施例中，插入件的全部或部分由聚碳酸酯、共聚多酯、聚四氟乙烯或高密度聚丙烯制造。
[0058]盡管具有圓錐形底端的離心管在本領域中通常是優(yōu)選的，但是其它管(例如平底或圓底管)也可以用于本文中所述的插入件。在本領域中通常使用的離心管的例子包括15mL或50mL圓錐形Falcon?牌管(可從美國新澤西州富蘭克林湖的Becton Dickson獲得)、0.5mL圓底Falcon?牌管以及0.5、1.5和2.0mL微離心管(Eppendorf AG，漢堡，德國)。離心管和微離心管的其它廠商包括Corning Lifescience(洛威爾，馬薩諸塞州)和GreinerBio-one (弗里肯豪森,德國)。在一個實施例中，本文中所述的插入件尺寸確定成配合15mL或50mL圓錐形底部離心管。在另一實施例中，插入件尺寸確定成配合5mL管或0.5、1.5和
2.0mL微離心管。
[0059]在本公開的另一方面中，提供一種包括如本文中所述的插入件的離心管。在一個實施例中，插入件與離心管成一體。在一個實施例中，插入件結合到離心管的側壁。在一個實施例中，插入件由與離心管相同的材料制造。
[0060]圖7顯示在密度梯度分離方案的各階段定位在離心管中的插入件的一個實施例。參考圖7A，圖1的插入件顯示為定位在離心管50中，具有元件12、支撐件14、第一開口 16和第二開口 18。管50顯示為用DSM60剛好填充到插入件的頂部之上。包含靶群的樣本70層疊在DSM60的頂部上。在一個實施例中，樣本70被加入管并且完全地或部分地與位于插入件之上的DSM的一部分混合。樣本與插入件的頂表面之上的DSM的混合不會顯著地影響離心期間靶群的分離或樣本和剩余DSM之間的界面的形成。圖7B顯示密度梯度分離和在DSM60和樣本72的剩余體積的界面處的在插入件之上包含靶群的體積74形成之后的管。在一個實施例中，本文中所述的插入件允許插入件之上的體積容易地從離心管去除以回收革巴群。參考圖7C,倒置管導致先前包含在插入件之上的任何體積倒出管,而DSM60和任何非靶細胞保持在離心管50中。盡管圖7C顯示管以180度倒置，但是也能夠以更小的角、例如大于大約90度、大約90到135度或大約112到157度倒置管，以去除包含在插入件之上的流體的體積。
[0061]在另一方面中，提供一種用于從樣本分離靶細胞群的方法。在一個實施例中，所述方法包括:
[0062]a)提供具有如本文中所述的插入件的離心管；
[0063]b)用密度分離介質(DSM)填充離心管的一部分，使得DSM覆蓋插入件的頂部；
[0064]c)將包含靶細胞群的樣本的體積加入離心管，以形成DSM和樣本之間的界面；以及
[0065]d)旋轉離心管以從樣本分離靶細胞群。
[0066]在一個實施例中，靶群包括適合于使用密度梯度分離進行分離的細胞。例如，在一個實施例中，靶細胞群包括選自哺乳動物細胞、干細胞、ES細胞、腫瘤細胞、癌細胞、免疫細胞、造血干細胞和外周血液單核細胞的至少一個細胞類型。在一個實施例中，靶細胞群是白細胞。在一個實施例中，靶細胞群具有小于DSM的密度的平均密度。本領域的技術人員將容易能夠選擇適合用于本文中所述的方法中的DSM以便分離特定靶細胞群。
[0067]在一個實施例中，通過將樣本層疊到DSM上以形成DSM和樣本之間的界面而將包含靶細胞群的樣本的體積加入離心管。例如，可以使用移液管或類似的體積轉移裝置將樣本層疊到離心管中的DSM上。在一個實施例中，將包含靶細胞群的樣本的體積加入離心管，使得樣本與離心管中插入件之上的DSM混合。例如，樣本可以被倒入離心管中。在一個實施例中，樣本沿離心管的側壁向下倒入，以最小化樣本和DSM的混合。技術人員將領會，盡管插入件有助于防止樣本和插入件之下的的DSM之間的混合，但是樣本和插入件之上的DSM的混合將不阻止界面的形成或靶細胞群從樣本的分離。在一個實施例中，樣本完全地或部分地與插入件之上的DSM混合并且界面形成于完全地或部分地與DSM混合的樣本和離心管中的剩余DSM之間。
[0068]在一個實施例中，樣本是包含一個或多個細胞類型的生物樣本。在一個實施例中，樣本是液體，例如外周全血、粘液或腦脊液。在一個實施例中，樣本是包含一個或多個細胞類型的溶液。例如，在一個實施例中，樣本是組織樣本或骨髓，其中細胞已被離解并且存在于溶液中。
[0069]在一個實施例中，方法包括回收靶細胞群。例如在一個實施例中，在旋轉離心管以從樣本分離靶細胞群之后，從DSM和樣本之間的界面之上的樣本的體積回收靶細胞群。
[0070]在一個實施例中，通過倒置離心管以去除離心管中的插入件之上的樣本的體積回收靶細胞群。在一個實施例中，當?shù)怪霉軙r，DSM和沉淀在插入件之下的任何材料保持在離心管中并且不通過元件中的開口流出。可選地，在一個實施例中，樣本是血液樣本，并且在去除靶細胞群之前，通過抽吸或倒置管以倒出DSM和血漿層之間的中間相層從界面層之上去除血漿的體積。
[0071]在一個方面中，本文中所述的方法可以與本領域中已知的方法結合使用，以增強通過密度梯度分離進行的靶群的分離。例如，在一個實施例中，方法包括在旋轉離心管之前例如通過如美國專利N0.6，750, 326中所述的免疫花環(huán)將致密顆粒連接到樣本中的第二細胞群。在一個實施例中，顆粒連接的第二細胞群分離到DSM和樣本的剩余部分之間的界面之下，而靶細胞群分離到DSM和樣本之間的界面。在一個實施例中，致密顆粒選自紅血細胞、娃顆粒、金屬顆粒、金屬氧化物顆粒、聚合物顆粒和玻璃顆粒。在一個實施例中，第二細胞群由特定表面蛋白限定并且致密顆粒通過細胞表面蛋白特異的抗體連接到第二細胞群。
[0072]在另一方面中，本描述提供一種套件，所述套件包括如本文中所述的用于離心管的插入件。在一個實施例中，套件也包括離心管、密度分離介質的體積、將特定細胞連接到致密顆粒的抗體成本和/或用于執(zhí)行如本文中所述的任何方法的印刷手冊。
[0073]以下非限定性例子是本發(fā)明的舉例說明:
[0074]
[0075]例子1:密度梯度分離
[0076]密度梯度分離是公知的程序，其中基于細胞的密度的差異，將細胞分成一個或多個部分。下面概述用于細胞的單間斷密度梯度分離的示例性方案:
[0077]1.用密度梯度溶液(例如，F(xiàn)icoll-Paque, Histopaque)填充離心管達到大約1/3滿。
[0078]2.輕輕地將細胞懸液(例如，全血或細胞懸液)層疊在密度梯度溶液的頂部上。關鍵是最小化細胞懸液和密度梯度溶液之間的混合。對于全血，建議用相同體積的緩沖介質(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))稀釋血液。[0079]3.以400xg離心15分鐘，制動器關閉以限制界面的破壞。
[0080]4.使用移液管從Ficoll-血漿界面小心地去除富集細胞。有時優(yōu)選的是首先去除血漿以在沖洗步驟(5)之前最小化總樣本體積。
[0081]5.使用離心機用5-10 X體積的PBS+2%FBS沖洗富集細胞1_2次。
[0082]例子2:在標準管中使用Ficoll-Paque的免疫花環(huán)
[0083]下面概述使用Ficol1-Hypaque免疫花環(huán)來自外周全血的細胞的示例性陰性選擇
方案:
[0084]1.每mL外周全血加入50uL抗體成分。
[0085]2.在室溫下培養(yǎng)20分鐘。
[0086]3.用相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) +2%胎牛血清(FBS)稀釋樣本并且輕輕地混合。
[0087]4.將稀釋樣本層疊在Ficoll-Hypaque的頂部上或將Ficoll層疊在稀釋樣本之下。
[0088]5.室溫下以1200xg離心20分鐘，制動器關閉。
[0089]6.從Ficoll-血漿界面去除富集細胞。
[0090]7.用5-10 X體積的PBS+2%FBS沖洗富集細胞。
[0091]可選地，對于單核細胞和其它粘附細胞的富集，ImM EDTA可以被加入全血的樣本和所有沖洗/稀釋溶液。
[0092]例子3:具有插入件的現(xiàn)有技術的密度梯度分離管的使用
[0093]Accuspin? (可從 Sigma-Aldrich 獲得)、LeuCOSep?丨(可從德國的 GreinerBio-One GmbH獲得)、UniSep (可從以色列耶路撒冷的Novamed獲得)和ACT Dendreon (以前可從MICRA Scientific公司獲得，并且在美國專利N0.5，840, 502中描述)密度離心管均包含插入件，所述插入件旨在便于樣本的裝載而不破壞分離介質和樣本之間的層。
[0094]這些管必須首先基于管尺寸和插入件的位置裝載適當體積的DSM。一般而言，管然后離心短時間以將DSM驅動到插入件之下。管然后準備好如例如在例子I中所述的標準密度梯度分離方案中那樣使用。使用這些管，通過允許樣本快速地加入DSM簡化例子I的層疊步驟2，原因是它將僅僅與插入件之上的DSM的體積混合。另外，通過允許界面處的細胞通過倒出管而回收來簡化層去除步驟(即，例子I的步驟4)。與標準方法一樣，可能優(yōu)選的是在回收細胞之前首先去除大量血漿。
[0095]例子4:使用具有插入件的現(xiàn)有技術的管的免疫花環(huán)
[0096]美國專利N0.5, 840, 502號所述的ACT Dendreon離心管是標準50mL聚丙烯離心管，具有專門設計用于密度梯度分離的插入件，所述插入件允許用戶通過從管倒出包含細胞的樣本的一部分去除Ficoll-血漿界面處的細胞。使用Dendreon管進行免疫花環(huán)的示例性方案包括以下步驟:
[0097]必要時準備管進行密度梯度分離:
[0098]1.將DSM的推薦體積加入管。
[0099]2.以400g離心5分鐘，F(xiàn)icoll-Paque將填充插入件之下的體積。
[0100]3.通過如例子2中所述的免疫花環(huán)準備血細胞進行陰性選擇。
[0101]4.每mL外周全血加入50uL抗體成分。[0102]5.在室溫下培養(yǎng)20分鐘。
[0103]6.用相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) +2%胎牛血清(FBS)稀釋樣本并且輕輕地混合。
[0104]7.將稀釋血液樣本倒入或層疊到Ficoll-Paque的頂部上。
[0105]8.室溫下以1200xg尚心20分鐘，制動器開啟。
[0106]9.通過移除界面或倒出管插入件之上的體積從Ficoll-血漿界面去除富集細胞。
[0107]10.用5-10 X體積的PBS+2%FBS沖洗富集細胞。
[0108]富集細胞現(xiàn)在準備好進一步使用。
[0109]Vacutainer? CPT?管(BD，新澤西州)具有在Ficoll狀密度分離介質上的凝膠屏障。使用CPT管進行細胞分離遵循相同的一般程序，區(qū)別在于步驟I和2不是必需的，原因是密度分離介質已經在管中保持在凝膠塞之下。
[0110]例子5:使用Ficoll-Paque通過免疫花環(huán)富集CD8+T細胞
[0111]該例子揭示使用例子I和2中所述的方法使用標準50mL管、Dendreon管和CPT管從外周全血富集CD8+T細胞。RosetteS印?CD8+T細胞富集混合物(可從STEMCELLTechnologies獲得)用于比較不同管中的細胞富集。表1中所示的結果揭示對于在標準50mL管、CPT或Dendreon管中執(zhí)行的分離在觀察到的純度和回收率上沒有明顯差異。CPT和Dendreon管初始設計成通過消除兩個耗時的步驟(需要將血液層疊在Ficoll上和需要在離心之后移除界面細胞)提供更方便的密度梯度分離。RosetteSep?免疫花環(huán)試劑有用于通過密度梯度分離選擇特定細胞群。因此，由這些管提供的密度梯度分離的改進也應用于 RosetteSep? 富集。
`[0112]
【權利要求】
1.一種用于離心管的插入件，所述插入件包括: 元件，所述元件尺寸確定成配合在管內以用于將管分成頂部分和底部分，以及 通過所述元件的至少兩個開口，使得當所述插入件定位在所述離心管中時，第一開口相對于第二開口更靠近管的底端。
2.根據(jù)權利要求1所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述第一開口允許所述元件之上的管的頂部分中的空間與所述元件之下的管的底部分中的空間之間的流體連通。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的插入件，其中當管的底端通過所述第一開口填充有液體時，所述第二開口允許空氣從所述元件之下的空間逸出。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的插入件，其中所述至少兩個開口尺寸確定成提供橫越開口的表面張力，從而當?shù)怪霉軙r，防止包含在所述插入件之下的液體流動通過開□。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述第一開口位于所述元件的頂表面的最下部分處。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述第二開口位于 所述元件的頂表面的最高部分處。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的插入件，其中所述至少兩個開口位于所述元件的周邊上。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的插入件，其中所述至少兩個開口中的每一個相對于所述離心管的橫截面積具有小于15%、小于10%或小于5%的面積。
9.根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的插入件，其中所述第一開口比所述第二開口大。
10.根據(jù)權利要求1至9中任一項所述的插入件，其中所述第一開口具有大約Imm到大約5_的直徑，并且所述第二開口具有小于大約2_的直徑。
11.根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的插入件，還包括從所述元件延伸或懸掛的支撐件以用于將所述元件定位在管內。
12.根據(jù)權利要求11所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述支撐件接觸管的底端。
13.根據(jù)權利要求11所述的插入件，其中所述離心管具有圓錐形底端，并且當所述插入件定位在所述離心管中時，所述支撐件接觸所述圓錐形底端。
14.根據(jù)權利要求11至13中任一項所述的插入件，其中當朝著所述離心管的底端向下推動所述插入件時，所述支撐件限制所述元件和管的底端之間的距離。
15.根據(jù)權利要求11至14中任一項所述的插入件，其中當朝著所述離心管的底端向下推動所述插入件時，所述支撐件抵抗壓縮。
16.根據(jù)權利要求11至15中任一項所述的插入件，其中所述支撐件包括從所述元件的底表面延伸的圓柱形側壁。
17.根據(jù)權利要求11至15中任一項所述的插入件，其中所述支撐件包括從所述元件的底表面延伸的一個或多個腿。
18.根據(jù)權利要求1至17中任一項所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述元件的頂表面的至少一部分與垂直于所述離心管的縱軸線的平面形成在5度和75度之間的角。
19.根據(jù)權利要求18所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，從所述第一開口到所述第二開口的所述元件的頂表面與垂直于所述離心管的縱軸線的平面形成在5度和75度之間的角。
20.根據(jù)權利要求18所述的插入件，其中所述角在15度和65度之間。
21.根據(jù)權利要求1至18中任一項所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述元件的頂表面的至少一部分具有凹特征。
22.根據(jù)權利要求21所述的插入件，其中所述凹特征具有圓錐或拋物線或圓錐或拋物線的一部分的形式。
23.根據(jù)權利要求21或22所述的插入件，其中所述凹特征從所述元件的周邊上的點傾斜到第一開口。
24.根據(jù)權利要求1至23中任一項所述的插入件，其中當所述插入件定位在所述離心管中時，所述元件與所述離心管的側壁形成干涉配合。
25.根據(jù)權利要求11至24中任一項所述的插入件，其中所述元件從所述支撐件徑向向外延伸以形成凸緣。
26.根據(jù)權利要求1至25中任一項所述的插入件，其中所述插入件的部分全部由硅樹月旨、塑料或橡膠或它們的組合制造。
27.根據(jù)權利要求1至26中任一項所述的插入件，其中所述插入件的密度大于1.0Sg/3`cm ο
28.根據(jù)權利要求1至26中任一項所述的插入件，其中所述插入件的密度大于1.1g/3cm ο
29.根據(jù)權利要求27或28所述的插入件，其中所述插入件的部分全部由聚碳酸酯、共聚多酯、聚四氟乙烯或高密度聚丙烯制造。
30.根據(jù)權利要求1至29中任一項所述的插入件，其中所述離心管是50mL離心管或15mL離心管。
31.一種離心管，其包括根據(jù)權利要求1至30中任一項所述的插入件。
32.根據(jù)權利要求31所述的離心管，其中所述插入件與所述離心管成一體。
33.一種用于從樣本分離靶細胞群的方法，其包括: a)提供具有根據(jù)權利要求1至30中任一項所述的插入件的離心管； b)用密度分離介質(DSM)填充所述離心管的一部分，使得DSM覆蓋所述插入件的頂部; c)將包含所述靶細胞群的樣本的體積加入所述離心管，以形成DSM和所述樣本之間的界面； d)旋轉所述離心管以從所述樣本分離所述靶細胞群。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中靶群包括選自哺乳動物細胞、干細胞、ES細胞、腫瘤細胞、癌細胞、免疫細胞、造血干細胞和外周血液單核細胞的至少一個細胞類型。
35.根據(jù)權利要求33或34所述的方法，其中所述樣本包括外周全血。
36.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述靶細胞群是白細胞。
37.根據(jù)權利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述靶細胞群具有的平均密度小于所述DSM的密度。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，還包括從DSM和所述樣本之間的界面之上的樣本的體積回收所述靶細胞群。
39.根據(jù)權利要求33至38中任一項所述的方法，還包括倒置所述離心管以從所述離心管去除包括所述靶細胞群的樣本的體積。
40.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述插入件之下的DSM保持在所述離心管中。
41.根據(jù)權利要求33至40中任一項所述的方法，還包括在旋轉所述離心管之前，將致密顆粒連接到所述樣本中的第二細胞群。
42.根據(jù)權利要求41所述的方法，其中顆粒連接的第二細胞群分離到DSM和所述樣本之間的界面之下，并且所述靶細胞群分離到DSM和所述樣本之間的界面。
43.根據(jù)權利要求41或42所述的方法，其中所述致密顆粒選自紅血細胞、硅顆粒、金屬顆粒、金屬氧化物顆粒、聚合物顆粒和玻璃顆粒。
44.根據(jù)權利要求41至43中任一項所述的方法，其中所述第二細胞群由特定表面蛋白限定，并且所述致密顆粒通過細胞表面蛋白特異的抗體連接到所述第二細胞群。
45.根據(jù)權利要求41至44中任一項所述的方法，其中步驟d)包括在離心機中在離心機制動器開啟的情況下在減速期間旋轉所述離心管。
46.一種套件，其包括根據(jù)權利要求1至30中任一項所述的插入件和離心管。
47.根據(jù)權利要求46所述的套件，還包括密度分離介質的體積。
48.根據(jù)權利要求46或47所述的套件，還包括用于執(zhí)行根據(jù)權利要求33至45中任一項所述的方法的印刷手冊。
【文檔編號】B04B15/00GK103619484SQ201280029951
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年5月3日 優(yōu)先權日:2011年5月5日
【發(fā)明者】S·M·伍德賽德 申請人:干細胞技術公司