專利名稱：煙草細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說是一種煙草細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿。
在長期的進化過程中，為了占據(jù)一定的生態(tài)位，植物獲得了通過次生代謝而產(chǎn)生各種次生代謝物質(zhì)的能力。人類對植物次生代謝物質(zhì)的利用有著悠久的歷史，當(dāng)今對植物次生物質(zhì)的研究更是方興未艾。但植物次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量受植物產(chǎn)量和次生物質(zhì)含量的限制，有些次生物質(zhì)在自然界的含量甚微，從而局限了植物次生物質(zhì)的廣泛應(yīng)用。隨著在生物技術(shù)方面取得的長足進步，人們把目光聚集在了如何利用生物技術(shù)以獲得植物次生物質(zhì)的研究上。為此與之有關(guān)的科學(xué)家們開始了不懈的研究和努力，經(jīng)過近幾十年的探索發(fā)現(xiàn)通過植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)可以實現(xiàn)植物次生代謝物質(zhì)有效生產(chǎn)。
通過植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)植物次生代謝物質(zhì)較從天然植物提取及人工仿生合成具有其獨到的優(yōu)點(一)不破壞自然資源；(二)不受地域季節(jié)、土壤、病蟲害等自然因素限制；(三)與化工合成相比，工藝及設(shè)備簡單、節(jié)約能源、產(chǎn)業(yè)投資少，生產(chǎn)過程幾乎沒有環(huán)境污染，對工人安全性高；(四)與從自然植物提取相比，生產(chǎn)周期短、細胞個體差異小、生長人工控制、代謝過程可合理調(diào)整，有利于降低成本、提高產(chǎn)率；(五)對于某些天然物質(zhì)經(jīng)修飾后藥效更好的物質(zhì)，也可通過此技術(shù)獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的修飾物前體；(六)對于分泌到胞外培養(yǎng)液中的活性物質(zhì)，生產(chǎn)則更為方便。在此方面，研究及應(yīng)用非常之多。我國羅士韋采用液體懸浮培養(yǎng)人參細胞，產(chǎn)率可日增一倍，而培養(yǎng)物總?cè)藚⒃磉昂扛哌_10.5％，超過栽培人參的含量(9.6％)，每立方米培養(yǎng)液可獲干參13.98公斤。目前此技術(shù)已進入中試階段。日本Mitsui公司通過對紫草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)尚無法人工合成的紫草素，培養(yǎng)細胞的產(chǎn)率為天然細胞產(chǎn)率1000倍，現(xiàn)在日本紫草來源主要是細胞組織培養(yǎng)。另外雷公藤等許多植物次生代謝產(chǎn)物在生產(chǎn)上均已取得較大的成績，有的培養(yǎng)規(guī)?？蛇_上萬噸。這些實驗及實踐證明，親本植株能合成的次生代謝物質(zhì)都可以通過植物細胞的培養(yǎng)來生產(chǎn)，因而被認為是一條利用生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)(如藥物、天然色素、香料、天然調(diào)味品等)的新的有效途徑。
煙草屬茄科(Sdanaceae)煙屬(Nicotiana)，起源于美洲，煙屬的許多品種含有對人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生獨特作用的煙堿成份，最早記載為美洲印第安人用于宗教儀式和用作醫(yī)藥及生活嗜品(公元650年)。目前煙草分布幾乎遍及世界各地，主式和用作醫(yī)藥及生活嗜品(公元650年)。目前煙草分布幾乎遍及世界各地，主要用來制造卷煙，作為人們的嗜品，而成為世界及我國農(nóng)業(yè)的主要經(jīng)濟作物之一。我國的煙草種植面積及其總產(chǎn)量均居世界首位。據(jù)統(tǒng)計，其種植面積占國土耕地0.7％以上，每年為國家創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟價值。
煙草中的煙堿含有以尼古丁(nicotine)為主的吡啶衍生物，目前已報道的有12種之多，但含量最多(約占該類物質(zhì)總量90％以上)的是尼古丁(C10H14N2)，另外還有兩種相對含量較多的去甲煙堿(C9H12N2)和新煙堿(C10H14N2)，而其它類的生物堿因含量甚微而很少被考慮。由于尼古丁為煙堿的主要成份，所以一般所說的煙堿指的是尼古丁，而“生物煙堿”指的是該類物質(zhì)多種成份的混合物。 在我國，早在清朝道光年間就有用煙草防治水稻螟蟲的記載。現(xiàn)在直接用香煙蒂或其浸液防治家庭花卉常見害蟲的方法，已經(jīng)為民間所廣泛采用。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，煙草中的煙堿可有效地用于農(nóng)業(yè)害蟲防治，其屬于神經(jīng)毒劑，是一廣譜性殺蟲劑，對害蟲具有較強的內(nèi)吸、觸殺和薰蒸等作用，能夠防治多種作物蚜蟲，同時對螨類和多種鱗翅目幼蟲也具有較高的防治效果。目前，已有利用煙草開發(fā)的植物性農(nóng)藥產(chǎn)品應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
目前煙堿的生產(chǎn)僅限于常規(guī)的化學(xué)合成與從天然煙草中提取二種可能的途徑，但此兩種途徑具有其自身不可避免的缺點和局限。
常規(guī)的化學(xué)合成，可通過精細化工生產(chǎn)出單一組份的尼古丁，具有化工生產(chǎn)不可避免的高耗能、環(huán)境污染、三廢處理等一系列問題。而且單一組份的尼古丁用于殺蟲劑又極易產(chǎn)生抗藥性。曾風(fēng)靡一時的煙堿衍生物殺蟲劑吡蟲啉正是因此而有被農(nóng)藥市場所淘汰的趨勢。如果分別合成生物煙堿中的各種有效成分，再按一定比例混配，雖也可制成仿生物煙堿，但生產(chǎn)工藝十分復(fù)雜，成本將成倍增加，顯然是不現(xiàn)實的。
正由于上述原因，目前的所有煙堿生產(chǎn)廠家均采取從天然植物中提取的途徑來生產(chǎn)，還未見任何通過化工途徑生產(chǎn)的報道。從天然植物中提取生產(chǎn)生物煙堿的方法具有其明顯的缺點和局限(一)由于原料全部來自于農(nóng)業(yè)供給，因而在不同程度上受到季節(jié)、氣候、水土、地域及煙草的種植品種、生長狀況等多種因素的制約；(二)原料的獲取必定以使用大量的耕地面積做為代價；(三)有多數(shù)廠家原料采用卷煙廠的下腳料，但由于原料中煙堿含量低而投入多、產(chǎn)出少、成本高而營銷不佳；(四)從植物煙草中提取，一般采取先用無機強堿置換，再用硫酸吸收的工藝，其產(chǎn)品為硫酸煙堿，生產(chǎn)農(nóng)藥時只能加工成水劑，因而嚴重限制了其使用范圍與藥效，使其在實際生產(chǎn)中不能得到充分的應(yīng)用，(五)提取過程中使用的硫酸對生產(chǎn)設(shè)備損壞嚴重，往往每年要更換一次設(shè)備，更加增大了投入與產(chǎn)出的比值。
如果能夠使生物煙堿的生產(chǎn)擺脫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的依賴，避免從天然煙草中提取這一過程的局限，同時又保持其產(chǎn)品的生物源特性，占用相比于大田種植極小的土地及空間，實現(xiàn)對煙堿集約型的工廠化生物生產(chǎn)，對促進煙堿類生物源物質(zhì)在醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用，將會具有重大的現(xiàn)實意義。
本發(fā)明的目的在于針對上述問題，利用植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，通過煙草細胞的大規(guī)模培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿。
本發(fā)明的主要內(nèi)容如下一種煙草細胞系，其特征在于1．以煙草種子為材料，用75％的醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉(zhuǎn)移至0.1％氯化汞水溶液中進行表面消毒，播種于高溫滅菌過的MS基本培養(yǎng)基上，在溫度為25±1℃下光照培養(yǎng)，兩周后得煙草無菌苗。
2．以所獲無菌苗的根、莖、葉等器官為外植體，用表1所述的生長培養(yǎng)基固體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，經(jīng)6周培養(yǎng)，即可在外植體的切口部位形成煙草愈傷組織。3．對所得到的愈傷組織用表1所述的生長培養(yǎng)基進行液體懸浮震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，無光照，每25天繼代一次，繼代培養(yǎng)10-30次，獲得煙草細胞系。
表1為本發(fā)明所用的一步生長培養(yǎng)基和二步生產(chǎn)培養(yǎng)基配方表1 一步生長培養(yǎng)基和二步生產(chǎn)培養(yǎng)基配方表


圖1為本發(fā)明的工藝流程圖以下以實施例形式詳細敘述本發(fā)明的煙草細胞二步法培養(yǎng)生產(chǎn)煙堿的工藝流程(不限于本實施例)實施例170升的植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器煙草細胞二步法培養(yǎng)生產(chǎn)煙堿的方法1．搖床上三角瓶細胞種子的準備(1)按本發(fā)明的生長培養(yǎng)基配方組成(見表1)，配制生長培養(yǎng)基。用pH計測定pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值在5.0-6.0范圍內(nèi)。然后分裝于250ml的三角瓶中，每瓶70-80ml。用封口膜封口后，進行高壓消毒，壓力為1.0-1.2Kg/cm2，時間為15-25分鐘。
(2)以黃花煙草(Nicotiana rustica)細胞系為種源，在超凈工作臺中接種于以上準備好液體生長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)擴增，接種量為5％-10％(w/v)。接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室中的搖床上，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，無光照，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，每15天繼代一次，直至擴增到所需的接種量7升為止。
2．70升植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的系統(tǒng)滅菌及培養(yǎng)基的準備(1)對培養(yǎng)反應(yīng)器的管路及空氣過濾器進行蒸汽消毒消毒蒸汽壓力為1.2-1.4Kg/cm2，時間20-30分鐘。蒸汽消毒結(jié)束，立即用1.5-2.0Kg/cm2的空氣吹干管路及空氣過濾器中的冷凝水，通常需要20-30分鐘，關(guān)閉管路末端閥門以保證管路中的氣體正壓。氣體正壓。
(2)空消對培養(yǎng)反應(yīng)器的培養(yǎng)罐和補料罐進行蒸汽消毒，消毒蒸汽壓力為1.2-1.4Kg/cm2，時間30-40分鐘。蒸汽消毒結(jié)束，待罐體壓力降至0.5Kg/cm2時打開培養(yǎng)罐和補料罐的進氣閥，調(diào)節(jié)罐體出氣閥，以保證罐體中氣體壓力維持在0.3-0.5Kg/cm2的范圍內(nèi)。
(3)實消待培養(yǎng)罐和補料罐的溫度降至70℃以下后，關(guān)閉罐體出氣閥，打開培養(yǎng)罐和補料罐的加料口，向培養(yǎng)罐中加入生長培養(yǎng)基母液及蒸餾水至35-40升，向補料罐中加入生產(chǎn)培養(yǎng)基(見表1)母液及蒸餾水至15-20升，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值在5.0-6.0范圍內(nèi)，關(guān)閉培養(yǎng)罐和補料罐的加料口及進氣閥。通以0.2Kg/cm2的水蒸氣，待罐體壓力升至0.5Kg/cm2時打開培養(yǎng)罐和補料罐的出氣閥，放氣5-10分鐘，隨后微開二者的出氣閥。待罐內(nèi)壓力升至1.2-1.3Kg/cm2時，調(diào)節(jié)水蒸氣進氣閥和培養(yǎng)罐和補料罐的出氣閥以保證罐體中蒸氣壓力維持在1.2-1.3Kg/cm2的范圍內(nèi)，進行高溫實消。25-30分鐘后關(guān)閉水蒸氣進氣閥，打開冷凝水手動閥冷卻罐體，待罐體壓力降至0.5Kg/cm2時打開培養(yǎng)罐和補料罐的出氣閥，調(diào)節(jié)罐體出氣閥，以保證罐體中氣體壓力維持在0.3-0.5Kg/cm2的范圍內(nèi)。
(4)空白培養(yǎng)一周，取罐內(nèi)培養(yǎng)液進行鏡檢驗證系統(tǒng)滅菌效果。
(5)接種將無菌水平送風(fēng)平臺安裝于細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的培養(yǎng)罐罐頂后方(接種口位于罐頂)，無菌水平送風(fēng)20-30分鐘后，關(guān)閉培養(yǎng)罐出氣閥，將培養(yǎng)罐進氣閥開至最大，點燃接種口火圈，打開接種口蓋，將準備好的盛有細胞種源的三角瓶瓶口火焰滅菌，之后通過燃燒著火圈的接種口將細胞種源快速倒入培養(yǎng)罐中，迅速蓋上接種口蓋并旋緊，最后調(diào)節(jié)培養(yǎng)罐進氣閥及出氣閥，保證罐體中氣體壓力維持在0.3-0.5Kg/cm2的范圍內(nèi)。
(6)生長培養(yǎng)及監(jiān)測按本發(fā)明的培養(yǎng)條件，溫度25±1℃，無光照，系統(tǒng)自動控制進行培養(yǎng)，生長培養(yǎng)25天，達到生物量指數(shù)末期，取樣監(jiān)測P/V值達到75％以上即完成一步生長培養(yǎng)。
(7)生產(chǎn)培養(yǎng)及監(jiān)測以帶有細胞過濾裝置的排料管路排盡生長培養(yǎng)基，隨后將補料罐中已滅過菌的的生產(chǎn)培養(yǎng)基經(jīng)無菌管路壓差補入細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，進行生產(chǎn)培養(yǎng)，按本發(fā)明的培養(yǎng)條件，溫度28±1℃，無光照，系統(tǒng)自動控制進行培養(yǎng)，生長培養(yǎng)17-20天，取樣監(jiān)測培養(yǎng)物煙堿含量達到0.2％以上即可完成二步生產(chǎn)培養(yǎng)。(8)將培養(yǎng)物以沒有細胞過濾裝置的排料管路排出，進行煙堿的提取。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
(一)高效，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性；(二)對人、畜、天敵安全性較高；(三)易于被環(huán)境所降解，殘留低。(四)低成本，節(jié)約大量耕地。
實施例2在實驗室小試中，按本發(fā)明的生長培養(yǎng)基配方組成，配制生長培養(yǎng)基，蔗糖濃度20克/升，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值在5.0-6.0范圍內(nèi)。然后分裝于250ml的三角瓶中，每瓶70-80ml。用封口膜封口后，進行高壓消毒，壓力為1.0-1.2Kg/cm2，時間為15-25分鐘。以黃花煙草(Nicotiana rustica)細胞系為種源，在超凈工作臺中接種于以上準備好液體生長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)擴增，接種量為5％-10％(w/v)。接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室中的搖床上，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，無光照，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20天后每瓶細胞鮮重可達45克，將其轉(zhuǎn)至本發(fā)明的生長培養(yǎng)基中(配制過程同生長培養(yǎng)基)，培養(yǎng)條件，溫度28±1℃，無光照，培養(yǎng)15天后每瓶細胞鮮重可達50克左右(P/V值達到55％)，干重5克左右，培養(yǎng)物按ISO2881規(guī)定的方法(水蒸氣蒸餾一紫外分光光度法)測定其煙堿含量可達0.14克左右，煙堿干重含量可達2.8％，略高或接近于大田種植煙草的煙堿含量。
實施例3在70升植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中試中，經(jīng)過二步法的培養(yǎng)，生長培養(yǎng)時間為25天，生產(chǎn)培養(yǎng)時間17-20天，均較實驗室小試略長，但最終的煙堿含量卻與實驗室小試相仿，細胞煙堿干重含量可達2.8％。
實施例4經(jīng)過對本發(fā)明所得的生物煙堿的蚜蟲生物殺蟲活性的測定，其殺蟲效果與從天然煙草中提取的煙堿效果相當(dāng)。
表2本發(fā)明防治蚜蟲田間藥效試驗結(jié)果調(diào)查表2000年7月
權(quán)利要求
1.一種煙草細胞系，其特征在于(1)以煙草種子為材料，用75％的醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉(zhuǎn)移至0.1％氯化汞水溶液中進行表面消毒，播種于高溫滅菌過的MS基本培養(yǎng)基上，在溫度為25±1℃下光照培養(yǎng)，兩周后得煙草無菌苗；(2)以所獲無菌苗的根、莖、葉等器官為外植體，用下述的生長培養(yǎng)基固體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，經(jīng)6周培養(yǎng)，即可在外植體的切口部位形成煙草愈傷組織；(3)對所得到的愈傷組織用下述的生長培養(yǎng)基進行液體懸浮震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，無光照，每25天繼代一次，繼代培養(yǎng)10-30次，獲得煙草細胞系；其中生長培養(yǎng)基組成成分
2．一種煙草的細胞系，其特征在于所用的原始材料為黃花煙草。
3．一種煙草的細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿，包括接種、生長培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)及監(jiān)測步驟，其特征在于所用一步生長培養(yǎng)基和二步生產(chǎn)培養(yǎng)基為
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿,屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明以煙草種子為原始材料,獲得煙草無菌實生苗外植物,對外植體進行誘導(dǎo)培養(yǎng),建立并篩選出了適合通過二步細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿的細胞懸浮體系及其相應(yīng)的生長、生產(chǎn)培養(yǎng)基配方。該方法有培養(yǎng)周期短、產(chǎn)率高、對環(huán)境無污染等特點。
文檔編號C12N5/04GK1283691SQ0012155
公開日2001年2月14日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者張興, 曹陽, 董建新 申請人:西北農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心