專利名稱：接合糖酵母屬的培養(yǎng)基的制作方法
發(fā)明目的本發(fā)明涉及一種鑒別的和選擇性的含有葡萄糖、蟻酸和酸-堿提示劑的培養(yǎng)基，以便48小時之后，在樣品中，檢測拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母，考慮食品變質(zhì)時它們是最危險的菌種，以及采用這種涉及的培養(yǎng)基的拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測方法。本發(fā)明的進一步的目的是涉及的培養(yǎng)基在酵母鑒定試驗途徑(gallery)中的用途。
先有技術(shù)狀況在食品工業(yè)中酵母是增長的問題。設(shè)計以便維持食品感官性能的溫和防腐處理，含改性空氣的包裝，以及新制劑的使用，以避免細菌污染，雖然如此，它們有利于酵母污染。盡管在食品中已經(jīng)檢測到一些致病的酵母菌種，機會菌株對于部分人群是危險的，出現(xiàn)的污染的基本風險不是衛(wèi)生實質(zhì)的一種，但是它是某些酵母，例如拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii andZygosacchromyces bisporus)在食物中的變質(zhì)作用，隨后結(jié)果包括經(jīng)濟損失。
迄今，在種種聚集處(例如食品、自然)的酵母微生物區(qū)系的研究，包括首先菌株分離階段，采用一般的選擇性酵母培養(yǎng)基，和其次的分離菌株的鑒定階段，利用常規(guī)和/或分子生物學基礎(chǔ)的方法。經(jīng)典的的酵母鑒定方法基于系列的營養(yǎng)和有性生殖特征，并且包括大范圍的生理學和生物化學試驗。它是一種要求高的工作，至少一或兩周之后產(chǎn)生結(jié)果，并且需要大量的經(jīng)驗以便恰當?shù)亟忉尳Y(jié)果。分子生物學基礎(chǔ)的方法通常比經(jīng)典方法快，但是它們也需要良好的操作經(jīng)驗值并且包括昂貴的設(shè)備和反應(yīng)物。
有一些商業(yè)上可得到的檢測酒中酵母的培養(yǎng)基，即WallersteinLaboratory Nutrient Medium(Wallerstein實驗室營養(yǎng)培養(yǎng)基)，WLN，用于檢測發(fā)酵酵母，和Wallerstein Laboratory DifferentialMedium(Wallerstein實驗室鑒別培養(yǎng)基)，WLD，它允許檢測乳酸菌和醋酸菌以及屬于非發(fā)酵區(qū)系的酵母(均來自Difco)。然而，這些先有技術(shù)的培養(yǎng)基不能夠區(qū)別酵母，特別是拜列氏接合糖酵母種。
因此需要快速和有效地檢測和鑒定拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的培養(yǎng)基和方法，對于這些菌種快速檢測的常規(guī)技術(shù)它從而是一種選擇性的手段。
發(fā)明介紹令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母，當生長在含有葡萄糖、蟻酸和適當?shù)乃?堿指示劑的培養(yǎng)基時，導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色的迅速改變和在48小時之后染色菌落的形成，這些變化是特征性的和所涉及酵母在涉及的培養(yǎng)基中專有的。
亦發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明的培養(yǎng)基經(jīng)適當?shù)乃?堿指示劑摻入，對于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母是鑒別的，并且對于涉及到的酵母的生長是選擇性的，這取決于培養(yǎng)基中蟻酸的濃度。
從而，按照本發(fā)明，研發(fā)一種新型鑒別的和選擇性的培養(yǎng)基，它允許拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的鑒別，培養(yǎng)48小時之后使人確信的結(jié)果，并且它因此對于這些物種快速檢測的常規(guī)技術(shù)是一種選擇性的手段，允許在包括它們的鑒定的時間和工作上的極大減少。
按照本發(fā)明的培養(yǎng)基包括堿性無機培養(yǎng)基，補充維生素，低量元素，作為唯一碳和能量來源的葡萄糖和蟻酸，適當?shù)乃?堿指示劑，即pKi在4.5和4.8之間的一種，特別是溴甲酚綠，以及選擇性的瓊脂和細菌生長的抗生素抑制劑，例如cloramphenicol。
按照本發(fā)明，培養(yǎng)基中蟻酸的濃度是0.1％至0.5％(v/v)，濃度的選擇取決于培養(yǎng)基是否是選擇性的或者僅僅是鑒別的。
當蟻酸的濃度在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中升高時，適于Z.bailii(拜列氏接合糖酵母)和Z.bisporus(雙孢接合糖酵母)酵母的培養(yǎng)基的選擇性升高，如以下實施例6和7所示，盡管犧牲一定的可辨性。
按照本發(fā)明，葡萄糖濃度是0.05％和0.1％(p/v)，優(yōu)選0，1％(p/v)。
按照本發(fā)明的培養(yǎng)基進一步允許，通過適當條件的選擇，尤其接種方法，樣品中Z.bailii和Z.bisporus酵母的計數(shù)，不考慮其它酵母的存在，由于它是如實施例4和8所示的選擇性的。
在本發(fā)明的一項實施方案中，酸-堿指示劑是溴甲酚綠，它導(dǎo)致培養(yǎng)基為綠色，綠色會由拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母轉(zhuǎn)變成藍色。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基中的所涉及酵母的菌落，染藍色。
在另一項實施方案中，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基可含有細菌生長抑制劑的添加物，尤其適用于含細菌的混合種群的樣品。
本發(fā)明的培養(yǎng)基經(jīng)堿性無機培養(yǎng)基在去離子水中高壓蒸汽滅菌制備。接著冷卻培養(yǎng)基，并且在固化之前，制備成適當溶液的并以前滅菌的葡萄糖、蟻酸、低量元素和維生素在無菌條件下加入。勻化整個培養(yǎng)基并且無菌分散到陪替氏培養(yǎng)皿。
本發(fā)明也涉及到拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測方法，采用按照本發(fā)明的、如以上表征的培養(yǎng)基。
按照本發(fā)明的特征，研發(fā)一種方法，它包括(i)制備按照本發(fā)明的培養(yǎng)基；(ii)以待分析拜列氏接合糖酵母和/或雙孢接合糖酵母的樣品，通過涂布、劃線或通過細胞懸浮液的沉積，接種；(iii)在恒溫箱內(nèi)于適當?shù)臏囟认潞妥銐蚪湍干L的時間(最少48小時)內(nèi)培養(yǎng)；和(iv)觀察培養(yǎng)基顏色的變化和菌落的形成，以便在培養(yǎng)基顏色變化和染色菌落的形成與使用的酸-堿指示劑一致時推斷所涉及的酵母的存在。
本發(fā)明也可與預(yù)先分離和純化的菌株一起使用，關(guān)于采用的接種類型沒有方式上的限制。然而，觀察指示劑轉(zhuǎn)變需要的時間取決于接種物的細胞濃度和接種方法。
亦可以采用本發(fā)明與含有除了拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母之外的混合的酵母種群一起使用，提供有關(guān)這些種存在的的信息，每當檢測到與培養(yǎng)基顏色變化結(jié)合的藍色菌落時。
本發(fā)明的一項目的是提供食品工業(yè)，特別是酒和飲料工業(yè)，拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測方法。通過任何微生物學分析實驗室，這種方法是簡單和易于重復(fù)的。此外，培養(yǎng)基的生產(chǎn)并不需要新的技術(shù)。一經(jīng)制備，這種培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)可立即用于任何工業(yè)設(shè)備或質(zhì)量控制實驗室，由于它不需要不同于負責常規(guī)微生物學分析的非常熟練的人員。
進一步地，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于酵母鑒定的綜合途徑(integrate galeries)。
附圖簡要說明

圖1顯示在按照本發(fā)明的含有葡萄糖(0.1％w/v)和蟻酸(0.3％v/v)的固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)96小時末期一些酵母反應(yīng)的照片(Z.bailiiISA 1265和Z.bailii IGC 3806陽性反應(yīng)；T.delbrueckii(戴爾凱氏有孢賀酵母)ISA 1229和/或I.Orientais(東方伊氏酵母)IGC 3806陰性反應(yīng))。Z.bailii酵母顯示由皿中染藍色的培養(yǎng)基揭露的陽性反應(yīng)，而陰性反應(yīng)由如在培養(yǎng)中未改變的綠色顯示。
圖2顯示在按照本發(fā)明的含有葡萄糖(0.1％w/v)和蟻酸(0.3％v/v)的液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)48小時末期一些酵母的反應(yīng)。培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的所有Z.bailii菌株變成藍色，而其它的保持綠色。
圖3顯示在按照本發(fā)明的含有蟻酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)96小時之后，經(jīng)薄膜過濾法得到的，拜列氏接合糖酵母的形態(tài)學?？捎^測到藍色良好清晰度的菌落。
圖4顯示在按照本發(fā)明的含有蟻酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)96小時之后，經(jīng)薄膜過濾法得到的，S.cerevisiae(啤酒糖酵母)和拜列氏接合糖酵母菌落的形態(tài)學。Z.bailii菌落顯示染藍色，完全不同于染乳色的其它菌落。
圖5顯示在按照本發(fā)明的含有蟻酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)96小時之后，經(jīng)薄膜過濾法得到的，P.membranaefaciens(膜醭畢赤氏酵母)和拜列氏接合糖酵母菌落的形態(tài)學。通過其形態(tài)學和藍色，Z.bailii菌落完全是區(qū)別得出的。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在培養(yǎng)48小時之后，用于樣品中拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母鑒定的鑒別的和選擇性的培養(yǎng)基，含有堿性無機培養(yǎng)基，包括溴甲酚綠作為酸-堿指示劑，補充低量元素和維生素，作為唯一能量和碳源的0.05％至0.1％(w/v)的葡萄糖和0.1％至0.5％(v/v)的蟻酸，和選擇性的瓊脂和細菌生長抑制劑。
在本發(fā)明的實施方案中，在適當條件下培養(yǎng)期間，溴甲酚綠提供培養(yǎng)基經(jīng)拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母作用可轉(zhuǎn)變成藍色的綠色。此外，這些酵母的菌落也會是藍色。培養(yǎng)基顏色的變化是如實施例1和2介紹的這些酵母種的特征，從而允許在樣品中僅僅通過顏色改變檢測其存在。
按照本發(fā)明的方法現(xiàn)通過以下非限制性的實施例舉例說明實施例實施例1本實施例說明按照本發(fā)明的固體培養(yǎng)基的制備，并顯示它在Z.bailii和Z.bisporus的鑒定中是有效的。
制備包括下列成分的培養(yǎng)基表1適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母檢測的培養(yǎng)基組合物化合物濃度(％)堿性培養(yǎng)基 硫酸氨(NH4)2SO40.5(W/V)硫酸二氫鉀KH2PO40.5(W/V)七水合硫酸鎂 MgSO4-7H2O 0.05(W/V)二水合氯化鈣 CaCl2-2H2O 0.013(W/V)溴甲酚綠 C21H14Br4O5S 0.005(W/V)瓊脂 2.0(W/V)葡萄糖 - C6H12O60.1(W/V)蟻酸 - CH2O20.4(V/V)低量元素溶液A(成分按照表2) - 0.05(V/V)低量元素溶液B(成分按照表2) - 0.05(V/V)維生素溶液 (成分按照表2) - 0.05(V/V)表2低量元素和維生素溶液成分化合物濃度(％)低量元素溶液A硼酸 H3BO31.0(W/V)碘化鉀KI 0.2(W/V)二水合鉬酸鈉 Na2MoO4-2H2O 0.4(W/V)低量元素溶液B五水合硫酸銅 CuSO4-5H2O0.08(W/V)六水合氯化鐵 FeCl3-6H2O 0.4(W/V)
六水合硫酸錳 MnSO4-4H2O 0.8(W/V)六水合硫酸鋅 ZnSO4-7H2O 0.8(W/V)鹽酸 HCl10-3N0.8(W/V)維生素溶液維生素H C10H16N2O2S 0.001(W/V)calcium panthotenate C9H16NO5-1/2Ca0.08(W/V)Mioinositol C6H12O64.0(W/V)煙酸 C6H5NO20.16(W/V)維生素B6鹽酸鹽 C6H11NO3-HCl 0.16(W/V)維生素B1鹽酸鹽 C12H17ClN4O2S-HC 0.16(W/V)l這類堿性培養(yǎng)基化合物溶于4/5體積的估計的去離子水，高壓滅菌器在121℃完成20分鐘的滅菌。
其它的培養(yǎng)基化合物(葡萄糖、蟻酸、低量元素溶液A、低量元素溶液B和維生素溶液)溶于剩余體積的水中，以便這些化合物的最終濃度等于表1提及的值。pH必須以1M HCl調(diào)節(jié)至4.5。通過過濾完成滅菌。這種溶液和堿性培養(yǎng)基在一起混合之前退火至50±5℃。勻化整個培養(yǎng)基并分散入陪替氏培養(yǎng)皿。
這種待鑒別的酵母菌株，預(yù)先純化和以一般的酵母培養(yǎng)基接種在瓊脂斜面上(酵母提取物培養(yǎng)基、蛋白胨和葡萄糖)，在28℃培養(yǎng)48小時。一鉑環(huán)量轉(zhuǎn)移至以上制備的含葡萄糖和蟻酸的培養(yǎng)基上。通過劃線進行接種并且在30℃培養(yǎng)48小時的最少時間。選擇性地，以含有等當量的生物量的棉花涂片進行接種。
得到的結(jié)果如表3所示。
表3劃線接種—在含有葡萄糖和蟻酸(0.4％v/v)的培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)48小時之后一些酵母的反應(yīng)種 試驗菌株數(shù) 培養(yǎng)基顏色拜列氏接合糖酵母 15 藍色雙孢接合糖酵母5 藍色Zygosaccharomyees rouxii 3 藍色*弗羅棱接合糖酵母 1 綠色巴揚氏糖酵母 2 綠色啤酒糖酵母21 綠色巴斯德氏糖酵母2 綠色路克氏類糖酵母3 綠色粟酒型殖糖酵母4 綠色膜醭畢赤氏酵母13 綠色Pichia anomala7 綠色Dekkera anomala 3 綠色布魯塞爾德克氏酵母4 綠色漢遜氏德巴利氏酵母2 綠色Issatchenkia orientalis(東方伊氏酵母) 6 綠色馬克斯克魯維氏酵母5 綠色細尖克勒氏酵母1 綠色Lodderomyces elongisporus 2 綠色粘性紅酵母2 綠色戴爾凱氏有孢賀酵母7 綠色*在24-48小時的額外培養(yǎng)期之后，觀察到培養(yǎng)基顏色的變化在所有試驗的Z.bailii菌株中觀察到培養(yǎng)基顏色從綠色改變成藍色。然而，觀察到8個試驗的Z.bailii菌株中3個在另外的24至48小時的培養(yǎng)期之后轉(zhuǎn)變培養(yǎng)基的顏色。對于其它試驗種的所有菌株，觀察到陰性結(jié)果，由于培養(yǎng)基顏色并未改變。
所得的結(jié)果顯示按照本發(fā)明的培養(yǎng)基，對于從培養(yǎng)物直接接種在固體培養(yǎng)基上、至少48小時培養(yǎng)期之后的Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適合的和有效的。
實施例2采用如實施例1相同的步驟，不同之處僅在于以單一菌株細胞懸浮液代替源自固體培養(yǎng)基的細胞，進行接種。這些細胞可源自如實施例1公開的瓊脂斜面。以這樣的方式在去離子水中制備的細胞懸浮液光密度(OD640)在0.7至1.0之間。10μ1滴的這些懸浮液置入含有實施例1公開的培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿表面上。板在30℃培養(yǎng)48小時。
得到的結(jié)果如表4所示。這些結(jié)果類似于實施例1呈現(xiàn)的結(jié)果。
表4在固體培養(yǎng)基表面上涂布細胞懸浮液—在含有葡萄糖和蟻酸(0.4％v/v)的培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)48小時之后一些酵母的反應(yīng)種 試驗菌株數(shù) 培養(yǎng)基顏色拜列氏接合糖酵母 15 藍色雙孢接合糖酵母5藍色Zygosaccharomyces rouxii 3藍色*弗羅棱接合糖酵母 1綠色巴揚氏糖酵母 2綠色啤酒糖酵母21 綠色巴斯德氏糖酵母2綠色路克氏類糖酵母3綠色粟酒型殖糖酵母4綠色膜醭畢赤氏酵母13 綠色Piehia anomala7綠色Dekkera anomala 3綠色布魯塞爾德克氏酵母4綠色漢遜氏德巴利氏酵母2綠色Issatchenkia orientalis(東方伊氏酵母) 6綠色馬克斯克魯維氏酵母5綠色細尖克勒氏酵母1綠色Lodderomyces elongisporus 2綠色粘性紅酵母2綠色戴爾凱氏有孢賀酵母7綠色*在72-96小時的額外培養(yǎng)期之后，觀察到培養(yǎng)基顏色的變化按照本發(fā)明的培養(yǎng)基，對于來自純培養(yǎng)物懸浮液、至少48小時培養(yǎng)期之后的Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適合的和有效的。
實施例3采用如實施例2相同的步驟，但是采用液體形式的培養(yǎng)基。25μl的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移支225μl的實施例1公開的但不含瓊脂的培養(yǎng)基上(包含于微板孔中)，并且以這樣的濃度，以致于在25μl細胞懸浮液加入之后最后濃度等于實施例1公開的濃度。培養(yǎng)條件與實施例2公開的那些相同。此外培養(yǎng)物通過160rpm的機械混合勻化。
得到的結(jié)果如表5所示。這些結(jié)果類似于實施例1呈現(xiàn)的結(jié)果。
表5在液體培養(yǎng)基內(nèi)的細胞懸浮液的培養(yǎng)—在含有葡萄糖和蟻酸(0.4％v/v)的培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)48小時之后一些酵母的反應(yīng)種 試驗菌株數(shù) 培養(yǎng)基顏色拜列氏接合糖酵母 15 藍色雙孢接合糖酵母 5 藍色Zygosaccharomyces rouxii 3 藍色*弗羅棱接合糖酵母 1 綠色巴揚氏糖酵母 2 綠色啤酒糖酵母 21 綠色巴斯德氏糖酵母 2 綠色路克氏類糖酵母 3 綠色粟酒型殖糖酵母 4 綠色膜醭畢赤氏酵母 13 綠色Pichia anomala 7 綠色Dekkera anomala3 綠色布魯塞爾德克氏酵母 4 綠色漢遜氏德巴利氏酵母 2 綠色Issatchenkia orientalis(東方伊氏酵母) 6 綠色馬克斯克魯維氏酵母 5 綠色細尖克勒氏酵母 1 綠色Lodderomyces elongisporus 2 綠色粘性紅酵母 2 綠色戴爾凱氏有孢賀酵母 7 綠色
*在48-72小時的額外培養(yǎng)期之后，觀察到培養(yǎng)基顏色的變化按照本發(fā)明的液體形式的培養(yǎng)基，對于來自純培養(yǎng)物懸浮液、至少48小時培養(yǎng)期之后的Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適合的和有效的。
實施例4本實施例顯示按照本發(fā)明的培養(yǎng)基對于混合酵母種群的樣品中的Z.bailii和Z.bisporus種的酵母是選擇性的。
采用如實施例3的類似步驟，不同之處僅在于采用的細胞懸浮液是純的或混合的(以相等的比例)酵母細胞懸浮液，并且使用薄膜過濾法。細胞懸浮液如實施例2制備。由純培養(yǎng)物懸浮液制備混合的培養(yǎng)物。在這種情形下，采用等分試樣的真空經(jīng)滅菌過濾薄膜(0.45μm孔)過濾的適當?shù)叵♂屵^的懸浮液完成接種，濾液接著置于陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)，在實施例1公開的培養(yǎng)基表面上含有濾液的皿于30℃培養(yǎng)96小時。作為參照的培養(yǎng)基(對應(yīng)100％的回收率)，采用一般的酵母培養(yǎng)基(酵母提取物培養(yǎng)基，蛋白胨和葡萄糖)。
所得的結(jié)果如表6所示。如實施例1中公開的Z.bailii細胞的回收率大約是60至70％，不考慮其它酵母種的存在。由于S.cerevisiae、P.membranaefaciens和D.anomala的回收率顯著地減少，低于0.01％，顯示這種培養(yǎng)基是較高選擇性的。
S.cerevisiae、P.membranaefaciens和D.anomala是酒中污染菌種的代表性實施例，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基對于已污染的酒樣品的Z.bailii的鑒定是有用和適當?shù)摹?br> 表6通過薄膜過濾法在30℃培養(yǎng)96小時之后的回收率(％)種 Z.bailii回收率拜列氏接合糖酵母 65拜列氏接合糖酵母 57啤酒糖酵母 n.d拜列氏接合糖酵母 67膜醭畢赤氏酵母 n.d.Dekkera anomalan.d啤酒糖酵母 ＜0,002膜醭畢赤氏酵母 0,011Dekkera anomala＜0,004n.d.未檢測到圖3、4和5顯示在純和混合培養(yǎng)物內(nèi)的不同種菌落的形態(tài)學，僅僅采用菌落顏色和形態(tài)學在3個種之間是顯著的，易鑒別。
在一些情形下，存在染淺藍色或染深藍色的非典型的菌落(ca.2-3％)。這些中的第一種(圖4)，具有類似于S.cerevisiae的形態(tài)學，被判定屬于該物種。這些菌落中染淺色的歸因于在由Z.bailii的存在誘導(dǎo)的顏色改變之后指示劑的摻入。第二類的菌落(圖5)，具有類似于P.membranaefaciens的形態(tài)學，被判定屬于該物種，染深色歸因于在由Z.bailii的存在誘導(dǎo)的顏色改變之后，這些細胞對指示劑的高親合力。對于P.membranaefaciens培養(yǎng)物同樣地觀察到這種特征，它與在這些條件下顯示染乳綠色的S.cerevisiae的那些相比，顯示染極深的綠色。然而，在那些菌落中鑒別是清楚的，因為在附圖4和5中可觀察到。
實施例5本實施例顯示按照本發(fā)明的培養(yǎng)基的鑒別力和酒樣品中Z.bailii細胞的計數(shù)。
采用膜過濾法進行酒樣中Z.bailii細胞的計數(shù)(按照實施例4公開的方法)。對于每ml酒菌落形成單位(CFU)的數(shù)量的測定，在30℃的溫度培養(yǎng)96小時之后進行。平行試驗?zāi)壳安捎玫挠糜诰浦薪湍笝z測的其它的商業(yè)培養(yǎng)基(Wallerstein實驗室鑒別培養(yǎng)基，WLD，和Wallerstein實驗室營養(yǎng)培養(yǎng)基，WLN，均由Difco銷售)。WLN培養(yǎng)基用于發(fā)酵酵母的檢測，而WLD培養(yǎng)基適于乳酸菌和醋酸菌以及屬于非發(fā)酵區(qū)系的酵母的檢測。
表7總結(jié)了結(jié)果表7在2種污染過的酒中CFU的數(shù)量/ml，通過在含有葡萄糖和蟻酸(0.4％v/v)的培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)96小時后薄膜過濾法得到培養(yǎng)基 酒1 酒2實施例1公開的培養(yǎng)基 75(1)90(1)+170(2)WLN 685 620WLD 10200(1)乳-淡黃色菌落(2)藍色菌落，典型為Z.bailii屬于或不屬于Z.bailii的藍色菌落和乳-淡黃色菌落的鑒定通過分子方法確認。
實施例1描述的培養(yǎng)基是一種理想的培養(yǎng)基，適于拜列氏接合糖酵母種酵母的分離，可僅僅通過顏色鑒別該酵母和其它酵母種。WLN和WLD培養(yǎng)基并不顯示屬于本發(fā)明培養(yǎng)基的特征的鑒別力。這種性能使得這種培養(yǎng)基優(yōu)于目前那些商業(yè)上可得到的。
實施例6本實施例顯示在按照本發(fā)明的固體培養(yǎng)基中蟻酸濃度的作用。
如實施例1制備培養(yǎng)基，但是采用不同濃度的蟻酸，以如表8所示的各種酵母菌株按實施例2介紹的相同步驟進行接種。
所得的結(jié)果如表8所示。較低的蟻酸濃度觀察到屬于Z.bailii和Z.bisporus種的所有菌株的固體培養(yǎng)基的堿化。濃度的升高對于3種Z.bailii菌株導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色的緩慢變化。試驗的其它種的菌株未誘導(dǎo)培養(yǎng)基顏色的變化。
表8細胞懸浮液滴加在固體培養(yǎng)基表面—含有葡萄糖和不同濃度蟻酸的培養(yǎng)基內(nèi)一些酵母在30℃培養(yǎng)48小時之后的反應(yīng)種試驗菌株數(shù) 培養(yǎng)基顏色蟻酸0,3％(v/v)蟻酸0,5％(v/v)拜列氏接合糖酵母 12 藍色 藍色拜列氏接合糖酵母 3 藍色 藍色*雙孢接合糖酵母8 藍色 n.d.弗羅棱接合糖酵母 1 綠色 綠色巴揚氏糖酵母 2 綠色 綠色啤酒糖酵母21 綠色 綠色巴斯德氏糖酵母2 綠色 綠色膜醭畢赤氏酵母13 綠色 綠色漢遜氏德巴利氏酵母2 綠色 綠色*在額外48-72小時的培養(yǎng)期之后觀察到培養(yǎng)基顏色的變化n.d.未觀察到本培養(yǎng)基因此對于從純培養(yǎng)物懸浮液滴加至固體培養(yǎng)基表面，在所有蟻酸試驗濃度下，48小時的最少培養(yǎng)期之后，Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適合和有效的。得到的結(jié)果顯示對于0,3％蟻酸濃度，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基對于由純培養(yǎng)物懸液接種至液體培養(yǎng)基，在48小時的最少培養(yǎng)期之后，Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適當和有效的。對于在含0,5％蟻酸濃度的培養(yǎng)基上Z.bailii的檢測同樣有效。兩種濃度適于保證其它試驗種的陰性反應(yīng)。然而，含0.5％(v/v)蟻酸的培養(yǎng)基并不是最適合的檢測對酸性環(huán)境顯示較低耐受性的Z.bailii的那種。
實施例7本實施例顯示蟻酸濃度在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中的作用。
如實施例3制備一種培養(yǎng)基，但是采用不同濃度的蟻酸，以如表9所示的各種酵母菌株按實施例3介紹的相同步驟進行接種。
這些所得的結(jié)果類似于實施例6的結(jié)果并且如表9所示。圖2顯示屬于和不屬于Z.bailii種的酵母菌株的典型反應(yīng)。
表9液體培養(yǎng)基內(nèi)細胞懸浮液的接種—含有葡萄糖和不同濃度蟻酸的培養(yǎng)基內(nèi)一些酵母在30℃培養(yǎng)48小時之后的反應(yīng)種 試驗菌株數(shù) 培養(yǎng)基顏色蟻酸0,3％(v/v)蟻酸0,5％(v/v)拜列氏接合糖酵母 12 藍色 藍色拜列氏接合糖酵母 3 藍色 藍色*雙孢接合糖酵母8 藍色 n.d.弗羅棱接合糖酵母 1 綠色 綠色巴揚氏糖酵母 2 綠色 綠色啤酒糖酵母21 綠色 綠色巴斯德氏糖酵母2 綠色 綠色膜醭畢赤氏酵母13 綠色 綠色漢遜氏德巴利氏酵母2 綠色 綠色*在額外48-72小時的培養(yǎng)期之后觀察到培養(yǎng)基顏色的變化n.d.未觀察到如實施例6，所得的結(jié)果顯示，對于0,3％蟻酸濃度，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基，對于由純培養(yǎng)物懸液接種至液體培養(yǎng)基，在48小時的最少培養(yǎng)期之后，Z.bailii和Z.bisporus的檢測是適當和有效的。對于在含0,5％蟻酸濃度的培養(yǎng)基上Z.bailii的檢測同樣有效。
實施列8本實施例顯示在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基上蟻酸濃度對于培養(yǎng)基選擇性的影響。采用實施例4的步驟，但是在培養(yǎng)基上采用不同濃度的蟻酸。
所得的結(jié)果如表10所示。這些結(jié)果和實施例4的結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中的Z.bailii細胞的回收率隨蟻酸濃度的升高而下降，與那些可以在污染過的酒中發(fā)現(xiàn)的其它的酵母種的存在無關(guān)。對于這些其它的3種試驗的種之中的2種，回收率亦隨蟻酸濃度的升高而下降。
表10在30℃培養(yǎng)96小時之后經(jīng)薄膜過濾法得到的回收率種 Z.bailii回收率蟻酸0.2％ 蟻酸0.3％ 蟻酸0.5％拜列氏接合糖酵母 827842拜列氏接合糖酵母 828135啤酒糖酵母 n.d.拜列氏接合糖酵母 999434膜醭畢赤氏酵母n.d. n.d. n.d.Dekkera anomala n.d. n.d. n.d.啤酒糖酵母304 ＜0.002膜醭畢赤氏酵母555.9 ＜0.004Dekkera anomala ＜0.004 ＜0.004 ＜0.004n.d.未檢測到因而，顯示按照本發(fā)明的培養(yǎng)基具有選擇性和鑒別培養(yǎng)基的特征，它適合于在或者含有這些酵母中預(yù)先分離出的菌株或者含有混合酵母種群的樣品中，拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測、鑒定和計數(shù)并且非常有效。較低的蟻酸濃度提供培養(yǎng)基顯著的鑒別力，盡管具有較低的選擇性。另一方面，對于較高的蟻酸濃度，培養(yǎng)基是較高選擇性的。
這種培養(yǎng)基也可以補充細菌生長抑制劑，它有益于采用亦包括細菌的混合種群的樣品，例如食品和飲料。
盡管基于其優(yōu)選的實施方案介紹本發(fā)明，在附加的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)可能的變動和修正對于本領(lǐng)域的任何熟練技術(shù)人員是明顯的。
按照條約第19條的修改1.一種適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的鑒別的和選擇性的培養(yǎng)基，特征在于它包括補充了維生素，低量元素，作為唯一碳和能量來源的葡萄糖和蟻酸，適當?shù)乃?堿指示劑以及，選擇性的細菌生長抗生素抑制劑和瓊脂的堿性無機培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于葡萄糖濃度為0.05％至0.1％(p/v)，優(yōu)選0.1％(p/v)。
3.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于取決于希望的鑒定力和選擇性的甲酸濃度是0.1％至0.5％(v/v)，優(yōu)選0.2％至0.4％(v/v)。
4.按照權(quán)利要求3的培養(yǎng)基，特征在于甲酸濃度優(yōu)選0.4％(v/v)。
5.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于堿性無機培養(yǎng)基包括硫酸銨(0.5％(w/v))，硫酸二氫鉀(0.5％(w/v))，七水合硫酸鎂(0.05％(w/v))和二水合氯化鈣(0.013％(w/v))；低量元素溶液A(0.05％(v/v))包括硼酸(1.0％(w/v))，碘化鉀(0.2％(w/v))和二水合鉬酸鈉(0.4％(w/v))；低量元素溶液B(0.05％(v/v))包括五水合硫酸銅(0.08％(w/v))，六水合氯化鐵(0.4％(w/v))，四水合硫酸錳(0.8％(w/v))，七水合硫酸亞錫(0.8％(w/v))和鹽酸(HCl 10-3N，0.8％(v/v))；并且維生素溶液(0.05％(v/v))包括維生素H(0.001％(w/v))，calciumpanthotenate(0.08％(w/v))，mioinositol(4.0％(w/v))，煙酸(0.16％(w/v))，維生素B6鹽酸鹽(0.16％(w/v))和維生素B1鹽酸鹽(0.16％(w/v))。
6.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于酸-堿指示劑是具有4.5至4.8之間的pKi的一種，優(yōu)選溴甲酚綠。
7.權(quán)利要求6的培養(yǎng)基，特征在于調(diào)節(jié)pH至4.3-4.8，優(yōu)選4.5。
8.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于它進一步地含有常規(guī)使用濃度的抑菌目的的細菌生長抗生素抑制劑，以便與混合種群的含有細菌的樣品一起使用。
9.按照任何的前述權(quán)利要求的培養(yǎng)基，特征在于它含有除了瓊脂之外的所有組分，它是液體形式。
10.適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的鑒別的和選擇性培養(yǎng)基，特征在于它由以下組成葡萄糖 0.1％(w/v)蟻酸 0.4％(v/v)堿性培養(yǎng)基硫酸銨 0.5％(w/v)硫酸二氫鉀 0.5％(w/v)七水合硫酸鎂 0.05％(w/v)二水合氯化鈣 0.013％(w/v)溴甲酚綠 0.005％(w/v)瓊脂 2.0％(w/v)低量元素溶液A 0.05％(v/v)硼酸 1.0％(w/v)碘化鉀 0.2％(w/v)二水合鉬酸鈉 0.4％(w/v)低量元素溶液B 0.05％(v/v)五水合硫酸銅 0.08％(w/v)六水合氯化鐵 0.4％(w/v)四水合硫酸錳 0.8％(w/v)七水合硫酸亞錫 0.8％(w/v)鹽酸，HCl 10-3N， 0.8％(v/v)維生素溶液 0.05％(v/v)維生素H0.001％(w/v)Calcium panthotenate 0.08％(w/v)Mioinositol4.0％(w/v)煙酸 0.16％(w/v)維生素B6鹽酸鹽0.16％(w/v)維生素B1鹽酸鹽0.16％(w/v)]以1M HCl調(diào)節(jié)pH至pH4.6。
11.按照任何前述權(quán)利要求的培養(yǎng)基，特征在于該培養(yǎng)基如下制備堿性培養(yǎng)基化合物溶于4/5體積的估計的去離子水，高壓滅菌器在121℃完成20分鐘的滅菌，其它的培養(yǎng)基化合物溶于剩余體積的水中，以便這些化合物的最終濃度等于預(yù)計的值，通過過濾完成滅菌，這種溶液和堿性培養(yǎng)基在其混合之前退火至50±5℃，調(diào)節(jié)最后的pH至預(yù)計值。
12.拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測方法，特征在于采用適于涉及到的酵母種的鑒別和選擇性的培養(yǎng)基，它包括以維生素、低量元素、作為唯一碳和能量來源的葡萄糖和蟻酸，適當?shù)乃?堿指示劑以及，選擇性的細菌生長抗生素抑制劑和瓊脂補充的堿性無機培養(yǎng)基。
13.權(quán)利要求12的方法，特征在于酸-堿指示劑是溴甲酚綠，以及涉及到培養(yǎng)基接種含有拜列氏接合糖酵母和/或雙孢接合糖酵母的樣品并且在適合涉及到的酵母生長的條件下培養(yǎng)，通過在大約48小時之后培養(yǎng)基顏色由綠至藍的變化推斷所述酵母種的存在是可行的，并且如果需要，在大約96小時之后通過染藍色菌落的發(fā)育可對所述的酶母種計數(shù)。
14.按照權(quán)利要求12和13的方法，特征在于它應(yīng)用至酒以及其它含有或無混合酵母群落的飲料或食品中拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母種酵母的檢測和計數(shù)。
15.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基被包括在酵母鑒定途徑中的應(yīng)用。
16.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基在工業(yè)，尤其在食品和飲料工業(yè)中質(zhì)量和過程控制中的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的鑒別和選擇性的培養(yǎng)基，特征在于它包括補充了維生素，低量元素，作為唯一碳和能量來源的葡萄糖和蟻酸，適當?shù)乃?堿指示劑以及，選擇性的細菌生長抗生素抑制劑和瓊脂的堿性無機培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于葡萄糖濃度為0.05％至0.1％(p/v)，優(yōu)選0.1％(p/v)。
3.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于取決于希望的鑒別力和選擇性的甲酸濃度是0.1％至0.5％(v/v)，優(yōu)選0.2％至0.4％(v/v)，更優(yōu)選0.4％(v/v)。
4.按照權(quán)利要求3的培養(yǎng)基，特征在于甲酸濃度優(yōu)選0.4％(v/v)。
5.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于堿性無機培養(yǎng)基包括硫酸銨(0.5％(w/v))，硫酸二氫鉀(0.5％(w/v))，七水合硫酸鎂(0.05％(w/v))和二水合氯化鈣(0.013％(w/v))；低量元素溶液A(0.05％(v/v))包括硼酸(1.0％(w/v))，碘化鉀(0.2％(w/v))和二水合鉬酸鈉(0.4％(w/v))；低量元素溶液B(0.05％(v/v))包括五水合硫酸銅(0.08％(w/v))，六水合氯化鐵(0.4％(w/v))，六水合硫酸錳(0.8％(w/v))，六水合硫酸亞錫(0.8％(w/v))和鹽酸(HCl 10-3N，0.8％(v/v))；并且維生素溶液(0.05％(v/v))包括維生素H(0.001％(w/v))，calciumpanthotenate(0.08％(w/v))，mioinositol(4.0％(w/v))，煙酸(0.16％(w/v))，維生素B6鹽酸鹽(0.16％(w/v))和維生素B1鹽酸鹽(0.16％(w/v))。
6.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于酸-堿指示劑是具有4.5至4.8之間的pKi的一種，優(yōu)選溴甲酚綠。
7.權(quán)利要求6的培養(yǎng)基，特征在于調(diào)節(jié)pH至4.3-4.8，優(yōu)選4.5。
8.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，特征在于它進一步地含有常規(guī)使用濃度的抑菌目的的細菌生長抗生素抑制劑，以便與混合種群的含有細菌的樣品一起使用。
9.按照任何的前述權(quán)利要求的培養(yǎng)基，特征在于它含有除了瓊脂之外的所有組分，它是液體形式。
10.適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的鑒別的和選擇性培養(yǎng)基，特征在于它由以下組成葡萄糖 0.1％(w/v)蟻酸 0.4％(v/v)堿性培養(yǎng)基硫酸銨 0.5％(w/v)硫酸二氫鉀 0.5％(w/v)七水合硫酸鎂 0.05％(w/v)二水合氯化鈣 0.013％(w/v)溴甲酚綠 0.005％(w/v)瓊脂 2.0％(w/v)低量元素溶液A0.05％(v/v)硼酸 1.0％(w/v)碘化鉀 0.2％(w/v)二水合鉬酸鈉 0.4％(w/v)低量元素溶液B0.05％(v/v)五水合硫酸銅 0.08％(w/v)六水合氯化鐵 0.4％(w/v)六水合硫酸錳 0.8％(w/v)六水合硫酸亞錫 0.8％(w/v)鹽酸，HCl 10-3N，0.8％(v/v)維生素溶液 0.05％(v/v)維生素H 0.001％(w/v)Calcium panthotenate 0.08％(w/v)Mioinositol 4.0％(w/v)煙酸 0.16％(w/v)維生素B6鹽酸鹽 0.16％(w/v)維生素B1鹽酸鹽 0.16％(w/v)]以1M HCl調(diào)節(jié)pH至pH4.6。
11.按照任何前述權(quán)利要求的培養(yǎng)基，特征在于該培養(yǎng)基如下制備堿性培養(yǎng)基化合物溶于4/5體積的估計的去離子水，高壓滅菌器在121℃完成20分鐘的滅菌，其它的培養(yǎng)基化合物溶于剩余體積的水中，以便這些化合物的最終濃度等于預(yù)計的值，通過過濾完成滅菌，這種溶液和堿性培養(yǎng)基在其混合之前退火至50±5℃，調(diào)節(jié)最后的pH至預(yù)計值。
12.拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測方法，特征在于采用適于所涉及酵母種的鑒別和選擇性的培養(yǎng)基，它包括以維生素，低量元素，作為唯一碳和能量來源的葡萄糖和蟻酸，適當?shù)乃?堿指示劑以及，選擇性的細菌生長抗生素抑制劑和瓊脂補充的堿性無機培養(yǎng)基。
13.權(quán)利要求12的方法，特征在于酸-堿指示劑是溴甲酚綠，以及涉及到培養(yǎng)基接種含有拜列氏接合糖酵母和/或雙孢接合糖酵母的樣品并且在適合涉及到的酵母生長的條件下培養(yǎng)，通過在大約48小時之后培養(yǎng)基顏色由綠至藍的變化推斷所述酵母種的存在是可行的，并且如果需要，在大約96小時之后通過染藍色菌落的發(fā)育可對所述的酶母種計數(shù)。
14.按照權(quán)利要求12和13的方法，特征在于它應(yīng)用至酒以及其它含有或無混合酵母群落的飲料或食品中拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母種酵母的檢測和計數(shù)。
15.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基被包括在酵母鑒定途徑中的應(yīng)用。
16.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基在工業(yè)，尤其在食品和飲料工業(yè)中質(zhì)量和過程控制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及到適于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母種酵母檢測、時間上極大減少并且工作通常包含于這些種常規(guī)檢測之中的鑒別和選擇性的培養(yǎng)基。按照本發(fā)明,拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的檢測以一種單一的、僅需要制備一種液體或固體培養(yǎng)基和接種試驗完成。這種培養(yǎng)基包括堿性無機培養(yǎng)基,它以低量元素和維生素,作為唯一的能量和碳源的葡萄糖和蟻酸,和酸－堿指示劑補充。酸－堿指示劑,特別是溴甲酚綠,提供培養(yǎng)基綠色染色,它在上述的酵母作用下會轉(zhuǎn)變成藍色。另外,菌落呈現(xiàn)的藍色是這些菌種的專一特征,并且在取決于采用的接種方法的48至96小時的培養(yǎng)之后可被觀察到。本發(fā)明可與或者預(yù)先分離和純化過的酵母,或者含有不同于拜列氏接合糖酵母和雙孢接合糖酵母的其它酵母的細胞懸浮液一起使用,以便在食品工業(yè)檢測這些菌種,即在酒類和其它飲料中。這種培養(yǎng)基也包含于酵母鑒定試驗的途徑中。
文檔編號C12N1/16GK1367842SQ00808263
公開日2002年9月4日 申請日期2000年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月31日
發(fā)明者C·萊昂, M·科特雷亞爾, D·舒勒 申請人:米尼翁大學, Stabvida生物科學調(diào)查與服務(wù)股份有限公司