專利名稱：：賦予對黃單胞菌引起的細(xì)菌性黑枯病的抗性的來自水稻的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)以及在植物中賦予對細(xì)菌性疾病的抗性的核酸和方法。本申請中用于闡明本發(fā)明的背景或提供關(guān)于實施的補充細(xì)節(jié)的出版物和其他材料通過引用被合并到本發(fā)明中，且為便于參考被列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)中。
背景技術(shù)：
：在植物與病原體的相互作用的協(xié)同進化過程中已經(jīng)發(fā)展出來的一種重要的植物防御機制是所謂的基因?qū)虻南嗷プ饔媚Ｐ?Flor，1P71)。按照這一模型的簡單構(gòu)成，植物抗性(R)基因編碼由來自病原體的無毒(Avr)基因所產(chǎn)生的分子信號的特異性受體。然后，繼發(fā)信號傳導(dǎo)途徑將所述信號運送到一組引發(fā)宿主防御的下游基因(Dangl，2001)。R基因介導(dǎo)的防御典型地涉及快速、局部壞死，或感染部位的過敏反應(yīng)(HR)，且在局部形成限制病原體的生長的抗菌化合物和蛋白質(zhì)(Greenberg，1997)。已經(jīng)從雙子葉植物已經(jīng)克隆和表征了眾多的R基因(hulbert等，2001)。然而，從對人類的食物供應(yīng)和家畜的飼料供應(yīng)有重要貢獻(xiàn)的谷物中僅克隆到幾個R基因，其部分原因在于這些農(nóng)作物中的絕大多數(shù)具有復(fù)雜的基因組。在水稻(Oryzasativa)中，第一個被克隆的R基因是Xa21細(xì)菌性黑枯病R基因，其編碼一種具有推定的胞外受體和胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(Songetal.1995；US專利5,859,339)。三個其它的水稻R基因，即Xal細(xì)菌性黑枯病R基因(Yoshmuraetal.，1998)和兩個稻瘟病R基因，即Pi-b(Wangetal.，1999)和Pi-ta(Bryanetal.，2000；US專利6,479,731B1)，編碼具有核苷酸結(jié)合位點的推定的胞質(zhì)受體蛋白。在酵母雙雜交系統(tǒng)和體外結(jié)合試驗中，Pita蛋白還都顯示出與AVR-Pi-ta蛋白的特異性物理互作(Jiaetal.，2000)。黃單胞菌引起的細(xì)菌性黑枯(BB)病幾乎影響所有的農(nóng)作物，并導(dǎo)致全世界范圍的廣泛的作物損失。在水稻中，由水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepvoryzae(Xoo))引起的細(xì)菌性黑枯病已經(jīng)成為水稻中最為嚴(yán)重的疾病之一，影響了整個亞洲、澳大利亞北部、非洲大陸、美國南部和拉丁美洲的灌溉和雨水灌溉的低地生態(tài)系統(tǒng)的產(chǎn)量。由于該疾病導(dǎo)致的產(chǎn)量損失的范圍在20-30％(Ou，1985)。迄今為止，對水稻細(xì)菌性黑枯病的最好控制是品種抗性的使用。已經(jīng)鑒定到了超過20個抗細(xì)菌性黑枯病的R基因(Kinoshita1995；Linetal.，1996；Zhangetal.，1998；Khushetal.，1999；Gaoetal.，2001)，并已經(jīng)克隆了2個R基因，Xa21和Xa1。Xa21起源于野生型種非洲長花藥野生稻(Oryzalongistaminata)，并在轉(zhuǎn)基因植物中賦予對多個Xoo分離株的抗性(Wangetal.，1996)，而Xal賦予對日本Xoo的小種1菌株的高水平小種特異性抗性(Yoshmuraetal.，1998)。從栽培水稻(O.sativaov)IR31917-45-3-2(IR31917)和野生水稻種小粒稻(Oryzaminuta)Acc.101141(Amante-Bordeosetal.，1992)的雜種的BC2植物(植物78-1)鑒定到一個新的抗BB位點。這一報道也表明單一基因或緊密連鎖基因賦予對來自菲律賓的BB病原體的Xoo菌株P(guān)XO99(小種6)的小種特異性抗性。
發(fā)明內(nèi)容在一個實施方式中，本發(fā)明提供了對編碼抗性基因Xa31的基因的克隆和表征，所述基因賦予對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述抗性是對由黃單胞菌引起的細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種包含SEQIDNO1的核酸的組合物，其中所述序列賦予被所述核酸轉(zhuǎn)染的植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了與SEQIDNO1基本同源的變體或在嚴(yán)格條件下與所述序列雜交的核酸，并且所述核酸賦予被所述核酸轉(zhuǎn)染的植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種核酸，其包含SEQIDNO1的至少100個連續(xù)堿基對并賦予被所述核酸轉(zhuǎn)染的植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括將SEQIDNO1的核酸轉(zhuǎn)染到所述植物中，或?qū)⑺龊怂徂D(zhuǎn)染到植物細(xì)胞中，并從所述植物細(xì)胞生長出植物，其中所述核酸當(dāng)被轉(zhuǎn)染到對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物中時賦予該植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法包括將SEQIDNO1的至少100個堿基對的核酸片段轉(zhuǎn)染到所述植物中，其中所述片段當(dāng)被轉(zhuǎn)染到對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物中時賦予該植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種或多種選自以下一組的核酸SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52，其中當(dāng)所述一種或多種核酸被轉(zhuǎn)染到對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物中時賦予該植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了一種或多種與所述核酸基本同源的變體。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括將選自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52構(gòu)成的組的至少一種核酸轉(zhuǎn)染到所述植物中，或轉(zhuǎn)染到對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物細(xì)胞中，并從其生長出植物。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括用SEQIDNO1的至少100個連續(xù)堿基對的片段轉(zhuǎn)染植物，所述片段賦予對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括用SEQIDNO1的至少100個連續(xù)堿基對的片段轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，并從所述植物細(xì)胞生長出植物，所述片段賦予對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種包含一種分離的核酸或所述分離的核酸的基本同源的變體的組合物，所述分離的核酸編碼如SEQIDNO5所示的多肽或其片段。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括在所述植物中表達(dá)編碼SEQIDNO5的核酸。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，包括將本發(fā)明的一種或多種核酸轉(zhuǎn)染到植物細(xì)胞中，并從所述細(xì)胞生長出植物。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了載體(其在一個優(yōu)選的實施方式中為表達(dá)載體)、細(xì)胞(其在一個優(yōu)選的實施方式中為植物細(xì)胞)和/或植物，其中任一個可以包含本發(fā)明的核酸。在其它實施方式中，所述載體、細(xì)胞和植物可以包含片段或基本同源的序列，所述片段或基本同源的序列將在嚴(yán)格條件下與所述序列雜交且當(dāng)被轉(zhuǎn)染到對細(xì)菌性黑枯病沒有抗性的植物中時賦予該植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物由SEQIDNO1的核酸所轉(zhuǎn)染，且其中所述植物對細(xì)菌性黑枯病具有抗性。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物由編碼SEQIDNO5的多肽的核酸所轉(zhuǎn)染，其中所述多肽在所述植物中被表達(dá)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種由編碼所述多肽的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述多肽在所述細(xì)胞中被表達(dá)。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括用包含SEQIDNO1的一個或多個調(diào)節(jié)區(qū)域的核酸轉(zhuǎn)染所述植物。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括用包含SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52中一種或多種的核酸轉(zhuǎn)染所述植物。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物的方法，該方法包括用可操縱地連接于一種異源基因的選自以下一組的核酸轉(zhuǎn)染所述植物SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52。圖1表示Xa31對水稻黃單胞菌水稻致病變種菌株P(guān)XO99在不同遺傳背景下的反應(yīng)。圖2表示在不同的發(fā)育階段，Xa31對水稻黃單胞菌水稻致病變種菌株P(guān)XO99和T7174的抗性。圖3表示Xa31-連鎖標(biāo)記AM1-TAIL和AM2-TAIL的圖譜。圖4A和4B表示Xa31基因座的遺傳和物理圖譜。圖5A和5B表示二元載體pC1300和在Xa31互補研究中構(gòu)建體插入物的重疊。圖6A和6B表示Xa31基因組克隆的重疊群。圖7表示T0代Xa31轉(zhuǎn)化體的表型。圖8表示T1代Xa31轉(zhuǎn)化體的表型。圖9表示Xa31基因的抗性(IBB31)和易感型(IR24)等位基因的TATA盒區(qū)域的啟動子的比較。本發(fā)明的實施方式詳述在一個實施方式中，本發(fā)明提供了編碼SEQIDNO5的多肽的分離的核酸。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種選自以下一組的分離的核酸SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的一種或多種核酸轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞，其中所述核酸在細(xì)胞中的存在為所述植物或細(xì)胞提供了對細(xì)菌性黑枯病的抗性。本發(fā)明證明了用如SEQIDNO1中所述的核酸轉(zhuǎn)染植物(或轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞并從其生長出植物)生成了對細(xì)菌性黑枯病具有抗性的植物。這些結(jié)果還證明了選自以下一組的一種或多種核酸的某些組合SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52，以及編碼SEQIDNO5的核酸，是賦予植物對細(xì)菌性黑枯病的抗性的原因。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)菌性黑枯病抗性的表型的表達(dá)的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51和SEQIDNO52中的一種或多種，且其中所述核酸可以任選地被可操縱地連接于一種編碼異源多肽的核酸。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其中所述載體包含一種編碼如本申請所述的多肽的核酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，異源蛋白或肽可以包括來自水稻或其它植物的R基因的蛋白質(zhì)或防御基因的蛋白質(zhì)。非限制性實例可以包括水稻細(xì)菌性黑枯病R蛋白Xa1、Xa2或防御蛋白例如來自水稻的PR1。一旦將核酸克隆到表達(dá)載體中，可以使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入植物細(xì)胞中。術(shù)語“植物細(xì)胞”意指包括任何衍生自植物包括未分化的組織例如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物，以及植物種子、花粉或植物胚芽的細(xì)胞。適于轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織、根組織、分裂組織、原生質(zhì)體、下胚軸、子葉、盾片、苗端、根、未成熟胚芽、花粉和花粉囊。一些可在轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞中應(yīng)用的方法的非限制性實例在以下被提供。一種多核苷酸或核酸如果處于其天然狀態(tài)，或當(dāng)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法被操縱時，被認(rèn)為“編碼”了一種多肽，其可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以生成mRNA和/或多肽或其片段。一種“分離的”或“基本純的”核酸(例如RNA、DNA或一種混合的聚合體)或多肽基本上分離自其它天然伴隨著天然的人類序列或蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分，例如核糖體、聚合酶、許多其它的基因組序列和蛋白質(zhì)。該術(shù)語包含已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境中被提取出的核酸序列或蛋白質(zhì)，并包括重組體或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。本發(fā)明預(yù)見了包含分離的Xa31核酸的核酸。如可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地理解的那樣，本發(fā)明的多核苷酸組合物包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式，并且可以進行化學(xué)或生物化學(xué)修飾或可以包含非天然的或衍生核苷堿基。這些修飾包括，例如，標(biāo)記、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾例如不帶電的連鍵(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電的連鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂部分(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素)螯合、烷基化和修飾性連鍵(例如，α端基異構(gòu)核酸等)。還包括合成分子，其模仿多肽通過氫鍵和其它化學(xué)作用與指定序列相結(jié)合的能力。一些分子是本領(lǐng)域中已知的，包括，例如在分子主鏈中肽鍵取代了磷酸鍵的分子。本發(fā)明的多核苷酸可以是分離的或基本純的。本發(fā)明提供了包含Xa31基因的重組核酸。該重組構(gòu)建體可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制?；蛘撸撝亟M構(gòu)建體可以被整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。這樣的重組多核苷酸包括基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，根據(jù)其來源或操縱，所述多核苷酸1)不與其在天然狀態(tài)下結(jié)合的多核苷酸的全部或部分結(jié)合；2)被連接到不同于其在天然狀態(tài)下連接的多核苷酸的多核苷酸上；或3)在自然界中不存在。因此，本發(fā)明提供了非天然存在的重組核酸。盡管可以使用所描述的序列，所述序列通常例如通過缺失、取代或插入被改變。本發(fā)明提供了野生型和突變體Xa31多肽或其片段的“蛋白質(zhì)修飾或片段”，其基本上與一級結(jié)構(gòu)序列同源，但其包括例如體內(nèi)或體外的化學(xué)和生化修飾或其摻入了稀有氨基酸。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地理解的那樣，這種修飾包括，例如，乙?；饔?、羧化作用、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化作用、標(biāo)記例如用放射性核素，和各種酶修飾。多種用于標(biāo)記多肽的方法和有益于這一目的的取代基或標(biāo)記為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，包括放射性同位素例如32P、與標(biāo)記的抗配體(例如抗體)結(jié)合的配體、熒光團、化學(xué)發(fā)光劑、酶和可用做標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對成員的抗配體。標(biāo)記的選擇取決于所需的靈敏度，與引物結(jié)合的容易程度、穩(wěn)定性要求和可利用的儀器。除基本全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還提供了所述多肽的生物學(xué)活性片段。重要的生物學(xué)活性包括配體結(jié)合、免疫學(xué)活性和蛋白質(zhì)的其它生物學(xué)活性特征。本文所用術(shù)語“多肽”指全長蛋白質(zhì)和作為多肽片段的該蛋白質(zhì)的一部分兩者。多肽“片段”、“部分”或“區(qū)段”是一段至少約5-7個連續(xù)氨基酸的氨基酸殘基，通常至少約7-9個連續(xù)氨基酸，典型地至少約9-13個連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選至少約20-30個或更多個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了融合多肽，其包含Xa31多肽及其片段和本領(lǐng)域中已知的其它蛋白質(zhì)的多肽或片段。同源多肽可以是兩個或兩個以上的多肽序列間的的融合體，或Xa31的序列與一相關(guān)的蛋白質(zhì)間的融合體。同樣地，可以構(gòu)建異源融合體，其將展示衍生蛋白質(zhì)的特性或活性的組合。例如，配體結(jié)合或其它結(jié)構(gòu)域可以在不同的新的融合多肽或片段之間“交換”。這種同源或異源融合多肽可以展示，例如，改變的結(jié)合強度或特異性，并且可以包括，例如配偶體如免疫球蛋白、細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-內(nèi)酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脫氫酶和酵母α交配因子。如下述，融合蛋白典型地將通過重組核酸方法制備，或可以被化學(xué)合成。用于合成多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。其它蛋白質(zhì)修飾包括氨基酸取代。取代突變體典型地包含在該蛋白質(zhì)內(nèi)的一個或多個位點有一個氨基酸互換為另一個氨基酸，并且可以被設(shè)計成調(diào)節(jié)該多肽的一個或多個特性，例如對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性，而不丟失其它功能或特性。氨基酸取代可以基于所涉及到的殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性特性上的相似性進行。優(yōu)選的取代是保守取代，即一個氨基酸被一個具有相似形狀和電荷的氨基酸所取代。保守取代是被領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并且典型地包括但不限于在以下基團中的取代甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸和酪氨酸、苯丙氨酸。某些氨基酸可以被蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸所取代而不產(chǎn)生可測量的與例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點或與多肽相互作用的蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點等結(jié)構(gòu)相互結(jié)合的能力的損失。由于是該相互作用的能力和蛋白質(zhì)的特性限定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性，可以在蛋白質(zhì)序列及其潛在的DNA編碼序列中進行某些氨基酸取代，仍然獲得了具有相似特性的蛋白質(zhì)。在進行這些改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。疏水氨基酸指數(shù)在賦予某一蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能方面的重要性在本領(lǐng)域中被普遍了解?；蛘撸愃瓢被岬娜〈梢曰谟H水性有效地進行。親水性在賦予某一蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能方面的重要性在本領(lǐng)域中被普遍了解(參見，例如US專利4,554,101)。疏水指數(shù)或親水性在設(shè)計多肽中的用途在US專利5,691,198中被進一步討論?！爸亟M核酸”是一種非天然存在的核酸，或一種通過將序列的兩個分離的區(qū)段通過人工結(jié)合而制備到的核酸。這一人工結(jié)合通常是通過化學(xué)合成或通過例如遺傳工程學(xué)技術(shù)對核酸的分離的區(qū)段進行人工操縱完成。這一短語還意指包括除去了其正常調(diào)節(jié)表達(dá)限制因子的基因，因為在這中情形中由于存在所述基因的多個拷貝或上調(diào)啟動子或增強信號，增加的mRNA或蛋白質(zhì)半衰期等等而使基因產(chǎn)物被過表達(dá)?！罢{(diào)節(jié)序列”指影響基因表達(dá)(包括基因的轉(zhuǎn)錄和信使RNA的翻譯、剪切、穩(wěn)定性等)的那些序列。本發(fā)明的大量多核苷酸可以通過用編碼突變體或野生型Xa31蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞而制備。編碼所述肽或所需片段的天然的或合成的多核苷酸片段可以被插入能夠?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞并在其中進行復(fù)制的重組多核苷酸構(gòu)建體(載體)通常為DNA結(jié)構(gòu)中。通常，所述載體將適于在單細(xì)胞宿主中例如酵母或細(xì)菌中進行復(fù)制，但是也可以用于導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物或植物或其它真核細(xì)胞系中(整合或不整合到基因組中)。最常用的原核宿主是大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株，不過也可以使用其它原核生物，例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。哺乳動物或其它真核宿主細(xì)胞，例如酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲，或兩棲動物或鳥類的細(xì)胞，也有益于制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。如在相關(guān)技術(shù)中所已知的那樣，調(diào)節(jié)多核苷酸表達(dá)可以導(dǎo)致對由所述多核苷酸所編碼的多肽的調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合的抗體。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，所述多肽可以被用做在動物中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的抗原，且所產(chǎn)生的抗體可用于篩選對本發(fā)明的多肽具有特異性的抗體。本發(fā)明還提供了多克隆和/或單克隆抗體及其片段，及其免疫結(jié)合等價物，其能與Xa31多肽及其片段或來自Xa31區(qū)域的多核苷酸序列特異性結(jié)合。術(shù)語“抗體”被用于指均質(zhì)分子實體，或一種混合物例如由眾多不同的分子實體構(gòu)成的血清制品?？梢栽陔暮铣蓛x中合成制備多肽，并將其連接到載體分子(例如匙孔血藍(lán)蛋白)上并在幾個月的時間內(nèi)將其注射到兔體內(nèi)。檢測兔血清對Xa31多肽或片段的免疫反應(yīng)性。可以通過用蛋白多肽、融合蛋白或其片段注射小鼠制備單克隆抗體。將通過ELISA對單克隆抗體進行篩選并檢測其與Xa31多肽的特異性免疫反應(yīng)性?？贵w也可以包含單鏈或多聚體重組抗體或其片段。載體將包括一種合適的啟動子和其它必需的在所選擇的宿主中有功能的載體序列。如在本領(lǐng)域中所熟知的那樣，其可以包括那些與Xa31核酸和蛋白表達(dá)天然相關(guān)的合適序列，且可以包括任選的或額外的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列被可操縱地連接于重組Xa31基因以控制Xa31基因表達(dá)。許多有用的載體在本領(lǐng)域中是已知的，且可以獲自例如Stratagene、NewEnglandBioLabs、PromegaBiotech以及其它廠商。啟動子例如trp、lac和噬菌體啟動子、tRNA啟動子和糖酵解酶啟動子可以被用于原核宿主中。有用的酵母啟動子包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶例如烯醇酶或甘油醛-3-磷酸脫氫酶、負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶等的啟動子區(qū)域。“可操縱地連接”是指一種并列，其中所描述的成分處于這樣一種關(guān)系中，即使得它們以所預(yù)期的方式起作用。例如，如果一種啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則所述啟動子被可操縱地連接于所述編碼序列。表達(dá)和克隆載體優(yōu)選含有選擇標(biāo)記基因。典型的標(biāo)記基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其a)賦予對抗生素或其它毒性物質(zhì)，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤等的抗性；b)補充營養(yǎng)缺陷；或c)補充不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵養(yǎng)分；例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。適當(dāng)?shù)恼_的可選擇標(biāo)記的選擇將取決于宿主細(xì)胞，不同宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。含有感興趣的核酸的載體可以在體外被轉(zhuǎn)錄，所得到的RNA通過眾所周知的方法例如通過注射被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，或者所述載體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所用方法根據(jù)細(xì)胞宿主的種類而不同，包括點穿孔，利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)進行轉(zhuǎn)染，微粒轟擊，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，感染(其中所述載體是一種感染性制劑，例如一種慢病毒基因組)，和其它的方法。通過本領(lǐng)域中已知的方法，尤其是上述的方法，將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中在本申請中將被稱為“轉(zhuǎn)化”。上述已經(jīng)導(dǎo)入了核酸的細(xì)胞還包括這些細(xì)胞的后代。使用標(biāo)記對克隆進行選擇，這取決于載體構(gòu)建的方式。所述標(biāo)記可以位于相同或不同的DNA分子上，優(yōu)選相同的DNA分子。在原核宿主中，可以例如通過對氨芐青霉素、四環(huán)素或其它抗生素的抗性對轉(zhuǎn)化體進行選擇。基于溫度敏感性的特定產(chǎn)物的制備也可以被用做合適的標(biāo)記。用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的原核或真核細(xì)胞不僅有用于制備本發(fā)明的核酸和多肽，而且還有用于例如研究Xa31多肽的特性。用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞還有用于生長表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的植物。本發(fā)明的核苷也可以被轉(zhuǎn)化到已經(jīng)經(jīng)歷了一定生長的植物中。植物表達(dá)載體可以包括(1)位于5′和3′調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的克隆的植物基因，和(2)顯性的選擇標(biāo)記。如果需要，這樣的植物表達(dá)載體也可以含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，賦予誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)型、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的區(qū)域)、轉(zhuǎn)錄起始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。也可以使用植物啟動子片段，這將指導(dǎo)Xa31在所產(chǎn)生的植物的所有組織中表達(dá)。這樣的啟動子在本申請中被稱做“組成型”啟動子，且在絕大多數(shù)環(huán)境條件下和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)具有活性。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、衍生自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA的1′-或2′-啟動子、遍在蛋白1啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US5,683,439)、Nos啟動子、pEmu啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)啟動子和GRP1-8啟動子?；蛘?，所述植物啟動子可以知道本發(fā)明的多核苷酸在特定組織中的表達(dá)或可以處于更精確的環(huán)境或發(fā)育控制下。這樣的啟動子在本申請中被稱為“誘導(dǎo)型”啟動子?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)型啟動子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原體攻擊、厭氧條件或光的存在。誘導(dǎo)型啟動子的例子有Adhl啟動子，其可以被缺氧或冷應(yīng)激誘導(dǎo)；Hsp70啟動子，其可以被熱應(yīng)激所誘導(dǎo)；和PPDK啟動子，其可以被光所誘導(dǎo)。處于發(fā)育控制下的啟動子的例子包括僅起始轉(zhuǎn)錄的啟動子，或在某些組織例如葉、根、果實、種子或花中優(yōu)先的啟動子。典型的啟動子包括花粉囊特異性啟動子5126(US專利5,689,049和5,689,051)、glob-1啟動子和γ-玉米蛋白啟動子。啟動子的操作可以根據(jù)其在基因組中的位置而不同。因此，誘導(dǎo)型啟動子在某些位置變成完全或部分組成型。異源和非異源(即內(nèi)源)啟動子都可以被用于指導(dǎo)Xa31基因的表達(dá)。這些啟動子也可以被用于，例如，重組表達(dá)盒中以促使反義核酸的表達(dá)降低、增加，或改變Xa31蛋白在所需組織中的濃度和/或組成。因此，在一些實施方式中，核酸構(gòu)建體將包含一個在植物細(xì)胞中，例如玉米(Zeamays)或煙草中，有功能的啟動子，其被可操縱地連接于到Xa31。在這些實施方式中有用的啟動子包括促進Xa31的表達(dá)的內(nèi)源啟動子。與電穿孔方法相類似的方法是在其中所需基因和原生質(zhì)體被混合，并用聚乙二醇(″PEG″)處理該混合物，從而將所述基因?qū)胨鲈|(zhì)體中。這一方法與電穿孔方法的區(qū)別在于用PEG替代了電脈沖(ZhangW.etal.，1988，Dattaetal.，1990和Christouetal.，1991)。其它方法包括1)用核酸培養(yǎng)種子或胚芽(TopferR.etal.，1989，Ledouxetal.，1974)，2)花粉管的處理(Luoetal.，1988)，3)脂質(zhì)體方法(Caboche，1990)和4)顯微注射方法(NeuhausG.etal.，1987)。用于從被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物的已知方法可以被用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。通常，外植體、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物可以被暴露于適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)環(huán)境(例如細(xì)胞分裂素和植物生長素)，因此新生的細(xì)胞可以分化并可以導(dǎo)致生成胚芽，所述胚芽然后再生成為根和莖。本發(fā)明通過以下非限制性實施例被進一步闡明。實施例實施例1賦予成體對多種Xoo菌株的抗性的疾病抗性基因Xa31由于含有Xa31基因的BC2后代是栽培水稻(O.sativaov)IR31917-45-3-2(IR31917)和野生水稻種小粒稻(O.minuta)Acc.101141(Amante-Bordeosetal.，1992)的種間雜種，使用重復(fù)回交從野生型水稻除去不需要的性狀。在戴維斯，加利福尼亞大學(xué)，從78-1-5BC2F3#169和IR24間的雜種選擇一株具有較少的不需要的農(nóng)藝性狀的高抗性植物作為花粉供體與易感型栽培種CO39雜交(結(jié)果未出版)。可能是由于在CO39或其它兩個在先前的回交中使用的栽培種(IR31917-45-3-2和IR24)中存在的其它干擾Xa31的遺傳因子，雜交后代中的疾病抗性存在很大的變化。為了簡化Xa31胚質(zhì)的遺傳背景，本申請發(fā)明人從后代中選擇抗性F3植物作為雄體分別與同時存在的易感型栽培種IR24和CO39回交。簡單地說，進行10代回交以將Xa31轉(zhuǎn)移到IR24遺傳背景中，BC10F3植物中的一株被指定為Xa31近等基因系IRBB31。同時，進行7代回交以將Xa31轉(zhuǎn)移到CO39遺傳背景中。對于Xa31基因座的遺傳圖譜，回交系的863株抗性植物(Xa31xa31)，來自隔離群體的1245株易感型植物(xa31xa31)和261株抗性植物(Xa31Xa31或Xa31xa31)被用于遺傳連鎖分析。在這一圖譜群體中總共分析了3875個配子。為了監(jiān)測在回交植物中Xa31基因的存在并確認(rèn)Xa31作為單獨的顯性基因座的遺傳特性，本申請發(fā)明人評估了各個世代的植物與Xoo菌株P(guān)XO99的疾病反應(yīng)。在一個試驗中分別檢測了IR24遺傳背景的BC2F1植物、208株抗性植物和253株易感型植物(1∶1分離，λ2＝0.019，p＞0.80，n＝1)。在另一個試驗中，觀察了IR24遺傳背景的BC10F2植物、232株抗性植物，并對47株易感型植物進行了評分(3∶1分離，λ2＝0.118，0.5＜P＜0.80，n＝1)。在后一個試驗中，本申請發(fā)明人檢測了所有具有兩個緊密連鎖的側(cè)翼標(biāo)記的植物的基因型?？剐灾参锏募兒献?Xa31Xa31)和雜合子(Xa31xa31)之間在損害長度上沒有差別，抗性植物的平均損害長度(Xa31Xa31或Xa31xa31)僅為0.30±0.2cm，而易感型植物(xa31xa31)的平均損害長度為23.8±5.8cm(圖1)。這兩個試驗的結(jié)果強有力地表明抗性是由一個單一的顯性基因座所控制，這與先前的研究相一致(Amante-Bordeosetal.1992)。為了檢查Xa31是否在CO39遺傳背景中顯示出相似的遺傳性能，用PXO99接種38株來自與CO39回交的BC7的BC7F2植物。3株Xa31純合子植物(Xa31Xa31)具有抗性(損害長度＝1.6±1.4cm)，而12株隱性純合子(xa31xa31)對PXO99是易感的(損害長度＝22.6±5.8cm)(圖1)。但是，23株雜合子(Xa31xa31)在疾病表型上與中等抗性(3.0cm＜損害長度≤6.0cm)合中等易感(6.0cm＜損害長度≤9.0cm)至完全易感(損害長度＞9.0cm)顯示出與巨大的差異。這些植物的平均損害長度為13.5±7.0cm(圖1)。盡管雜合子的平均損害長度顯示出他們對PXO99是易感的，本申請發(fā)明人仍然可以通過比較具有不同基因型的植物的平均損害長度而得出一個大體的結(jié)論，即Xa31賦予半顯性抗性或在CO39遺傳背景中對抗性顯示出劑量效應(yīng)。當(dāng)Xa31被用于標(biāo)記輔助育種程序時，Xa31作半顯性R基因的遺傳特性也在中國雜交水稻的5個親本系中被觀察到。這些結(jié)果表明當(dāng)植物的抗性基因座為雜合時，Xa31的表達(dá)可以被一些遺傳背景中的其它遺傳因子影響。圖1表示Xa31對水稻黃單胞菌水稻致病變種PXO99菌株在不同遺傳背景下的反應(yīng)。各植物的基因型通過Xa31側(cè)翼標(biāo)記M3623和3612EST2被檢測。標(biāo)準(zhǔn)差(SD)未標(biāo)出。首先用純合子BC2F3植物檢測Xa31在IR24遺傳背景下的抗性光譜(數(shù)據(jù)未顯示)，然后通過用收集自全世界11個國家的35株Xoo菌株進行接種IRBB31植物進行確認(rèn)。IRBB21，Xa21的近等基因系，在本研究中被用作疾病評估的抗性對照(Wangetal.1996)。表1概括了損害長度和疾病反應(yīng)的表型。簡單地說，在被檢測的35株Xoo菌株中，Xa31賦予對27株菌株的高水平抗性，和對3株菌株(HB17、JW89011和PXO71)的中等抗性，并顯示出對5株菌株(1947、C4、ZHE173、K202和2)易感。Xa31和Xa21共享被檢測的不相容菌株的絕大多數(shù)。Xa31賦予對A3842的抗性和對JW89011的中等抗性，而Xa21顯示出對這兩株菌株中等易感型或易感型表型。Xa31和Xa21都不賦予對非洲菌株1947的抗性。在絕大多數(shù)Xa31或Xa21與Xoo病原體的不相容反應(yīng)中，Xa31植物相對于Xa21植物損害長度更短。在本研究中所測定的Xa21的不相容反應(yīng)(表1中的R和MR)中觀察到的損害比在先前的研究中觀察到的損害更長(Wangetal.1996)，這可以被部分歸因于在本研究中所使用的更高的接種溫度(參見材料和方法)。菌株A3842和泰國2被檢測到與先前的研究中的Xa21不相容(Wangetal.1996)，但在本研究中是相容的。在絕大多數(shù)Xa31與Xoo菌株的不相容反應(yīng)中，在切割區(qū)域接種3-4天后觀察到褐色損害。褐色損害在顯示出高抗性表型、接種兩周后的平均損害長度小于0.5cm的那些葉子的感染部位更為明顯。針對病原體的褐變反應(yīng)也在Xa3與其不相容的Xoo菌株間的相互作用中被觀察到(KakuandOgawa，2000)。在Xa21與其不相容的Xoo菌株間相互作用的早期階段觀察到褐變反應(yīng)。Xa31和Xa21針對細(xì)菌的褐變反應(yīng)之間的區(qū)別表明這兩個基因的抗性機制可能在分子水平上不同和/或通過不同的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮功能。用兩個不同的Xoo菌株，PXO99和T7174，對Xa31在不同發(fā)育階段對細(xì)菌性黑枯病的反應(yīng)進行評估。PXO99是菲律賓小種6的一個代表性的菌株，而T7174是日本小種1的一個代表性的菌株(Songetal.1995；Yoshimuraetal.1998)。每周用細(xì)菌性黑枯病病原體接種IR24和IRBB31，從兩周齡植物開始直至7周齡植物。僅有主莖(從幼苗階段至活性分蘗階段)或各分蘗(活性分蘗階段后)的1-2個年幼的完全展開葉被選擇用于接種。從幼苗階段(4-5周之前)至成體植物，IR24對這兩株Xoo菌株高度易感(圖2)。但是，如果病原體是在孕穗期(8周后，在新加坡IR24的生活周期約為95天)后被接種到IR24植物上，則發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性黑枯病的發(fā)展程度降低了(數(shù)據(jù)未顯示)。IRBB31對這兩株Xoo菌株直至4周齡仍是易感的，盡管相對與IR24其具有更短的損害。IRBB31對細(xì)菌性黑枯病病原體的抗性在4周齡后急劇增加，并在5周齡達(dá)到幾乎完全抗性。因此，Xa31所賦予的抗性可以被發(fā)育調(diào)節(jié)，并且似乎是在植物生長的后期才被激活或誘導(dǎo)。在其它的研究中也觀察到了對細(xì)菌性黑枯病的抗性的發(fā)育調(diào)節(jié)(GoelandGupta1990；Ogawa1993；Centuryetal.1999)。分子研究也證明了Xa21基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)與Xa21疾病抗性的表達(dá)無關(guān)(Centuryetal.1999)。圖2表示Xa31在不同發(fā)育階段對水稻黃單胞菌水稻致病變種菌株P(guān)XO99和T7174的抗性。損害長度用平均數(shù)表示。不包括標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。反應(yīng)被標(biāo)出。表9顯示了OtDes6.1去飽和酶對多種脂肪酸的底物特異性。OtDes6.1的底物特異性在表達(dá)后和喂飼多種脂肪酸后測定。所喂飼的底物在全部轉(zhuǎn)基因酵母中可大量地檢測到。轉(zhuǎn)基因酵母顯示合成了作為OtDes6.1反應(yīng)產(chǎn)物的新脂肪酸(圖20)。這意味著功能性表達(dá)了基因OtDes6.1。用載體pYes2-OtDes6.1轉(zhuǎn)化的酵母于所述脂肪酸存在的基本培養(yǎng)基中生長。脂肪酸甲酯通過對完整細(xì)胞的酸甲醇分解作用合成。隨后這些FAME通過GLC分析。每個值表示為平均值(n＝3)±標(biāo)準(zhǔn)差?；钚允鞘褂霉降孜?(底物+產(chǎn)物)*100]計算的轉(zhuǎn)化率。表9表明OtDes6.1去飽和酶對油酸和亞油酸(18:2和18:3)具有底物特異性，原因在于這些脂肪酸引起了最高的活性。相反，對油酸(18:1)和棕櫚油酸(16:1)的活性基本不顯著。優(yōu)選轉(zhuǎn)化亞油酸和亞麻酸表明這種去飽和酶適合于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸。表9圖20表明OtDes6.1轉(zhuǎn)化了亞油酸。FAME通過氣相色譜分析。所喂飼的底物(C18:2)轉(zhuǎn)化為γ-C18:3。箭頭指示起始材料和形成的產(chǎn)物。圖21表明當(dāng)存在OtDes6.1時分別使亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生γ-亞麻酸(GLA)和硬脂艾杜糖酸(STA)(圖21A和C)。圖21還顯示當(dāng)Δ6去飽和酶OtDes6.1與來自展葉劍葉蘚的Δ6延伸酶PSE1(Zank等2002，PlantJ.31255-268)和來自三角褐指藻的Δ5去飽和酶PtD5(Domergue等2002，Eur.J.Biochem.269，4105-4113)共同存在時分別使亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生二高γ-亞麻酸(DHGLA)和花生四烯酸(ARA，圖21B)以及產(chǎn)生二高硬脂艾杜糖酸(DHSTA)和二十碳五烯酸(EPA，圖21D)。圖21清晰地表明當(dāng)存在Δ6延伸酶PSE1時幾乎定量地使Δ6去飽和酶OtDes6.1的反應(yīng)產(chǎn)物GLA和STA分別延伸以產(chǎn)生DHGLA和DHSTA。接下來由Δ5去飽和酶PtD5進行去飽和以分別產(chǎn)生ARA和EPA同樣是毫無困難的。大約25％-30％的延伸酶產(chǎn)物被去飽和(圖21B和D)。此處的表10為已克隆的Ostreococcus去飽和酶的概覽。實施例33從假矮海鏈藻中克隆去飽和酶基因在保守基序(His盒，參見基序)的輔助下搜索蛋白質(zhì)序列中的保守區(qū)域可在假矮海鏈藻序列數(shù)據(jù)庫(基因組序列)中鑒定六個具有相應(yīng)基序的序列。序列如下由于AM1和AM2都太短不能用做RFLP分析的探針，且AM2含有一些重復(fù)序列，本申請發(fā)明人于是使用TAIL-PCR來獲得兩個推定AFLP標(biāo)記的側(cè)翼序列。使用嵌套引物A1F3和任意的簡并引物AD3分離到了一個1059bp的DNA片段。該1059bp的片段在水稻基因組中僅有一個拷貝，當(dāng)用限制性酶HaeII或AvaI消化時在抗性等位基因和易感等位基因之間顯示出多態(tài)性。將該1059bp的片段命名為AM1-TAIL。類似地，使用嵌套引物A2F3和AD3擴增到了一個1238bp的DNA片段。但是，只有1081bp和1238bp的DNA片段在水稻基因組中顯示出拷貝。然后用引物AM2-TAIL-F和AM2-TAIL-R(表2)從TAIL-PCR產(chǎn)物擴增到被命名為AM2-TAIL的1081bp的DNA片段。當(dāng)用限制性酶SpeI或XbaI消化時，AM2-TAIL在抗性和易感等位基因之間顯示出多態(tài)性。通過對作圖群體中Xa31基因座的兩個標(biāo)記的遺傳連鎖分析測定AM1-TAIL或AM2-TAIL到Xa31的遺傳距離?？偟亩?，通過AM1-TAIL從由3875個配子組成的全部2369個個體鑒定到了12個重組體。AM1-TAIL和Xa31之間的遺傳距離為0.31cM(圖4B)。通過AM2-TAIL從由642個有用配子組成的354個個體鑒定到了7個重組體。同時，從20個RM2重組體獨立地鑒定到10個重組體。因此，在AM2-TAIL基因座獲得了17個重組體，AM2-TAIL和Xa31基因座之間的遺傳距離被估算為0.97cM(從1752(1110+642)個配子鑒定到17個重組體)(圖4B)。由于AM1-TAIL和AM2-TAIL兩者都能補償彼此全部重組體(數(shù)據(jù)未顯示)，這兩個標(biāo)記應(yīng)該在Xa31基因座的側(cè)翼(圖4B)。圖4A和圖4B顯示了高分辨遺傳圖譜以及在水稻染色體6的長臂上的Xa31的同線基因座的RGP(A)和在本研究中所產(chǎn)生的Xa31基因座(B)的BAC重疊群。相應(yīng)于其在水稻染色體6上的遺傳位置給出以cM計的遺傳距離。RGP的BAC序列的登錄號被標(biāo)記在每個BAC上。RGPBAC插入物的重疊沒有按規(guī)定比例繪制。遺傳圖譜中的重組體和配子的數(shù)目被標(biāo)注在每個標(biāo)記下。BAC出入物之間的重疊和每一BAC插入物的大小在B中是按規(guī)定比例繪制。垂直的虛線標(biāo)志著相應(yīng)標(biāo)記的相對位置。包含Xa31基因座的98kb區(qū)域被指出。實施例3將AM1-TAIL和AM2-TAIL整合到水稻連鎖圖譜中AM1-TAIL和AM2-TAIL被用于將Xa31繪制在水稻連鎖圖譜上。為了這一目的，將來自DH作圖群體的兩親本(IR64和Azucena)的基因組DNA(Huangetal.1994)用30種不同的限制性酶進行消化，并使用AM1-TAIL和AM2-TAIL作為RFLP探針進行印跡對多態(tài)性進行親本調(diào)查。兩個標(biāo)記對所檢測的30種限制性酶中的至少一種都顯示出可檢測的多態(tài)性。這兩個標(biāo)記被粗略地繪制在水稻染色體6的長臂上，標(biāo)記RG424和RG162之間，以AM1-TAIL為遠(yuǎn)側(cè)標(biāo)記，以AM2-TAIL為近側(cè)標(biāo)記(圖3)。AM1-TAIL和AM2-TAIL之間的遺傳距離為2.1cM(圖3)，其與獲自Xa31遺傳作圖群體的1.28cM(0.31cM+0.97cM)的遺傳距離(圖4B)相當(dāng)。RG424和AM2-TAIL之間的遺傳距離為34.4cM，AM1-TAIL和RG162之間的遺傳距離為12.0cM(圖3)。在康奈爾(Cornell)圖譜上，RG424(于染色體6上，70.4cM)和RG162(于染色體6上，104.6cM)之間的遺傳間隔為34.2cM，這基本上覆蓋了染色體6的長臂的一半(McCouchetal.2001)。圖3顯示了使用MAPMAKER2.0將與Xa31連鎖的標(biāo)記，AM1-TAIL和AM2-TAIL，繪制到水稻遺傳連鎖圖譜中(LanderetAl.，1987)。AM1-TAIL(箭頭標(biāo)記)和AM2-TAIL(箭頭標(biāo)記)被繪制到水稻染色體6上。該圖譜上的其它標(biāo)記是來自S.McCouch(康奈爾大學(xué))的RFLP標(biāo)記。左側(cè)的數(shù)字分別表示重組片段和遺傳距離(cM)。用3.0的LOD記分域值測定標(biāo)記最可能的圖譜順序，以Kosambi單位報道了所有的圖距(cM)。實施例4與Xa31連鎖的標(biāo)記在水稻基因組上的定位和精細(xì)遺傳作圖由于日本水稻(O.sativacv.Nipponbare)的染色體6的基因組序列可以從RGP站點獲得且AM1-TAIL和AM2-TAIL兩者在水稻基因組中都是單拷貝的，于是本申請發(fā)明人通過將這兩個標(biāo)記定位于水稻基因組序列上對Xa31基因座進行了精細(xì)作圖。首先，本申請發(fā)明人用這兩個標(biāo)記對水稻的未完成的高通量基因組序列(UnfinishedHighThroughputGenomicSequences，htgs)進行BLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html)。AM1-TAIL可以從染色體6找到RGPPAC克隆P0486H12的AP003615的序列(對于AM1-TAIL上的位置19-1026，相同性＝999/1008(99％))。AM2-TAIL挑出了AP004571(RGPPAC克隆P0652A05)、AP004372(MonsandoBAC克隆OJ1378_E04)、AP003941(MonsandoBAC克隆OJ111_E06)和AP003617(RGPPAC克隆P0502A05)(對于AM2-TAIL上的位置161-575，相同性＝412/416(99％)；對于AM2-TAIL上的位置589-1081，相同性＝462/494(93％))。序列分析表明后4個BAC或PAC克隆在染色體6上的AM2-TAIL基因座上重疊的克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。然后，本申請發(fā)明人從RGP站點下載了基因組序列以及AM1-TAIL和AM2-TAIL兩側(cè)的遺傳標(biāo)記。如圖4A中所示，產(chǎn)生了Xa31基因座的遺傳圖譜和物理BAC/PAC重疊群。在RGPBAC/PAC重疊群上介于AM1-TAIL和AM2-TAIL之間的物理大小為480kb。為了確認(rèn)該遺傳圖譜，選擇了一個RGP標(biāo)記，R674(由RGP的TSasaki饋贈)，用于連鎖分析。兩個作圖群體，一個含有32個抗性BC4F1個體，另一個含有37個抗性BC2F2個體(包括3個AM2-TAIL重組體)，被用于RFLP分析。雜交結(jié)果表明R674的與抗性相關(guān)的等位基因總是與抗性個體共分離，除與AM2-TAIL共享的3個重組體外。與RM2和AM2-TAIL重組體的連鎖分析也顯示有19個重組體被定位于R674基因座，其中17個重組體為與AM2-TAIL所共享，還有兩個交換體(重組體)存在于R674和AM2-TAIL之間的20kb(RGP物理距離)區(qū)域中。通過AM1-TAIL和AM2-TAIL鑒定到的重組體和介于它們之間的可獲得的RGP的基因組序列使得本申請發(fā)明人能夠基于RGP遺傳和物理圖譜對Xa31基因座進行更精細(xì)的遺傳和物理作圖。為了達(dá)到這些目標(biāo)，本申請發(fā)明人基于可從Genbank獲得的EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)信息和水稻基因組中該區(qū)域的獨特序列設(shè)計了標(biāo)記。從Nipponbare擴增到推定的標(biāo)記，并在Xa31親本中調(diào)查多態(tài)性。試用了超過30個推定的標(biāo)記，最終選擇了4個標(biāo)記和圖2中所示的引物用于Xa31的精細(xì)遺傳作圖。標(biāo)記3612EST2補償了12個AM1-TAIL重組體中的11個，M3623補償了17個AM2-TAIL重組體中的16個。通過RFLP分析對作圖群體進行篩選，本申請發(fā)明人進一步確認(rèn)了這兩個標(biāo)記被緊密地連接于Xa31。M3623是最近側(cè)的標(biāo)記，而3612EST2是最近的遠(yuǎn)側(cè)標(biāo)記，因為這兩個Xa31側(cè)翼標(biāo)記可以補償彼此的重組體。分別通過近側(cè)標(biāo)記M3623和遠(yuǎn)側(cè)標(biāo)記3612EST2，兩個重組體，24-2-2-943和24-10-3-2-147，被鑒定為離Xa31基因座最近(數(shù)據(jù)未顯示)。這兩個重組體最終分別通過兩個EST標(biāo)記3623EST1和3623EST3(表2)所補償，所述標(biāo)記定位在M3623和3612EST2之間的間隔中(圖4A)。與Xa31基因座最緊密連接的RGP標(biāo)記是近側(cè)標(biāo)記C12560S和遠(yuǎn)側(cè)標(biāo)記S12715，其側(cè)翼有0.9cM的遺傳間隔(圖4A)?？傊琗a31被作圖至到M3623和3612EST2之間的0.052cM(從3875個配子鑒定到2個重組體)的間隔，在該基因座具有強烈的重組抑制，且在Nipponbare的基因組上的該合成區(qū)域的物理大小為146kb。bNA，不可利用。RAPD或TAIL-PCR產(chǎn)物被克隆到pGEM-T載體中間，插入物被M13引物擴增并被用做RFLP探針。c除操縱子引物BE05外的DNA片段。d除AD3引物外的DNA片段。ePCR產(chǎn)物被用做RFLP探針。f用于篩選BAC文庫的探針。實施例5Xa31物理重疊群的產(chǎn)生、精細(xì)遺傳和物理作圖為了最終克隆Xa31基因，用50kb的平均插入物大小構(gòu)建了5x-水稻-基因組-覆蓋BAC文庫。為了生成用于BAC文庫篩選的新標(biāo)記，基于AP003623的RGP序列設(shè)計了推定的在水稻基因組中具有單拷貝的1184bp的DNA片段，稱為193M1(圖4)，并通過PCR從Nipponabre擴增。通過來自Xa31BAC文庫的191M1鑒定到3個BAC克隆，181F14(～120kb)、33M09(～37kb)和99N23(～34kb)。來自那些BAC克隆的插入物的BAC末端通過TAIL-PCR被分離(Liuetal.1998)。顯示33M09和99N23兩者的BAC指紋包含在181F14中，且那兩個BAC在進一步研究中被廢棄。為了在水稻染色體上步移，通過181F14F-末端鑒定到了5個BAC克隆，43L18、13O02、88K09、105N12和133J22；且只有一個克隆43L18被選擇BAC指紋后用于進一步的研究。在另一個篩選試驗中，EST標(biāo)記3623EST3(表2和圖4A)挑選了43L18和另一個BAC克隆109L05。因此，產(chǎn)生了含有181F14(～120kb)、43L18(116,495bp)和109L05(～120kb)的Xa31BAC插入物的重疊群(圖4B)。為了獲得更多的分子標(biāo)記，并在DNA水平上洞察Xa31基因座，通過Shotgun測序策略對43L18和部分109L05完全測序?？偣?，1,950,406bp的重疊DNA片段被測序，且它們被比對到包括來自43L18的1160,495bp的158,425bp共有序列中。為了進一步確認(rèn)Xa31基因定位于測序區(qū)域中。衍生自BAC末端和Short-gun克隆的分子標(biāo)記被用于與Xa31作圖群體的連鎖分析。通過位于Xa31基因座的近側(cè)的BAC末端標(biāo)記43L18-R從1640個配子中鑒定到3個重組體。通過位于Xa31基因座的遠(yuǎn)側(cè)的Short-gun標(biāo)記A1047從3875個配子中鑒定到10個重組體，且這10個重組體為AM1-TAIL所共享。通過BAC末端標(biāo)記43L18-F未從作圖群體鑒定到重組體。Short-gun標(biāo)記M3623+10K可以補償M3623唯一的重組體。Xa31基因座的分子標(biāo)記的物理排列示于圖4B中。在實施例4中，Xa31基因被作圖于M3623和3612EST2之間的間隔。在本研究中，所述間隔的物理大小被揭示為IRBB31中的98kb(圖4B)。實施例6Xa31基因組克隆的遺傳補償和分離對M3623和3612EST1之間的98kb間隔的基因預(yù)測表明在該間隔中存在10個推定的開放讀框(ORF)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，所述開放讀框中沒有讀框編碼具有富亮氨酸重復(fù)(LRR)的蛋白質(zhì)、核苷酸結(jié)合位點(NBS)和/或激酶受體結(jié)構(gòu)域這些在許多R蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域。因此，通過將Xa31的基因組克隆導(dǎo)入易感水稻品種例如Taipei309或Nipponbare中，并在轉(zhuǎn)基因植物中尋找抗性表型，Xa31基因的分離將依賴于遺傳補償。包含在BAC克隆43L18和109L05中的Xa31基因座的158,425bp基因組DNA被亞克隆到二元載體pC1300(CAMBIA)中(圖5A)用于Taipei309的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。制得了18個二元構(gòu)建體，并將其用于水稻轉(zhuǎn)化(圖5B)。在該結(jié)構(gòu)中的插入物的大小范圍為從10kb-25kb。插入物之間的重疊區(qū)域的大小范圍為從4Kb-12kb，平均大小為約8kb。在制備二元構(gòu)建體中，也考慮了用該158,425bp序列對水稻EST進行Blast搜索和基因預(yù)測的結(jié)果。一種經(jīng)改良的方法被用于通過農(nóng)桿菌制備轉(zhuǎn)基因植物(Yinetal.，2000)。根據(jù)Kaufmanetal(1997)所描述的方法評價轉(zhuǎn)化體對Xoo菌株對于PXO99的抗性。僅有健康且發(fā)育良好的轉(zhuǎn)基因植物被用于疾病評估。表3概述了用所述18個二元構(gòu)建體獲得的轉(zhuǎn)化體的疾病評估的結(jié)果。5個pC9913的轉(zhuǎn)化體、4個pC14615的轉(zhuǎn)化體和36個pC17561的轉(zhuǎn)化體顯示出對XooPXO99的抗性(R)或中等抗性(MR)(表3和圖7)。PC14615、pC9913和pC17561在重疊區(qū)域具有5198bp(SEQIDNO1)的24190bp的重疊群中擁有插入物(圖6A)。轉(zhuǎn)化體1-3的純合子T2轉(zhuǎn)基因植物被用于對不同的Xoo菌株的疾病評估。表5概述了用來自11個國家的Xoo菌株進行疾病評估的結(jié)果。Xa31轉(zhuǎn)基因賦予對31個Xoo菌株的高抗性和對3個Xoo菌株的中等抗性，并顯示出對一個Xoo菌株中等易感。非常有意思地發(fā)現(xiàn)Taipei309遺傳背景中的Xa31轉(zhuǎn)基因提供了對5株能感染于IR24遺傳背景中的IRBB31(Xa31Xa31)植物的Xa31相容性菌株(1947、C4、ZHE173、K202和2)增強的抗性。仍有待研究的由Taipei309遺傳背景中的Xa31轉(zhuǎn)基因所賦予的這一增強的抗性是否是由Xa31轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)，或其它存在于Taipei309中的可以特異性地修飾Xa31抗性的遺傳因子所導(dǎo)致。pC11909的60個獨立轉(zhuǎn)化體中僅有1個被測定在T0世代對PXO99具有抗性且該轉(zhuǎn)化體的抗性表型可以被遺傳到下一世代(T1)(數(shù)據(jù)未顯示)。由于pC11909中的插入物與所述5198bp片段(SEQIDNO1)沒有重疊區(qū)域，如果抗性基因型是由pC11909中擁有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的或抗性表型是由于T-DNA插入或組織培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的，則在Xa31基因座可能存在其它的功能性元件。對該轉(zhuǎn)化體的進一步的遺傳表征正在進行中。概而言之，在轉(zhuǎn)基因植物中的對Xa31表型的遺傳補償強有力地表明Xa31基因定位于所述3個亞克隆構(gòu)建體的插入物的5198bp(SEQIDNO1)重疊區(qū)域中。圖5A和5B顯示了二元載體pC1300和在Xa31補償研究中構(gòu)建體插入物的重疊。圖5A是具有限制性消化位點的二元載體pC1300(CAMBIA、堪培拉，澳大利亞)的圖。用合適的單一的或兩種限制性酶消化BAC43L18和109L05并將其亞克隆到pC1300的T-DNA的多克隆位點以生成用于經(jīng)農(nóng)桿菌AGL1.B轉(zhuǎn)化水稻的二元構(gòu)建體。亞克隆Xa31基因座的重疊群。通過Sequencher3.0所產(chǎn)生的插入物的重疊被按規(guī)定的比例顯示。包括了M3623、A1047和Xa31基因座的基因組DNA。圖6A顯示了在二元構(gòu)建體pC17561、pC14615、pC9913、pC7023和cDNA1中的插入物的重疊群。用表明轉(zhuǎn)錄的方向的箭頭指示cDNA片段。圖6B顯示了5198bp片段的限制性圖譜。長垂直線在該5198bp片段的側(cè)翼，垂直的虛線標(biāo)記了NsiI和AvrII的相對位置。兩個通過Sequencher3.0產(chǎn)生的圖譜都按規(guī)定的比例顯示。所有的R和MR轉(zhuǎn)化體含有至少一個拷貝的通過Southern分析所揭示的T-DNA插入(數(shù)據(jù)未顯示)。在T1和T2世代中確認(rèn)了pC9913的轉(zhuǎn)化體的抗性表型(表4和5，圖8)。為pC9913的亞克隆之一的另一構(gòu)建體pC7023也可以產(chǎn)生9株抗性T0植物(表3)。圖7顯示了T0世代的Xa31轉(zhuǎn)化體的表型。使用OD600的光密度為0.5的細(xì)菌懸浮液，用Xoo菌株P(guān)XO99接種8周齡的水稻植物。使用葉剪切方法接種單株植物的至少5片完全展開的葉(Kauffmanetal.1973)。被接種的植物被保持在溫室中，接種14天后測量損害長度(DAI)。Taipei309(pC1300)，用對照組二元載體pC1300轉(zhuǎn)基因的Taipei309的T0植物；1-3(pC9913)，用pC9913轉(zhuǎn)基因的Taipei309的T0植物；IRBB31，在IR24遺傳背景中的Xa31近等位基因系(NIL)；39(pC17561)，用pC17561轉(zhuǎn)基因的Taipei309的T0植物。圖8顯示了T1世代的Xa31轉(zhuǎn)化體的表型。使用OD600的光密度為0.5的細(xì)菌懸浮液，用Xoo菌株P(guān)XO99接種8周齡的水稻植物。使用葉剪切方法接種單株植物的至少5片完全展開的葉(Kauffmanetal.1973)。被接種的植物被保持在溫室中，接種14天后測量損害長度(DAI)。IRBB31，在IR24遺傳背景中的Xa31近等位基因系(NIL)；用對照組二元載體pC1300轉(zhuǎn)基因的Taipei309的T1植物；1-3/T1，用pC9913轉(zhuǎn)基因的Taipei309的T1植物。表3轉(zhuǎn)基因T0植物的疾病評估1用于補償研究的構(gòu)建體。2R，抗性，損害長度≤3.0cm；MR，中等抗性，3.0cm＜損害長度≤6.0cm；S，易感，損害長度＞9.0cm。3pC1300作為載體對照組被用于水稻轉(zhuǎn)化。4在T1和T2世代中確認(rèn)抗性表型。表4用XooPXO99接種的轉(zhuǎn)基因T1植物的表型1R，抗性，損害長度＜3.0cm。2MR，中等抗性，3.0cm＜損害長度≤6.0cm。3S，易感，損害長度＞9.0cm。表5在轉(zhuǎn)基因植物中賦予對多種Xoo菌株的抗性的Xa31基因a用水稻黃單胞菌水稻致病變種接種6周齡植物。對于每一菌株，至少接種來自4個個體植物的16片葉。損害長度為16片被感染葉的平均值。平均值的標(biāo)準(zhǔn)差被標(biāo)出。b轉(zhuǎn)化體1-3的純合子轉(zhuǎn)基因T3植物被用于疾病評估。c損害長度(cm)。d標(biāo)準(zhǔn)差。eR，抗性，0cm≤損害長度≤3.0cm；MR，中等抗性，3.0cm＜損害長度≤6.0cm；MS，中等易感，6.0cm＜損害長度≤9.0cmS；S，易感，損害長度＞9.0cm。實施例7Xa31候選基因的cDNA克隆的分離和相應(yīng)的來自IR24的Xa31的隱性等位基因的分離為了分離Xa31候選基因的cDNA，制備了Xa31cDNA文庫用于從實施例6的5198bp的片段(SEQIDNO1)篩選表達(dá)基因。在IR24中，Xa31的隱性等位基因的基因組克隆也通過使用衍生自抗性等位基因的序列的引物進行PCR而被分離。PCR產(chǎn)物的DNA序列比對顯示從敏感型菌株IR24分離到了一個5131bp(SEQIDNO2)的重疊群。這一5131bp的基因組克隆對應(yīng)于幾乎全長的來自IRBB31的5198bp(SEQIDNO1)的片段。為了進一步分離Xa31cDNA克隆，將所述5198bp的片段的亞克隆用做探針對Xa31cDNA文庫進行篩選。從該cDNA文庫分離到了一個帶有20-nt的poly(A)的343bp的部分cDNA。為了獲得全長的cDNA序列，通過5′-RACE從Xa31轉(zhuǎn)基因植物分離到了一個363bp的cDNA片段。該363bp的cDNA片段含有一個與543bp的poly(A)cDNA重疊的313bp的區(qū)域。因此，推定的全長cDNA1為593bp(SEQIDNO3)，其通過3′-RACE對全長cDNA1的擴增進行確認(rèn)(表6和7)。比較cDNA1與其基因組克隆，在轉(zhuǎn)錄區(qū)中沒有觀察到內(nèi)含子。在cDNA1中僅存在1個推定的ORF，其編碼一種具有113個氨基酸的多肽(SEQIDNO5)。通過5′和3′RACE從IR24分離衍生自Xa31隱性等位基因的cDNA1的同源物，cDNA3(SEQIDNO4)(表6和7)。cDNA1和cDNA3幾乎完全相同，除cDNA1較cDNA3具有更長的polyA尾巴外。使用cDNA1(SEQIDNO3)的dsDNA作為探針進行的Northern分析表明在Xa31基因座的轉(zhuǎn)錄物(cDNA1或cDNA3)在不用Xoo病原體接種的IRBB31和IR24中都是檢測不到的(數(shù)據(jù)未顯示)?？梢栽贗RBB31和IR24兩者中檢測到3個3DPI的痕量的轉(zhuǎn)錄物，幾乎沒有差別(數(shù)據(jù)未顯示)。通過篩選cDNA文庫以及進行5′或3′RACE來分離cDNA的努力未能在該5198bp(SEQIDNO1)的基因組區(qū)域內(nèi)鑒定到除cDNA1(SEQIDNO3)外的任何其它的表達(dá)區(qū)域。BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/indcx.html)搜索表明在所述113個氨基酸(SEQIDNO5)內(nèi)沒有檢測到推定的保守結(jié)構(gòu)域。所發(fā)現(xiàn)的僅有的相似性是SEQIDNO5的113個氨基酸的序列在其C-末端(62-113)顯示出與大鼠或人神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)換酶1(NEC1)前體(EC3.4.21.93)的信號和前肽區(qū)域有36.8％或38.2％的相同性(數(shù)據(jù)未顯示)。Xa31基因的IRBB31(抗性)和IR24(易感)等位基因的轉(zhuǎn)錄物是相同的。但是，在5′調(diào)節(jié)區(qū)觀察到了兩個等位基因(SEQIDNO49、SEQIDNO51和圖9)間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的差異和缺失。在IR24等位基因的啟動子中的推定的TATA盒的20bp上游鑒定到了兩個25bp的串聯(lián)重復(fù)，但僅在IRBB31等位基因的該區(qū)域發(fā)現(xiàn)該25bp元件的一個拷貝。此外，如果與IRBB31等位基因相比較，在IR24等位基因的推定的TATA盒的3′端檢測到3個核苷酸的缺失。GFP標(biāo)簽研究表明IRBB31和IR24等位基因的功能性末端是相同的(SEQIDNO49和SEQIDNO51)(數(shù)據(jù)未顯示)。圖9顯示了在Xa31候選基因(部分)的(IBB31)抗性和(IR24)易感等位基因的TATA盒區(qū)域的啟動子的比較。摻入缺口(用″-″表示)以得到兩個序列的最大比對。序列下的圓點表示在IRBB31和IR24等位基因間的差異。轉(zhuǎn)錄的起始位點在序列下被標(biāo)記為+1。113個氨基酸的第一個密碼子用黑體標(biāo)示。第一個25bp重復(fù)用斜體的大寫字母突出，第二個25bp重復(fù)用斜體小寫字母表示。推定的TATA盒被下劃線標(biāo)出?？傊?，所述5198bp的基因組克隆(SEQIDNO1)、cDNA1(SEQID<p>表18.用官能化srPP和增粘劑配制的粘合劑的對Mylar的粘合力E-5380是ESCOREZ5380，它是具有大約85℃的環(huán)球軟化點的氫化二環(huán)戊二烯型烴樹脂，可從德克薩斯州休斯頓的ExxonMobilChemicalCo.購得。表19.對Mylar和聚丙烯表面(iPP)的粘合力Xoo菌株和細(xì)菌黑枯病接種Xoo菌株C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CAAS)的QiZhang饋贈。其它在本研究中所使用的Xoo分離物由堪薩斯州立大學(xué)的J.E.Lech饋贈。用Kauffmanetal(1973)所描述的葉剪切方法進行細(xì)菌黑枯病接種。簡單地說，Xoo菌株被生長在PSA培養(yǎng)基(10g/l蛋白胨、10g/l蔗糖、1g/l谷氨酸、16g/l細(xì)菌用瓊脂，pH7.0)中2-3天。以O(shè)D600為0.5的光密度，將細(xì)菌細(xì)胞懸浮在滅菌水中。通過使用被浸泡在接種體中的剪刀從葉的頂部剪切5-6cm，將該細(xì)菌細(xì)胞懸浮液施用給每一分蘗的兩片最嫩的完全展開的葉。接種后兩周測量損害長度(LL)。疾病癥狀被歸類為抗性(R，LL≤3.0cm)、中等抗性(MR，3.0cm＜LL≤6.0cm)、中等易感(MS，6.0cm＜LL≤9.0cm)和易感(S，LL＞9.0cm)(Amante-Bordeosetal.1992)。DNA提取和Southern雜交從如Dellaportaetal(1984)所描述的嫩葉提取水稻基因組DNA。用一種適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶s2μg的水稻DNA，并通過電泳在0.65-0.8％的瓊脂糖凝膠中分級。使用標(biāo)準(zhǔn)的程序(Sambrooketal，1989)進行Southern雜交。用AmershamBiosciences的RediprimeTMII進行探針標(biāo)記和信號檢測?！皣?yán)格雜交條件”是指(1)使用低離子強度和用于洗滌的高溫，例如于50℃，0.015MNaCl/0.0015Msodiumtatratc/0.1％十二烷基硫酸鈉，或(2)在雜交過程中使用變性劑如甲酰胺，例如于42℃使用50％(v/v)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH6.5)，與750mMNaCl、75mM檸檬酸鈉。另一個例子是于42℃使用50％甲酰胺、5×SC(0.75MNaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt’s溶液、超聲波降解的鮭精DNA(50mug/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸鹽；于42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。或者，“嚴(yán)格雜交條件”是指其中與R.anatipestiferOmpA基因具有超過約80％的同源性，優(yōu)選超過約90％的同源性，最優(yōu)選超過約95％的同源性的核酸將與該基因雜交的條件。所述核酸可以被標(biāo)記，例如，使用上述任何一類型的標(biāo)記，或任選地可以使用與檢測核酸相結(jié)合的標(biāo)記的報道核酸。此外，可以使用本領(lǐng)域中已知的其它標(biāo)記技術(shù)。隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)分析分別選擇來自IR24遺傳背景的Xa31分離群體的10株抗性F2植物和10株易感F2植物制備抗性池和易感池用于批量隔離分析(bulksegregantanalysis，BSA)(Michelmoreetal.1991)。將來自每一個體植物的等量的基因組DNA(10ng/μl)混合形成池。約10ng的池DNA被用于各RAPD(Williamsetal.1990)反應(yīng)。由操縱子技術(shù)(Alameda，Calif.)獲得隨機引物。按以下溫度溫育該反應(yīng)混合物94℃，120秒；繼以40個循環(huán)的94℃，60秒；37℃，45秒；和72℃，90秒。在72℃溫育5分鐘后終止PCR。約0.1μl的[32P-α]dCTP(3000Ci/mmol，AmershamBiosciences)被添加到各個反應(yīng)混合物中用于標(biāo)記PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物變性，然后使用來自Bio-Rad(Hercules，Calif.)的Sequi-Gen測序細(xì)胞在4.5％的聚丙烯酰胺凝膠上進行分離。將干燥的凝膠在BiomaxXR膠卷(EastmanKodak，Rochester，NY)上曝光2-3天。用包括在所述池中的20個單獨的DNA樣本進一步檢測揭示池間的多態(tài)性的引物。來自小粒稻Acc.101141、IR31917-45-3-2和CO39的DNA樣本也被進行單獨的RAPD分析測試。擴增限制性片段多肽(AFLP)分析來自4組植物的DNA樣本被用于AFLP(Vosetal.1995)分析。組R1和S1由來自CO39遺傳背景中的F2分離群的18株抗性或易感個體植物組成。組R2和S2含有來自IR24遺傳背景中的6個RM2(RAPDmaker2，也參見結(jié)構(gòu)部分)重組分離群的18株抗性或易感植物。根據(jù)AFLPTM分析系統(tǒng)II的指導(dǎo)手冊和AFLP小基因組引物試劑盒(GIBCOBRL)進行AFLP分析。通過使用E-0/M+C引物對獲得了AFLP預(yù)擴增產(chǎn)物。為了選擇性擴增，[32P-γ]ATP標(biāo)記的EcoRI引物與MseI引物被聯(lián)合利用。全部64對EcoRI和MseI引物的組合被用于篩選所述4組的個體植物間的多態(tài)性。將擴增到的DNA片段變性，然后使用來自Bio-Rad的Sequi-Gen測序細(xì)胞在4.5％的聚丙烯酰胺凝膠上進行分離。干燥的凝膠在BiomaxXR膠卷上曝光2-3天。熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)根據(jù)Liuetal(1995)進行TAIL-PCR，并進行一個小的修飾，即在次反應(yīng)中進行15個超旋回，在三級反應(yīng)中進行30個嚴(yán)格性降低的循環(huán)。任意簡并引物是AD1，NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT(SEQIDNO31)；AD2，NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA(SEQIDNO32)；AD3，(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA(SEQIDNO33)；AD4，NGTA(G/C)A(G/C)(A/T)GTNA(A/T)CAA(SEQIDNO34)；AD5，AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG(SEQIDNO35)；AD6，(G/C)TTGNTA(G/C)TNCTNTGC(SEQIDNO36)。BAG載體上的嵌套引物為BACF1，ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(SEQIDNO37)；BACF2，GTAATACGACTCACTATAGGGCGA(SEQIDNO38)；BACF3，GAGTCGACCTGCAGGCATGCA(SEQIDNO39)；BACR1，CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG(SEQIDNO40)；BACR2，GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA(SEQIDNO41)；BACR3，TTAGGTGAGACTATAGAATACTCA(SEQIDNO42)(Liuetal.1998)。用于AM1-TAIL的嵌套引物為A1F1(5’TAACAACATGAGAATTACTAATCCG3’)(SEQIDNO43)、A1F2(5’CATGTATCCAAGTTCGTAGCTAG3’)(SEQIDNO44)和A1F3(5’TTGGTTTTTTTGAATGAAGGGTATAT3’)(SEQIDNO45)；用于AM1-TAIL的嵌套引物為A2F1(5’AATTCATGCCCACAAGTACAGTAC3’)(SEQIDNO46)、A2F2(5’CTGAAACACAGGAAAAATCCCGTT3’)(SEQIDNO47)和A2F3(5’TGCATAGGCCCTGTTTAGTTCTAA3’)(SEQIDNO48)。Xa31連鎖標(biāo)記在水稻連鎖圖譜上的作圖將一個標(biāo)準(zhǔn)的作圖群體用于Xa31連鎖標(biāo)記在水稻遺傳連鎖圖譜上的作圖。該群體由111個從印度品種IR64和日本品種Azucena間的雜種發(fā)育而來的雙倍體(DH)品系組成(Huangetal，1994)。在DH作圖群體中構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜含有271個DNA標(biāo)記。使用Mapmaker程序(Macintoshversion2.0)測定在本研究中所鑒定到的標(biāo)記的連鎖群或染色體定位(Landeretal.1987)。用3.0的LOD記分域值測定標(biāo)記最可能的圖譜順序，以Kosambi單位報道了所有的圖距(cM)。BAC文庫構(gòu)建根據(jù)Wang，etal.，(1995).ConstructionofaricebacterialartificialchromosomelibraryandidentificationofcloneslinkedtotheXa-21diseaseresistancelocus.ThePlantJ7525-533.中所詳述的方案構(gòu)建Xa31的細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫。簡單地說，將Xa31純合子植物(IR24BC2F2-13-552(Xa31/Xa31))在溫室中生長7-10天。高分子量(HMW)核DNA被分離并被埋植到低熔點瓊脂糖栓塞中用于通過HindIII進行部分消化。然后使用脈沖電場凝膠電泳(PFGE)裝置(CHEFMapperII，Bio-Rad)對部分消化的HMWDNA進行大小分級。通過從低熔點瓊脂糖凝膠進行電洗脫(Strongetal.，1997)回收大小分級的DNA(100-300kb)，并將其連接到經(jīng)HindIII消化并去磷酸化的BAC載體pIndigoBAC-5上(EPICENTRE，Madison，WI53713，USA)。用Cell-Porator系統(tǒng)(GIBCO-BRL)將連接混合物經(jīng)電穿孔進入大腸桿菌DH10B細(xì)胞中。人工挑選BAC克隆，并將其排列在每孔中有60μl冷凍培養(yǎng)基的384孔平板中。于37℃培養(yǎng)BAC克隆14-16小時，并儲存于-80℃冰箱中。該BAC文庫由約50,000個克隆組成，所述克隆具有大小范圍在30-150kb、平均大小為50kb的插入物。這一文庫的范圍至少相當(dāng)于水稻基因組的5倍。BACDNA的測序使用shotgun方法對BAC質(zhì)粒測序。通過在0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳純化BACDNA，并通過電洗脫進行回收(Strongetal.，1997)。通過超聲波降解對純化的DNA進行剪切，然后在1％的瓊脂糖凝膠中進行分級。使用凝膠提取試劑盒(QIAGEN)回收大小分級的DNA(1-1.5kb)。通過T4DNA聚合酶和大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段對DNA片段的末端進行修飾。將被修飾的DNA片段克隆到pBluescriptKS(+)(Stratagene)的EcoRV位點以生成shotgun文庫。使用ABIPrismdRhodamineTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，USA)和帶有制造商提供的數(shù)據(jù)采集軟件(PEAppliedBiosystem)的ABIPrism310遺傳分析儀，用具有M13正向和反向引物的插入物的兩末端對Shotgun質(zhì)粒進行測序。DNA序列分析可公開獲得的日本水稻的BAC(細(xì)菌人工染色體)或PAC(P1人工染色體，Babaetal.2000)序列是自水稻基因組序列計劃(RGP)站點(http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/stattable.pl？chr＝6&lab＝RGP)以及其它可利用的基因數(shù)據(jù)庫中下載的。將DNA序列進行比對并使用Sequencher3.0程序進行分析。序列比對使用PairwiseBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12sea/b12.html)進行。CDNA文庫構(gòu)建為了獲得病原體誘導(dǎo)的以及組成型mRNA，用菲律賓Xoo菌株P(guān)XO99接種含有純合Xa31基因的6周齡植物。在接種后第1、3、5和7天(DAI)采集3克5cm葉尖，并用TRIZOL試劑(GIBCOBRL)建池用于RNA分離。用來自STRATAGENE的Uni-ZApXR插入載體和試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。該cDNA文庫含有5.2×106pu。cDNA末端的快速擴增(RACE)總RNA從用TRIZOL試劑(GIBCOBRL)接種6天后(6DAI)的IRBB31、IR24和Xa31轉(zhuǎn)基因植物的葉組織分離。5’和3’的cDNA末端的快速擴增都用獲自CLONTECH的SMARTTMRACEcDNA擴增試劑盒進行。用于第一鏈cDNA合成、5’RACE和3’RACE、以及嵌合PCR(使用5’RACE或3’RACE產(chǎn)物作為模板進行第二輪PCR)的引物列于表6和表7中。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Taipei309或Nipponbare的轉(zhuǎn)化根據(jù)如Yinetal.(2000)所描述的方法進行。簡單地說，將旺盛生長的衍生自成熟胚芽的盾片的成胚愈傷組織與隱藏了二元構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)菌株AGL1共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后，于26℃，將水稻組織在含有250mg/l頭孢噻肟、200mg/l氨芐青霉素、2mg/l2，4-D和50mg/l潮霉素的NB0培養(yǎng)基中于黑暗中培養(yǎng)3-4周。在新鮮的選擇培養(yǎng)基上對潮霉素抗性愈傷組織進行亞克隆2周，然后將其轉(zhuǎn)移到含有1mg/l6-BA、2mg/lNAA、5mg/lABA和50mg/l潮霉素的NB0培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。簡單地，顯示出潮霉素抗性的白色成胚愈傷組織被轉(zhuǎn)移到含有2mg/l6-BA、1mg/lIAA、1mg/lNAA、1mg/lKT和50mg/l潮霉素的NB0培養(yǎng)基中；并于26℃，以14小時光照(約2000lux)和10小時黑暗的周期再生。再生的植物隨后被移植到罐中的土壤中，并在溫室中生長。參考文獻(xiàn)Amante-BordeosA，SitchLA，NelsonR，DalmacioRD，OlivaNP，AswidinnoorH，LeungH(1992)TransferofbacterialblightandblastresistancefromthetetraploidwildriceOryzaminutatocultivatedrice，Oryzasativa.TheorApplGenet84345-354.BabaT，KatagiriS，TanoueH，TanakaR，ChidenY，SajiS，HamadaM，NakashimaM，OkamotoM，HayashiM，YoshikiS，KarasawaW，HondaM，IchikawaY，AritaK，IkenoM，OhtaT，UmeharaY，MatsumotoT，deJongPJ，SasakiT(2000)ConstructionandCharacterizationofRiceGenomicLibrariesPACLibraryofJaponicaVariety，NipponbareandBACLibraryofIndicaVariety，Kasalath.BulletinoftheNIAR1441-49.BryanGT，WuKS，F(xiàn)arrallL，JiaY，HersheyHP，McAdamsSA，F(xiàn)aulkKN，DonaldsonGK，TarchiniR，ValentB(2000)AsingleaminoaciddifferencedistinguishesresistantandsusceptibleallelesofthericeblastresistancegenePi-ta.PlantCell122033-2045.CenturyKS，LagmanRA，AdkissonM.MorlanJ，TobiasR，SchwartzK，SmithA，LoveJ，RonaldPC，WhalenMC(1999)ShortcommunicationdevelopmentalcontrolofXa21-mediateddiseaseresistanceinrice.PlantJ20231-236.GaoDY，XuZG，ChenZY，SunLH，SunQM，LuF，HuBS，LiuYF，TangLH(2001)IdentificationofanewgeneforresistancetobacterialblightinasomaclonalmutantHX-3(indica).RiceGenetNewslett1866-68.DanglJ，JonesJDG(2001)Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection.Nature411826-833.DellaportaS，WoodJ，HicksJ(1984)MaizeDNAminiprepInRussellM(Ed)Molecularbiologyofplantsalaboratorycoursemanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，pp36-37.FlorHH(1971)Currentstatusofthegene-for-geneconcept.AnnuRevPhytopathol9275-96.GoelRK，GuptaAK(1990)HostageinrelationtoresistanceinricetobacterialblightcausedbyXanthomonascampestrispv.oryzae.TropA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